Structures bactériennes rectangulaires précédemment non caractérisées dans la bouche du dauphin

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 2098 (2023) Citer cet article

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Il reste beaucoup à explorer en ce qui concerne la diversité des microbes non cultivés associés à l'hôte. Ici, nous décrivons des structures bactériennes rectangulaires (RBS) dans la bouche des grands dauphins. La coloration de l'ADN a révélé plusieurs bandes appariées dans les RBS, suggérant la présence de cellules se divisant le long de l'axe longitudinal. La microscopie électronique à transmission cryogénique et la tomographie ont montré des segments parallèles liés à la membrane qui sont probablement des cellules, encapsulés par un revêtement de surface périodique semblable à une couche S. Les RBS affichaient des appendices inhabituels en forme de pilus avec des faisceaux de fils évasés aux extrémités. Nous présentons plusieurs sources de données, y compris le séquençage de l'ADN génomique des RBS micromanipulés, le séquençage du gène de l'ARNr 16S et l'hybridation in situ par fluorescence, suggérant que les RBS sont bactériens et distincts des genres Simonsiella et Conchiformibius (famille des Neisseriaceae), avec lesquels ils partagent une morphologie similaire et la structuration des divisions. Nos résultats mettent en évidence la diversité des nouvelles formes microbiennes et des modes de vie qui attendent d'être caractérisés à l'aide d'outils complémentaires à la génomique tels que la microscopie.

Les premières descriptions du monde microbien étaient centrées sur la morphologie et les schémas de motilité des « animalcules »1. Au cours des siècles qui ont suivi la découverte révolutionnaire de van Leeuwenhoek, une grande diversité de formes microbiennes a été décrite, allant des bactéries en forme d'étoile du genre Stella2,3 aux fructifications multicellulaires caractéristiques de l'ordre des Myxobacterales4,5. La morphologie est une caractéristique biologiquement importante, souvent hautement conservée et façonnée au fil du temps par des pressions sélectives résultant du mode de vie et du contexte environnemental d'un organisme6. En effet, la morphologie cellulaire joue un rôle important dans la motilité, l'acquisition des nutriments, la division cellulaire et les interactions avec d'autres cellules, y compris les symbioses avec les hôtes, qui sont tous de puissants déterminants de la survie7. En tant que telles, les études morphologiques et structurelles offrent une voie intéressante pour mieux comprendre les formes de vie microbiennes et les mécanismes par lesquels les espèces fonctionnent et affectent leur environnement. De plus, la caractérisation des structures et des fonctions de la gamme diversifiée de microbes dans les branches inexplorées de l'arbre de la vie offre une opportunité d'élargir notre compréhension de l'évolution et peut aboutir à une myriade d'applications en biotechnologie et en médecine, illustrées par le développement de l'optogénétique8 et du CRISPR- l'édition de gènes basée sur9.

La génomique sert de lentille puissante à travers laquelle décrire le monde microbien. Ces dernières années, les analyses métagénomiques et génomiques unicellulaires ont considérablement augmenté le nombre de lignées microbiennes connues au niveau du phylum par un facteur de près de quatre dans le domaine bactérien10,11,12,13. Le séquençage des génomes d'organismes nouvellement découverts a conduit à la découverte de nouveaux systèmes fonctionnels, types de variants protéiques et modes de vie11,14,15,16,17, illustrant la corrélation entre la diversité phylogénétique et le potentiel fonctionnel18. Cependant, l'applicabilité de ces approches est principalement limitée aux protéines et aux systèmes de régulation homologues à ceux d'organismes bien caractérisés ; la prédiction de phénotypes et de fonctions véritablement nouveaux et/ou dont la base génétique est inconnue nécessite généralement des connaissances complémentaires. Compte tenu de la réticence de la plupart des espèces microbiennes sur Terre à la culture en laboratoire (en 2016, 72 % des lignées au niveau de l'embranchement n'avaient aucun représentant cultivé)19, les méthodes qui ne nécessitent pas d'isolats cultivés, comme la microscopie, offrent une voie complémentaire attrayante en pour étudier de nouvelles propriétés morphologiques et fonctionnelles de lignées non cultivées. Par exemple, les progrès récents de la microscopie électronique cryogénique (cryoEM) et de la tomographie (cryoET) ont permis l'imagerie tridimensionnelle (3D) de cellules bactériennes intactes à une résolution de quelques nanomètres20, conduisant à des avancées importantes dans la découverte et la caractérisation de nouveaux microbes. structures21,22. À l'heure actuelle, notre connaissance de la biologie cellulaire a été largement limitée à l'observation et à l'expérimentation sur des bactéries qui peuvent être cultivées, et il existe donc un biais important dans notre compréhension envers les organismes propices à la croissance dans des conditions de laboratoire. L'utilisation de la microscopie et de techniques non basées sur le séquençage pour étudier "la majorité non cultivée" sera essentielle pour caractériser toute la diversité des modes de vie bactériens qui ont évolué, en particulier les efforts de caractérisation des bactéries dans des environnements relativement peu étudiés, tels que la cavité buccale du nez en bouteille. dauphins (Tursiops truncatus), qui hébergent une riche collection de nouveaux microbes et un potentiel fonctionnel16,23.

Malgré la diversité des formes de cellules microbiennes, les structures rectangulaires sont rares, avec une base génétique mal comprise. De telles structures sont de deux types : des cellules individuelles qui sont rectangulaires et des agrégats de cellules qui forment des rectangles. À notre connaissance, la découverte de cellules rectangulaires non eucaryotes a jusqu'à présent été limitée à la famille des Halobacteriaceae, qui se compose d'Archaea halophiles. Les cellules rectangulaires connues de cette famille comprennent Haloquadratum walsbyi24, Haloarcula quadrata25 et les membres du genre pléomorphe Natronrubrum26. Une fission à base de FtsZ a récemment été observée chez le symbiote nématode en forme de cube Candidatus Thiosymbion cuboideus27 et des cellules rectangulaires supplémentaires supposées être bactériennes ou archées ont été découvertes dans des environnements à haute salinité mais non identifiées taxonomiquement28. Parmi les micro-organismes eucaryotes, les diatomées peuvent avoir un aspect rectangulaire lorsqu'elles sont visualisées en deux dimensions, bien que ces cellules soient des prismes cylindriques plutôt que rectangulaires29. Une variété de bactéries forment des amas de cellules rectangulaires, tels que des feuilles de bactéries coccoïdes (par exemple, Thiopedia rosea et le genre Merismopedia30), des structures cuboïdes de bactéries coccoïdes (par exemple, les genres Sarcina et Eucapsis30) et des trichomes rectangulaires formés par des bactéries en forme de disque (par exemple, Oscillatoria limosa et autres cyanobactéries30).

Aussi rares dans le monde microbien sont les cellules qui s'écartent du modèle typique de division cellulaire le long d'un axe transversal. Deux exemples spectaculaires sont Candidatus Thiosymbion oneisti et Candidatus Thiosymbion hypermnestrae31,32,33, qui ont été exclusivement trouvés à la surface des nématodes marins. On pense que ce modèle de division préserve l'attachement à l'hôte31,32. De même, les membres de la famille des genres Neisseriaceae Alysiella, Simonsiella et Conchiformibius se divisent longitudinalement, ce qui est censé favoriser l'adhérence aux cellules épithéliales humaines dans la cavité buccale34. Ces taxons sont encore plus frappants en ce qu'ils peuvent être considérés comme des bactéries multicellulaires. D'autres exemples de bactéries qui subissent une division longitudinale incluent Spiroplasma poulsonii35 et le genre Candidatus Kentron, un clade de symbiotes hébergé par le cilié marin Kentrophoros36,37. Une telle compréhension des méthodes de reproduction de diverses bactéries est essentielle pour construire une compréhension globale de la biologie cellulaire.

Ici, nous découvrons des structures bactériennes rectangulaires inhabituelles (RBS) dans des échantillons oraux de dauphins et caractérisons leurs dimensions cellulaires et la structuration de l'ADN à l'aide de la microscopie à contraste de phase et à fluorescence. Des bandes régulières d'ADN suggèrent que les unités sont des feuilles de cellules individuelles, chacune étant encapsulée par une membrane interne et externe, tandis que les expériences d'hybridation in situ par fluorescence (FISH) et le séquençage métagénomique suggèrent fortement qu'il s'agit de bactéries et de membres potentiels de la classe. Bétaprotéobactéries. À l'aide de la microscopie électronique à transmission cryogénique (cryoTEM) et de la cryoET, nous caractérisons la structure d'enveloppe des RBS et découvrons des caractéristiques de surface jusque-là non observées telles que des faisceaux hétérogènes d'appendices qui dépassent des extrémités des RBS et s'évasent aux extrémités. Ces résultats mettent en évidence la puissance de la microscopie à haute résolution pour explorer la nature des microbes non cultivés.

Des échantillons d'écouvillons oraux ont été prélevés dans la bouche de huit grands dauphins (Tursiops truncatus) dans le cadre du US Navy Marine Mammal Program (MMP) dans la baie de San Diego, Californie, États-Unis, au cours de trois intervalles distincts en 2012, 2018 et 2022 ( Méthodes). Les RBS étaient facilement apparents sur les images de microscopie à contraste de phase (Fig. 1a – e). Les RBS ressemblaient à des prismes rectangulaires ; ils n'étaient pas cylindriques (film supplémentaire 1). Ils présentaient des caractéristiques Gram-négatives après coloration de Gram (Fig. 1f). Les tentatives de coloration de la membrane à l'aide de FM4-64 ont échoué, car le colorant FM4-64 n'a coloré aucune partie des RBS. Les RBS contenaient plusieurs bandes parallèles de fluorescence avec coloration au DAPI (Fig. 1b – e). Dans certains RBS, les paires de bandes d'ADN voisines apparaissaient en forme de "H" (Fig. 1g, flèche blanche), suggérant deux cellules en forme de bâtonnet en cours de division le long d'un axe longitudinal, les bandes d'ADN subissant une ségrégation27. RBS regroupés en deux morphotypes basés sur les dimensions des unités rectangulaires (Fig. 1h). En utilisant des matériaux provenant d'un seul échantillon d'écouvillon oral de dauphin, nous avons quantifié la longueur et la largeur de 23 RBS. Le morphotype A présentait une longueur médiane de 3,95 ± 2,89 µm d'écart absolu médian (MAD) et une largeur médiane de 5,08 ± 0,10 µm MAD (n = 15 RBS). Le morphotype B avait une longueur médiane de 3,08 ± 0,93 µm MAD et une largeur médiane de 2,21 ± 0,56 µm MAD (n = 8 RBS). Les dimensions pour la longueur et la largeur étaient significativement différentes entre les deux morphotypes (pour la longueur, p = 0,02 ; pour la largeur, p = 10−10 ; test t de Welch bilatéral). Les différents morphotypes peuvent représenter différents types de cellules ou groupes taxonomiques (par exemple, des souches ou des espèces), des cellules à différents stades de développement, ou des cellules avec une forme modifiée en réponse aux conditions environnementales.

a Images en contraste de phase des RBS (la flèche indique un exemple) à la surface des cellules épithéliales orales de dauphin. Voir également le film supplémentaire 1. b, c Certains RBS présentaient de longues bandes de fluorescence DAPI. L'image à contraste de phase est montrée en (b), avec une superposition de fluorescence en cyan en (c). d, e D'autres RBS présentaient des bandes DAPI plus courtes. L'image à contraste de phase est montrée en (d), avec une superposition de fluorescence en cyan en (e). Les taches sombres (flèches) étaient organisées en lignes perpendiculaires aux bandes colorées au DAPI. Les bandes colorées au DAPI semblaient être organisées par paires. f Les RBS colorés au Gram affichent des caractéristiques Gram-négatives. En médaillon : Bacillus subtilis teinté de Gram (Bs, Gram-positif) et Escherichia coli (Ec, Gram-négatif). g Les paires de bandes d'ADN voisines dans un RBS forment des formes de type "H" (flèche), probablement parce que les bandes d'ADN sont des nucléoïdes séparés dans une cellule subissant une division longitudinale. h Les deux morphotypes RBS ont des distributions distinctes de longueur et de largeur. La largeur et la longueur médianes de 15 RBS-A mesuraient respectivement 3,95 ± 2,89 µm MAD et 5,08 ± 0,10 µm MAD, et pour 8 RBS-B mesuraient respectivement 3,08 ± 0,93 µm MAD et 2,21 ± 0,56 µm MAD. Les centres des croix orange et bleue représentent respectivement les moyennes de RBS-As et RBS-Bs, tandis que les longueurs des bras représentent ± 1 écart-type.

Nous avons évalué la prévalence des RBS de chaque morphotype dans un ensemble de 73 échantillons d'écouvillons oraux prélevés sur huit dauphins (données supplémentaires 1) à l'aide d'un flux de travail de microscopie à contraste de phase automatisé à haut débit qui a recueilli des données d'imagerie pour 226 champs de vision par échantillon38. Des RBS de morphotype A, ci-après dénommés RBS-A, ont été détectés dans 39/73 échantillons provenant de 7/8 dauphins (notez que le nombre d'échantillons par dauphin n'est pas constant et que différents emplacements oraux ont été prélevés à différentes années). Des RBS de morphotype B, ci-après dénommés RBS-B, ont été détectés dans 42/73 échantillons de 6/8 dauphins. Sur 25 de ces 73 échantillons prélevés sur des sites buccaux distincts, des RBS ont été détectés dans des échantillons palatins (RBS-A = 5/5 ; RBS-B = 4/5) et gingivaux (RBS-A = 12/15 ; RBS- B = 14/15), mais moins fréquemment dans les échantillons buccaux (RBS-A = 0/5 ; RBS-B = 2/5). Ainsi, nous en déduisons que les RBS sont des colonisateurs stables dans la cavité buccale des dauphins et ont des emplacements de colonisation préférés.

Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur RBS-A, car ce morphotype avait une abondance plus élevée dans les échantillons oraux de dauphins et est plus distinct morphologiquement des autres microbes connus.

Compte tenu de la morphologie intrigante des RBS, nous avons ensuite cherché à déterminer leur affiliation taxonomique. Les RBS ressemblent morphologiquement aux membres des genres Simonsiella et Conchiformibius (famille des Neisseriaceae), qui sont des commensaux oraux en forme de bâtonnet chez les mammifères39. Dans une nouvelle analyse de la bibliothèque de clones Sanger et de 454 données de pyroséquençage d'une précédente enquête d'amplicon du gène ARNr 16S d'échantillons d'écouvillons gingivaux de 38 dauphins de la même population23, aucun S. muelleri (la seule espèce du genre Simonsiella) ou du genre Conchiformibius des amplicons ont été détectés dans l'un de ces échantillons, bien que d'autres membres de la famille des Neisseriaceae aient été détectés dans ces échantillons oraux de dauphins. Un type de séquence putatif de S. muelleri a été détecté dans la bibliothèque Sanger à partir de la bouche et du liquide gastrique d'un lion de mer examiné dans la même étude d'amplicon23 (numéro d'accès NCBI JQ205404.1) ; cette séquence partielle du gène de l'ARNr 16S a une identité de 94,6 % sur une couverture de requête de 99 % avec la séquence partielle du gène de l'ARNr 16S de S. muelleri ATCC 29453 (numéro d'accès NCBI NR_025144.1). La première étude a détecté cinq autres types de séquences de la famille des Neisseriaceae dans la bibliothèque Sanger à partir d'otaries (bouche et estomac), d'eau et d'espèces de poissons nourries aux mammifères marins23. Pendant ce temps, quatre types de séquences de la famille Neisseriaceae ont été récupérés lors de l'enquête de pyroséquençage 454, à partir de dauphins (estomac, système respiratoire), d'otaries (bouche, estomac), de poissons et d'eau de mer. Ces identifications positives indiquent que l'ADN de S. muelleri et de la famille des Neisseriaceae a pu être extrait avec succès dans l'étude précédente, bien qu'ils n'aient été détectés dans aucun échantillon oral de dauphin23.

Nous avons ensuite effectué le séquençage de l'amplicon du gène de l'ARNr 16S sur 54 échantillons oraux de dauphins (Méthodes), ce qui a entraîné la détection de 1 116 394 variants de séquence amplifié (ASV) à partir de 5 339 751 lectures de séquence. Sur ces 54 échantillons, 48 ​​ont été criblés de manière à haut débit pour les RBS via la microscopie à contraste de phase (Méthodes). RBS-As et RBS-Bs ont été chacun détectés dans 22/48 échantillons (45,8 %), mais pas les mêmes 22 échantillons. L'un ou l'autre morphotype a été détecté dans 30/48 échantillons (62,5%). Les courbes de raréfaction suggéraient que la profondeur de séquençage était suffisante pour que les résultats soient proches de la saturation pour la richesse en ASV (Fig. 2a). Aucun amplicon de la famille Neisseriaceae n'a été détecté dans ces échantillons (Fig. 2b), malgré notre capacité à récupérer des séquences de S. muelleri à partir d'échantillons d'écouvillons oraux précédemment négatifs après avoir délibérément dopé des aliquotes de ces échantillons avec S. muelleri. Les ASV communs aux échantillons positifs RBS-A et RSB-B peuvent être vus dans les tableaux supplémentaires 1 et 2, respectivement.

Des échantillons oraux de dauphins (n ​​= 54) ont été soumis à un séquençage profond de l'amplicon du gène de l'ARNr 16S. a Courbes de raréfaction pour les 54 échantillons oraux de dauphins séquencés. b Pour chaque famille de la classe Betaproteobacteria détectée dans les 54 échantillons oraux de dauphins, l'abondance relative des membres ASV est tracée. A noter que le genre Simonsiella fait partie de la classe des Betaproteobacteria de la famille des Neisseriaceae ; aucun ASV affilié à cette famille n'a été détecté. L'examen visuel par microscopie à contraste de phase (voir Méthodes) a révélé des RBS de morphotype A ou B dans 39 des 73 échantillons examinés (notez qu'au total, 73 échantillons ont été examinés visuellement pour les RBS ; 54 ont été utilisés pour le séquençage des amplicons, tandis que les autres ont été utilisés pour d'autres expériences) (Données supplémentaires 1). c Le séquençage d'une culture pure de S. muelleri et d'un échantillon oral de dauphin (confirmé contenir du RBS-As) avec S. muelleri dopé a entraîné la détection d'un ASV de la famille des Neisseriaceae. Le même ASV a été détecté à une abondance relative de <0,1 % dans ce même échantillon oral de dauphin dans son état inchangé (sans S. muelleri ajouté) lorsqu'il a été préparé et séquencé en parallèle avec les échantillons positifs pour S. muelleri ; l'ASV n'a été détecté dans aucun échantillon oral de dauphin avant l'introduction de S. muelleri dans l'environnement du laboratoire.

L'origine marine et la nature rectangulaire des RBS ont également donné lieu à des spéculations selon lesquelles il pourrait s'agir de diatomées marines (par exemple, Skeletonema costatum ), car les diatomées marines cylindriques peuvent apparaître rectangulaires en deux dimensions. Ainsi, nous avons ensuite évalué une origine eucaryote potentielle des RBS. Nous avons effectué la FISH en utilisant des sondes eucaryotes marquées (Euk-1209) et bactériennes (Eub-338), cette dernière étant connue pour s'hybrider avec les bactéries et les archées. Comme témoins, nous avons cultivé et inclus S. costatum et la bactérie Escherichia coli. La sonde Eub-338 s'est hybridée à la fois à E. coli et aux RBS, tandis que la sonde eucaryote Euk-1209 s'est hybridée aux cellules de S. costatum seules (Fig. 1 supplémentaire), indiquant que les RBS ne sont pas eucaryotes et donc pas des diatomées.

En l'absence d'autres hypothèses a priori sur la nature spécifique des RBS, nous avons poursuivi une variété d'approches générales pour éclairer leur identité. Tout d'abord, nous avons cultivé des échantillons oraux dans des conditions aérobies et anaérobies dans trois milieux utilisés pour cultiver diverses bactéries (méthodes), dans l'espoir de les enrichir en RBS. Malheureusement, les RBS n'étaient pas visibles lors de l'inspection des cultures au microscope, ce qui indique que les exigences de croissance des RBS sont distinctes de celles des bactéries typiques isolées du microbiote des mammifères.

Nous avons exploré plus en détail le potentiel de culture des RBS directement sur des surfaces solides. Parmi les échantillons d'écouvillons de 2022, nous en avons conservé cinq dans du glycérol à 20 % immédiatement après le prélèvement afin de maximiser les chances de maintenir la viabilité du RBS. La microscopie unicellulaire a identifié deux stocks de glycérol contenant des échantillons avec de nombreux RBS. Ces stocks ont été inoculés sur des plaques de gélose contenant soit du milieu BSTSY-FBS, soit du milieu BHI-sang (Méthodes). Les plaques BSTSY-FBS permettent la croissance de S. muelleri et ont été incubées en aérobiose à 37 °C. Les plaques de sang BHI sont généralement utilisées pour cultiver une variété de commensaux bactériens de mammifères; ces plaques ont été incubées en anaérobiose à 37°C. Après 3 semaines d'incubation prolongée, aucune colonie n'était visible sur les plaques BSTSY-FBS, tandis qu'un échantillon témoin de S. muelleri formait de grandes colonies après 1 à 2 jours. Les plaques de sang BHI contenaient collectivement environ 300 colonies, dont nous avons examiné 288 à l'aide d'une microscopie unicellulaire à haut débit38. Aucune des colonies ne contenait de cellules avec une morphologie similaire aux RBS. Pris ensemble, bien que décevant du point de vue de l'activation des approches génomiques, notre incapacité à cultiver les RBS fournit un soutien supplémentaire qu'ils ne sont pas S. muelleri, qui est facilement cultivable en utilisant de telles approches.

Notre stratégie suivante a utilisé la mini-métagénomique, une approche dans laquelle un petit nombre de cellules sont sous-échantillonnées à partir d'une communauté complexe et leur ADN est amplifié à l'aide de l'amplification par déplacement multiple (MDA). Notamment, cette approche évite en grande partie les biais préconçus sur l'identité possible, puisque les analyses métagénomiques devraient révéler l'ADN de n'importe quelle cellule de n'importe quel domaine de la vie, en supposant une lyse cellulaire réussie. Nous avons utilisé trois techniques pour capturer les RBS-As pour le séquençage génomique : la microdissection par capture laser, la microfluidique et la micromanipulation cellulaire. En raison de leur grande taille par rapport aux autres bactéries, de leur faible densité et de la propension des RBS-A à coller à d'autres cellules et à des surfaces abiotiques, seule la micromanipulation a permis une capture réussie de RBS-A (Fig. 1 supplémentaire). En plus de quatre tubes de collecte, contenant chacun ~ 1 à 3 RBS-A, quatre tubes de contrôle négatif de fluide d'échantillon ont été collectés avec la micropipette sans aucune cellule visible à la résolution de notre microscope. De l'ADN acellulaire et de petites cellules non cibles ont également probablement été collectés avec les RBS-A, étant donné la proximité fréquente des RBS-A avec d'autres cellules. L'ADN d'échantillons RBS-A-positifs et RBS-négatifs a été amplifié à l'aide de MDA, co-assemblé et trié dans 18 bacs génomiques (Fig. 3 supplémentaire et tableaux supplémentaires 3 et 4; Méthodes). Notamment, aucun génome de S. muelleri, de la famille des Neisseriaceae ou de diatomée n'a été récupéré, bien que des témoins positifs pour ces taxons n'aient pas été inclus dans la conception expérimentale. Les bacs eucaryotes correspondaient au génome humain ou à la classe fongique des Malasseziomycètes, dont les membres sont des commensaux connus de la peau humaine40, et peuvent donc représenter des contaminants. Aucun bac archéen n'a été récupéré.

Comme la moitié des bacs bactériens candidats récupérés de l'expérience de mini-métagénomique étaient membres du phylum Proteobacteria, nous avons ensuite effectué des expériences FISH en utilisant un ensemble de sondes spécifiques à la classe ciblant les alpha-, bêta- et gammaprotéobactéries. Les RBS présentaient une liaison positive uniquement aux sondes de classe Betaproteobacteria (Fig. 3).

Des sondes pour les classes de protéobactéries du phylum Alphaproteobacteria (ALF968), Betaproteobacteria (BET42a) et Gammaproteobacteria (GAM42a) ont été évaluées pour leur capacité à s'hybrider aux RBS. Rangée du haut : images en contraste de phase ; trois rangées du milieu de haut en bas : images de fluorescence pour les sondes de classe Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria et Gammaproteobacteria, respectivement ; rangée du bas : coloration DAPI de l'ADN présumé. Les flèches mettent en évidence les cellules pertinentes dans les échantillons. Les RBS du morphotype "A" (Fig. 1h) se sont hybrides avec la sonde de classe Betaproteobacteria et ont présenté une hybridation minimale avec les sondes de classe Alphaproteobacteria et Gammaproteobacteria.

Nous avons synthétisé les informations sur l'identité taxonomique de RBS-A à partir de chaque source de données expérimentale (Fig. 4). Bien qu'aucune idée concluante ne puisse être tirée sur l'identité de RBS-A, les résultats de FISH ont suggéré une affiliation avec la classe Betaproteobacteria, et un seul génome partiel de la classe Betaproteobacteria a été récupéré à partir des expériences de mini-métagénomique ; l'affiliation de cette cellule (numéro 16) à la famille des Alcaligenaceae a été confirmée par analyse phylogénétique des gènes de l'ARNr 16S et de la protéine ribosomique S3 (Figs. 4 et 5 supplémentaires et méthodes). Un ASV compatible avec le gène d'ARNr 16S de cette cellule est présent dans 11/13 des échantillons dans lesquels la présence de RBS-A a été confirmée visuellement et pour lesquels des données de séquençage d'amplicon sont disponibles.

Le tableau montre les 18 bacs récupérés à partir de MDA et le séquençage d'échantillons RBS-A collectés via un micromanipulateur, ainsi que le phylum dont ils sont supposés dériver. Pour la plus faible identité taxonomique obtenue (ou classe, dans le cas du phylum polyphylétique Proteobacteria), un astérisque (*) indique une confiance plus faible dans l'attribution (Méthodes). Le panneau RBS-A représente les abondances relatives de bacs dans chacun des quatre échantillons contenant des RBS-A en fonction de la visualisation, codés par couleur comme suit : vert : ≥ 5 %, jaune : ≥ 1 % et < 5 %, orange : > 0% et <1%, rouge : 0%. Le panneau de contrôle négatif (Neg) présente les mêmes informations pour chacun des échantillons qui ne semblaient pas contenir de RBS-A. Les critères permettant d'évaluer la probabilité qu'un bac dérive du RBS-A sont indiqués : (Génomique) Le bac a-t-il déjà été présent dans les témoins négatifs (vert = non, jaune = oui mais jamais ≥ 1 % d'abondance relative, orange = oui mais jamais ≥ 5 %, rouge = oui et au moins une fois ≥ 5 %) ? (Coloration de Gram) Les membres de ce groupe taxonomique sont-ils connus pour être Gram-négatifs, comme les RBS ? (16S 75 % +) Parmi les ASV détectés dans > 75 % des échantillons qui ont subi un séquençage d'amplicon du gène ARNr 16S et dont la présence de > 10 RBS-As (n = 13) a été visuellement confirmée, était-ce qu'un ASV avait cette identité taxonomique ? Les nombres dans les cases indiquent le nombre d'échantillons dans lesquels cet ASV était présent. Pour les bacs récupérés détectés uniquement au niveau de la classe Gammaproteobacteria, un groupe important et diversifié, ce critère est marqué en jaune et les comptages ASV ne sont pas affichés. (FISH) Sur la base des résultats FISH, quels groupes sont pris en charge en tant que candidats potentiels pour les RBS-A ? Une croix (†) indique qu'il est déduit que les membres du phylum Gracilibbacteria ne sont pas Gram-négatifs à partir d'études génomiques (bien qu'ils ne soient pas nécessairement Gram-positifs)92. Les candidats les plus probables sont verts pour les trois critères.

La voie évolutive vers la multicellularité et la division longitudinale est mal comprise. Des efforts récents pour identifier la base génétique de ces caractéristiques bactériennes dans la famille des Neisseriaceae ont révélé que l'acquisition du gène codant pour l'amidase amiC2, ainsi que des modifications des principaux gènes régulateurs (par exemple, mreB, ftsA), jouent probablement un rôle important. Nous avons recherché les bacs récupérés de l'expérience de mini-métagénomique pour les protéines AmiC2 putatives (celles codant Amidase_3, PF01520) ; les candidats ont été identifiés dans les bacs 4, 7, 9, 10, 11, 12 et 16 (dont le dernier est affilié aux Alcaligenaceae). Après confirmation de l'identité des RBS, les travaux futurs devraient examiner l'importance d'amiC2 pour conférer leur morphologie inhabituelle.

Pour obtenir un aperçu structurel à haute résolution des RBS-As, nous avons imagé des échantillons oraux de dauphins contenant des densités élevées de RBS-As à l'aide de cryoTEM. Les images cryoTEM à faible grossissement ont révélé que chaque RBS-A se compose de segments apparemment appariés organisés en parallèle (Fig. 5a, b). Ces segments étaient orientés de manière similaire aux bandes colorées au DAPI vues dans les images de microscopie à fluorescence (Fig. 1c, e). Certains groupes de segments semblaient être en train de se séparer d'autres groupes, bien que nos données statiques ne puissent pas dire avec certitude si ces observations reflétaient la division cellulaire. Les segments étaient entourés d'une couche dense semblable à une membrane sous une couche de faible densité (Fig. 6a, b (à droite) et Fig. 7a; Films supplémentaires 2 et 3).

Images a, b à faible grossissement filtrées et débruitées en passe-bande ou images cryoTEM de montage c de RBS sur une grille TEM en carbone troué R2 / 2. Images à plus fort grossissement montrant d des appendices en forme de pilus et des cellules proximales e et des vésicules en interaction à la périphérie de la RBS. En (a), les paires de segments sont mises en évidence avec des nuances de bleu alternées, et les indentations nettes entre les groupes de segments sont indiquées par des flèches noires. Des objets sphéroïdaux denses étaient présents à l'intérieur des RBS (flèche blanche). En (d), les segments sont encapsulés par une membrane interne (IM) et une membrane externe (OM), désignées par des flèches noires. d, e Micrographies représentatives montrant que les RBS étaient souvent à proximité physique d'autres cellules dans les échantillons. En (e), une petite indentation apparente (flèche noire) dans le revêtement de surface périodique RBS chevauche une cellule ou une vésicule non RBS. Les petites taches sombres (15 nm) dans (c – e) sont des particules fiduciales en or utilisées pour l'alignement des séries d'inclinaison dans les expériences cryoET (flèche noire).

a, b, d, e Exemples de tranches d'environ 3 nm d'épaisseur à deux profondeurs différentes (a contre b, d contre e) de chacun des deux tomogrammes RBS-A représentatifs. c, f Annotations manuelles correspondantes des caractéristiques cellulaires. Les tomogrammes sont épais (~ 500–600 nm) et, à ce titre, les appendices en forme de pili (jaune : c, f) n'étaient visibles qu'à une certaine profondeur dans la densité volumique tomographique du RBS-A. Voir également les films supplémentaires 2 et 3. c, f Bleu, membranes internes ; revêtement de surface violet, périodique; vert, membrane externe ; rouge, matrice. Barres d'échelle, 100 nm.

une image cryoTEM unique. b, c Tranches CryoET (~ 3 nm d'épaisseur) d'un RBS-A. Les cases rouges et oranges en (c) sont des vues agrandies de faisceaux d'appendices, et les flèches indiquent des appendices minces et simples. d Image cryoTEM 2D représentative au bord d'un RBS-A montrant un revêtement de surface périodique. e Les profils de densité de lignes le long de régions sélectionnées de l'image en (d) montrent que l'espacement des caractéristiques répétitives est d'environ 7 à 9 nm le long d'une direction parallèle à la membrane RBS-A.

Nous avons émis l'hypothèse que les RBS sont très probablement des agrégats de cellules, chaque segment contenant de l'ADN correspondant à une cellule individuelle. Les observations suivantes appuient cette hypothèse : (1) chaque segment individuel semblait être entouré d'une membrane interne et externe, rappelant le plasma et la membrane externe observés chez d'autres bactéries Gram-négatives (Fig. 5a, 6a, b (à droite) et 7a); (2) les segments sont disposés dans la même géométrie (Fig. 5a, b) que les bandes colorées au DAPI et les bandes hybridées avec la sonde FISH (Fig. 1c, e, g et 3); (3) appendices dépassant de la surface des segments individuels (Fig. 5c, d) ; (4) Les RBS-A consistaient souvent en un nombre variable de segments qui semblaient se séparer les uns des autres (Figs. 1d, e et 6d, e), ce qui suggère que les structures rectangulaires ne reflètent pas les cellules individuelles ; (5) les segments voisins sont apparus en forme de H (Fig. 1g), rappelant la ségrégation des nucléoïdes dans une cellule bactérienne subissant une division longitudinale ; et (6) alors qu'un rapport récent décrit la première découverte d'une bactérie dans laquelle l'ADN est stocké dans un compartiment lié à la membrane41, le nombre d'espèces bactériennes connues dans lesquelles l'ADN est physiquement séparé du cytoplasme, sans parler des organites, est extremement bas. En revanche, la multicellularité a été documentée chez diverses espèces bactériennes (revue dans la réf. 42).

Des structures sombres et sphériques étaient visibles dans le corps des RBS dans les images cryoTEM (Fig. 5c). Dans un tomogramme, deux objets sphéroïdaux denses étaient bien visibles et mesuraient 192 nm × 200 nm × 192 nm (volume 3,1 × 107 nm3) et 215 nm × 220 nm × 220 nm (volume 4,4 × 107 nm3). Des structures semblables à des vésicules étaient également apparentes. Notamment, un revêtement de surface avec une périodicité d'environ 7 à 9 nm encapsulait le RBS-As (moyenne 7, 83 ± 0, 86 nm SD) (Fig. 6 et 7 et films supplémentaires 2 et 3). Cette caractéristique a été mesurée à partir des micrographies 2D haute résolution de deux RBS-A provenant d'un seul échantillon oral de dauphin en générant des tracés de densité de lignes de segments (2 de chaque image) et en mesurant manuellement la distance entre les pics d'intensité pour 6 à 7 pics ( Fig. 7d, e).

Pour obtenir des reconstructions 3D plus détaillées des caractéristiques RBS-A, nous avons mené des expériences cryoET. Les acquisitions en série d'inclinaison étaient limitées à la périphérie du RBS-A puisque l'épaisseur des corps du RBS-A occultait presque complètement le faisceau d'électrons à des angles d'inclinaison élevés. L'épaisseur à la périphérie RBS-A (<1 μm du bord) variait de ~ 323 à 751 nm, avec une valeur moyenne de ~ 509 ± 132,4 nm SD (n = 15), (au-dessus du seuil de ~ 500 nm communément considéré comme limite supérieure pour l'imagerie cryoET productive43). Les tentatives d'imagerie du corps RBS-A avec cryoET ont échoué parce que les repères d'or et les caractéristiques cellulaires sont rapidement devenus indiscernables lors de l'inclinaison, ce qui suggère que l'épaisseur de l'échantillon a induit trop d'événements de diffusion multiples44.

Appendices qui ressemblaient à pili45,46 dépassant de RBS-As ; ces appendices étaient souvent constitués de structures ressemblant à des cheveux qui formaient des faisceaux et s'évasaient aux extrémités, s'entrelaçant et/ou se croisant parfois (Figs. 6b et 7b, c). Les faisceaux d'appendices étaient structurellement hétérogènes, avec des longueurs, des largeurs de faisceaux et des nombres de pointes variables. Notamment, en examinant les différentes caractéristiques des tomographies, nous n'avons observé aucun organite lié à la membrane rappelant un noyau, conformément à une identité non eucaryote.

Pour les appendices et le revêtement de surface périodique, la moyenne des sous-tomogrammes47 n'a pas produit de cartes cohérentes, probablement en raison de l'épaisseur de la périphérie RBS-A (souvent> 500 à 600 nm d'épaisseur), du faible rapport signal sur bruit des tomogrammes et caractéristiques limitatives des caractéristiques en question, telles que la courbure variable des régions avec des étendues de revêtement de surface périodique continu. La moyenne réussie des sous-tomogrammes repose généralement sur la moyenne de structures identiques, par exemple, des copies répétées d'un complexe macromoléculaire, telles que des ribosomes dans le même état fonctionnel. On peut compenser la variabilité structurelle sous forme d'hétérogénéité conformationnelle et compositionnelle avec de grands ensembles de données composés de milliers de sous-tomogrammes en combinaison avec des méthodes de classification avancées. Cependant, dans nos ensembles de données, les appendices en forme de pilus (Fig. 7a – c) et la caractéristique de surface en forme de couche S (Fig. 7a, d, e) étaient structurellement hétérogènes et peu distribués dans le RBS-As (par exemple , la caractéristique de surface en forme de couche S n'est pas continue sur toute la membrane du RBS-As, et dans les tronçons où elle se trouve, elle présente une courbure différentielle) et n'a donc été observée que dans une fraction de nos tomographies.

Pour traiter l'épaisseur de l'échantillon, nous avons utilisé la microscopie électronique à balayage cryogénique à faisceau d'ions focalisé (FIB)48 pour broyer des lamelles plus minces d'échantillons RBS49. Cependant, nous n'avons pas pu localiser de RBS-A sous la glace, pour deux raisons possibles : (1) avec une épaisseur déduite comprise entre ~0,6 et 1,7 µm, les RBS-A peuvent ne pas former de "monticules" sous la glace suffisamment protubérants pour suggérer où fraiser ; et (2) d'autres cellules plus grandes dans les échantillons (telles que les cellules épithéliales de dauphin) formaient des monticules plus proéminents qui masquaient les RBS-A. En effet, aucune des lamelles que nous avons produites à partir d'emplacements candidats ne contenait de RBS-As. Les données de cette expérience suggèrent que la lumière cryocorrélative et la microscopie électronique (cryoCLEM) seront nécessaires dans les études futures pour localiser les régions candidates dans les grilles cryoEM avec RBS-As vitrifié à partir desquelles produire des lamelles minces à l'aide de cryoFIB-SEM. Néanmoins, la surface cellulaire présentait des caractéristiques similaires à celles que nous avons observées sur la périphérie RBS-A, à savoir les pili et les couches S. Nous suggérons que les appendices en forme de pilus et le revêtement de surface périodique en forme de couche S de RBS-As méritent une enquête future.

Ici, nous avons utilisé la microscopie optique, le cryoTEM et le cryoET pour rechercher une nouvelle diversité morphologique dans le microbiote des échantillons oraux des dauphins. La diversité morphologique a été prédite sur la base de découvertes antérieures d'une nouvelle diversité phylogénétique et d'un potentiel fonctionnel dans la bouche des dauphins via des études basées sur le séquençage16,23. Fait intéressant, nous avons découvert des RBS inhabituels. Nous en déduisons que les deux morphotypes de RBS sont indigènes à la bouche des dauphins étant donné qu'ils étaient constamment présents dans cet environnement : RBS-As et RBS-Bs ont été identifiés dans 39/73 et 42/73 échantillons, respectivement, qui ont été étudiés à l'aide d'un système à haut débit. par imagerie microscopique, y compris chez 7/8 et 6/8 dauphins inclus dans cette étude, et étaient présents dans des échantillons prélevés à des intervalles de dix ans. Des études antérieures ont montré que le microbiote des mammifères marins est distinct de celui de l'eau de mer (même celui de la peau, qui est constamment en contact direct avec l'eau de mer)23,50, et il est donc peu probable que les RBS soient simplement des contaminants de l'eau de mer.

L'identification taxonomique de morphotypes cellulaires spécifiques de communautés complexes peut être extrêmement difficile, au point qu'elle reste souvent non résolue28,51,52. Les résultats recueillis ici suggèrent fortement que les RBS-A ne sont pas affiliés aux membres multicellulaires de la famille Neisseriaceae à division longitudinale, S. muelleri, genre Conchiformibius ou genre Alysiella, qui peuvent également former des amas de forme rectangulaire de cellules en forme de bâtonnet53. Premièrement, le flux de travail de séquençage des amplicons du gène marqueur utilisé ici n'a détecté aucun amplicon de la famille des Neisseriaceae dans 54 échantillons oraux de dauphins ayant subi un séquençage profond des amplicons du gène de l'ARNr 16S, bien que ce flux de travail ait détecté S. muelleri après que les cellules de ce taxon aient été intentionnellement dopées dans des aliquotes de prélèvements oraux de dauphins. Deuxièmement, les tentatives de culture de RBS-A à l'aide de techniques qui ont été utilisées avec succès dans notre laboratoire pour cultiver S. muelleri ont échoué, ce qui suggère que les RBS-A ont des exigences physiologiques de croissance différentes de celles requises par S. muelleri. Troisièmement, aucun génome de la famille Neisseriaceae n'a été récupéré de l'expérience de mini-métagénomique. Quatrièmement, des comparaisons visuelles des images RBS-A présentées ici avec les images de microscopie TEM et de fluorescence de la famille multicellulaire à division longitudinale Neisseriaceae (genres Alysiella, Simonsiella et Conchiformibius) dans la réf. 53 suggèrent qu'il s'agit de taxons différents. Par exemple, les RBS semblent contenir des segments (cellules) qui sont intégrés dans un matériau de type matrice et entièrement encapsulés par une structure de type couche S, alors que la famille multicellulaire à division longitudinale des Neisseriaceae appartenant au même filament ne semble partager que leur membrane externe53 .

Les expériences FISH ont indiqué que les RBS-A sont des bactéries et sont probablement des membres de la classe Betaproteobacteria. Un génome de classe Betaproteobacteria a été récupéré à partir de l'expérience de mini-métagénomique de la famille des Alcaligenaceae. Un ASV correspondant au gène d'ARNr 16S de cette cellule a été détecté dans 11/13 échantillons qui ont subi un séquençage d'amplicon et ont été visuellement confirmés comme contenant du RBS-As par microscopie à contraste de phase. Pris ensemble, les RBS-A peuvent appartenir à la famille des Alcaligenaceae, bien que la découverte de l'absence de cet ASV dans 2/13 échantillons confirmés comme contenant des RBS-A par microscopie remet en question cette hypothèse. Une possibilité est que les RBS-A étaient présents en abondance relative suffisamment faible dans ces deux échantillons pour ne pas être détectés, malgré le séquençage profond des amplicons. Une autre possibilité est que les RBS-A ne soient pas ce taxon d'Alcaligenaceae, et plutôt le taxon d'Alcaligenaceae est un membre omniprésent du microbiote oral des dauphins et apparaît donc fréquemment dans nos analyses basées sur le séquençage. Dans un tel cas, cela suggérerait soit que les RBS-A sont des bêtaprotéobactéries de classe qui n'ont pas lysé dans les expériences basées sur le séquençage, soit que les résultats FISH étaient un faux positif, malgré les conditions strictes et contrôlées dans lesquelles l'expérience a été réalisée.

L'obtention d'une identification au niveau de l'espèce pour les RBS via des méthodes basées sur le séquençage sera extrêmement difficile pour de nombreuses raisons, telles que la proximité fréquente des RBS avec d'autres petites cellules qui ont probablement été mélangées avec des RBS lors de la micromanipulation ou de la récalcitrance à la lyse en laboratoire. Il est important de noter que nous hésitons à exclure les identités candidates en raison de leur absence dans l'expérience de mini-métagénomique dans tous les échantillons RBS positifs, car des limitations techniques auraient pu entraîner des faux négatifs. Par exemple, une paroi cellulaire épaisse ou une obstruction empêchant les réactifs d'atteindre le RBS par l'aiguille de la micropipette pourrait avoir interféré avec la lyse de la membrane cellulaire et entravé l'extraction de l'ADN. À l'inverse, un résultat positif dans un contrôle négatif peut être dû à une cartographie de lecture non spécifique, à la contamination des bacs génomiques par du matériel provenant de vrais contaminants ou à de l'ADN acellulaire. Les approches basées sur la culture peuvent finalement être la voie la plus prometteuse pour identifier les RBS, bien que de nombreuses combinaisons de paramètres devront probablement être testées pour trouver des conditions satisfaisantes pour la croissance des RBS. Indépendamment de l'identité taxonomique des RBS, les nouvelles caractéristiques structurelles qui ont évolué dans ces micro-organismes sont intrigantes et mettent en évidence le potentiel de découverte pour une étude plus approfondie.

La nature appariée des segments dans les RBS peut probablement être attribuée à leur mode longitudinal de fission binaire, comme on le voit dans la famille des genres Neisseriaceae Alysiella, Simonsiella et Conchiformibius, ainsi que S. poulsonii, Ca. T. oneisti et Ca. T. hypermnestrae31,32,35,54. Chez le membre de la famille des Neisseriaceae S. muelleri, on pense que les feuilles aident les cellules à rester physiquement ancrées dans la cavité buccale lorsque les cellules épithéliales se détachent rapidement 34. Nous émettons l'hypothèse qu'il en va de même pour les RBS, qui vivent dans un environnement similaire et dont la morphologie peut avoir subi une évolution convergente en raison de pressions évolutives similaires. La fission binaire longitudinale peut être une caractéristique encore plus générale qui est choisie en réponse au besoin de former une fixation sûre à un substrat. Les segments aux extrémités des RBS sont souvent plus courts que ceux plus proches du centre, ce qui suggère qu'il peut y avoir un mécanisme par lequel la croissance des segments est déterminée par leur positionnement spatial dans un RBS. Les RBS présentent un autre exemple de cas pour de futures études évolutives axées sur la compréhension des moteurs et de la base génétique de la multicellularité bactérienne et de la division longitudinale.

Les images CryoTEM suggèrent que les RBS-A sont encapsulés par un revêtement de surface périodique, qui peut être une couche S ou une nouvelle structure cristalline. Les couches S sont des réseaux cristallins auto-assemblés de protéines ou de glycoprotéines uniques qui recouvrent l'extérieur de certaines bactéries et archées55,56. Bien que leur fonction exacte varie considérablement d'un micro-organisme à l'autre et soit souvent inconnue, on suppose que les couches S confèrent des fonctions bénéfiques compte tenu de leur coût métabolique élevé (la couche S comprend jusqu'à ~ 20% de la protéine totale synthétisée par les cellules), leur ubiquité à travers microbes, et leurs multiples origines évolutives55,56. Si les segments du RBS-As correspondent à des cellules individuelles, la production du revêtement de surface périodique peut représenter une coopération entre les cellules au sein du RBS-As. La synthèse coopérative d'un seul revêtement de surface périodique partagé par plusieurs cellules aurait pu évoluer puisque les parents proches (autres cellules dans un RBS-A) ont une capacité de dispersion limitée et sont donc situés à proximité physique. Les RBS-A bénéficieraient de la production coopérative d'une seule surface périodique couvrant une population de cellules plutôt qu'autour de chaque segment individuel en réduisant la surface nécessaire pour couvrir toutes les cellules, et un tel avantage aurait même pu contribuer à la sélection pour l'agrégation. Une possibilité supplémentaire et non mutuellement exclusive est que le revêtement de surface périodique peut aider à maintenir l'ultrastructure des segments dans un RBS-A, similaire aux archées telles que Thermoproteus tenax57.

L'une des caractéristiques les plus frappantes des RBS-A est leurs appendices en forme de pilus. À l'heure actuelle, il existe cinq classes caractérisées de pili chez les bactéries Gram-négatives (chaperone-usher, fibres curli, type F, type IV et type V) et deux types généraux de pili chez les bactéries Gram-positives (courts, bâtonnets minces et filaments plus longs, flexibles, ressemblant à des cheveux)45,46 ; d'autres appendices en forme de pilus ont été documentés, comme le hami chez les archées21. À notre connaissance, les pili bactériens caractérisés sont tous constitués d'appendices uniques qui existent en tant qu'unités indépendantes. En revanche, les appendices en forme de pilus qui dépassent des segments RBS-A présentent une architecture inhabituelle impliquant des faisceaux hétérogènes de filaments qui s'évasent souvent aux extrémités. Ces observations soulèvent la question de savoir si les appendices RBS-A représentent un nouveau type d'assemblage de sous-unités de piline ou sont une classe complètement distincte d'appendices.

Une enquête approfondie sur des centaines d'images cryoEM et des dizaines de tomogrammes cryoET a permis de visualiser la structure de nombreuses caractéristiques RBS-A à une résolution proche du nanomètre. Les futures études sur les RBS pourraient bénéficier de l'imagerie avec une optique à plaque de phase qui augmente considérablement le contraste de l'image58 à la suite de méthodes de préparation d'échantillons qui amincissent les cellules en lamelles par broyage FIB couplé à un SEM à des températures cryogéniques48,49. Nos données suggèrent que cryoCLEM sera nécessaire pour permettre la production de fines lamelles pour RBS-As puisque le corps cellulaire RBS-A semble être plus épais que la limite autorisée pour les expériences cryoET, et pourtant trop mince pour que RBS-As soit facilement trouvé par cryoSEM avant le fraisage cryoFIB sans étiquettes fluorescentes. Des expériences réussies de cryoCLEM + cryoFIB-SEM suivies de cryoET pourraient permettre des analyses plus complètes de la communauté des RBS et de leur corps cellulaire au-delà de la périphérie mince ainsi que la visualisation des composants subcellulaires d'intérêt à une résolution plus élevée via la moyenne des sous-tomogrammes.

La grande majorité des micro-organismes sur Terre manquent de représentants isolés19. Les analyses basées sur le séquençage se sont avérées inestimables pour explorer et décrire ladite diversité, mais ne peuvent pas être utilisées pour explorer tous les aspects de la biologie des micro-organismes. Les points aveugles notables dans notre compréhension des organismes non cultivés comprennent les gènes uniques et les caractéristiques structurelles et fonctionnelles correspondantes qui ont évolué au sein de ces lignées. Alors que l'utilisation de techniques d'imagerie avancées pour visualiser les microbes peut donner un aperçu de la biologie des lignées non cultivées, un changement vers une approche plus multiforme faisant appel à de nombreuses disciplines et techniques sera nécessaire pour créer une vue complète de cette matière noire biologique59,60.

Pour maximiser la reproductibilité, une liste des réactifs et des ressources utilisés dans cette étude, ainsi que leur source et leur identifiant, est fournie dans le tableau supplémentaire 5.

Des échantillons d'écouvillons oraux ont été obtenus à partir de grands dauphins (Tursiops truncatus) gérés par la US Navy MMP Biosciences Division, Space and Naval Warfare Systems Center Pacific, San Diego, États-Unis. Le premier échantillon contenant des RBS a été collecté le 1er avril 2012 et le plus tard le 24 mars 2022. Des échantillons d'écouvillons ont été obtenus à l'aide d'écouvillons de prélèvement d'échantillons stériles en mousse Catch-All (Epicenter, WI, Cat. # QEC091H). Les échantillons prélevés en 2012 ont été obtenus par écouvillonnage du sillon gingival gauche. Les échantillons prélevés en 2018 ont été obtenus en frottant le palais, la langue et le sillon gingival gauche (les trois surfaces pour chaque écouvillon). Les échantillons prélevés en 2022 provenaient du palais, de la surface buccale ou du sillon gingival gauche. Sur les 2022 échantillons de sillon gingival, 5 ont été conservés dans du glycérol à 20 %. Tous les autres échantillons d'écouvillons ont été congelés à sec. Le protocole d'écouvillonnage a respecté les directives décrites dans le CRC Handbook of Marine Mammal Medicine.

Le MMP est accrédité par l'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International et adhère aux normes nationales de la politique du service de santé publique des États-Unis sur le soin et l'utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire et à la loi sur le bien-être des animaux. Comme l'exige le département américain de la Défense, le programme de soins et d'utilisation des animaux du MMP est régulièrement examiné par un comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) et par le Bureau de médecine et de chirurgie de la marine américaine. Le protocole d'utilisation et de soins des animaux pour les dauphins MMP à l'appui de cette étude a été approuvé par l'IACUC du MMP et le Bureau de médecine et de chirurgie de la Marine (IACUC #92-2010, BUMED NRD-681).

Pour séparer les cellules des écouvillons, les écouvillons ont été immergés dans du PBS 1X (~ 50 à 100 µL, selon la densité cellulaire) dans des tubes de microcentrifugeuse. Les tubes ont été vortexés vigoureusement pendant ~ 10 s et légèrement centrifugés pour éliminer le liquide des bouchons des tubes. La solution résultante a été utilisée pour la microscopie.

Environ 1 µL de solution cellulaire dans du PBS a été déposé sur un tampon d'agarose (agarose à 1 % dans du PBS) et imagé avec un microscope inversé Eclipse Ti-E avec un objectif 100X (NA : 1,4) (Nikon, Tokyo, Japon). Pour déterminer la localisation de l'ADN, les cellules ont été colorées avec du DAPI à une concentration finale de 0,5 μg mL-1 pendant 5 min avant l'imagerie en utilisant des spectres d'émission/excitation de 340/488 nm. L'imagerie automatisée à haut débit d'échantillons oraux de dauphins par microscopie à contraste de phase a été réalisée à l'aide du protocole d'imagerie de la bibliothèque de souches38 pour capturer 226 champs de vision pour chacun des échantillons collectés en 2018 et 100 champs de vision pour ceux collectés en 2022.

La coloration de Gram a été réalisée à l'aide d'un kit de coloration de Gram (Sigma Aldrich, cat. #77730-1KT-F) en suivant le protocole du fabricant. Les cellules ont été imagées à l'aide d'un microscope à fond clair avec un objectif 100X (Nikon). Le colorant FM4-64 (ThermoFisher Scientific, cat. #T13320) a été appliqué directement sur des échantillons d'écouvillons oraux de dauphins en suivant le protocole du fabricant. Le colorant FM4-64 n'a coloré aucune partie des RBS.

Une solution de cellules dans du PBS (2,5 µL) a été appliquée sur des grilles Quantifoil en cuivre 200 mesh à décharge luminescente (Quantifoil, Großlöbichau, Allemagne, Cat. #Q2100CR1) ou des grilles GridFinder Quantifoil en or (Quantifoil, Großlöbichau, Allemagne, Cat. #LFH2100AR2), suivi de l'application de 2 µL de solution de référence d'or 15 nm des deux côtés de chaque grille. Les grilles ont été buvardées pendant 5 s et congelées par plongée dans de l'éthane liquide refroidi par de l'azote liquide à environ -195 ° C à l'aide d'un congélateur plongeant EM GP (Leica, Wetzlar, Allemagne).

Les échantillons ont été chargés dans l'un des deux microscopes : un Titan Krios G3 fonctionnant à 300 kV avec un filtre d'énergie (largeur de fente de 20 eV) ou un Titan Krios G4 fonctionnant à 300 kV sans filtre d'énergie. Les deux microscopes étaient équipés d'un dispositif de détection directe d'électrons K2 Summit (Gatan, Pleasanton, USA) utilisé pour enregistrer les micrographies. Les données ont été acquises de manière semi-automatique en mode comptage à l'aide de SerialEM (v. 3.8)61. Les paramètres d'imagerie CryoEM/ET sont fournis dans le tableau supplémentaire 6.

Les montages ont été mélangés et regroupés 4 fois ou plus à l'aide de l'algorithme IMOD v. 4.12.9 "blendmont"62 et normalisés, filtrés passe-bande, pivotés et recadrés à des fins d'affichage à l'aide d'EMAN2 v. 2.3963. Quinze des seize séries d'inclinaison étaient adaptées à la reconstruction tomographique dans IMOD v. 4.12.9. Les séries d'inclinaison avec échantillonnage à 7,5 Å pixel-1 ont été sous-échantillonnées par 2 fois et celles avec échantillonnage à 3,48 ou 3,75 Å pixel-1 ont été sous-échantillonnées par 4 fois. Les images avec des artefacts tels qu'une charge excessive, une dérive, une grande contamination de la glace s'infiltrant à des inclinaisons élevées ou une épaisseur excessive à une inclinaison élevée ont été exclues de 12 des séries d'inclinaison avant l'alignement manuel basé sur l'or; jusqu'à 13 images ont été supprimées sur les 41 images de la série originale d'inclinaison brute.

Les tomogrammes ont été reconstruits à l'aide d'une rétroprojection pondérée standard et d'un filtre de type SIRT (imitant 16 itérations) et ont été filtrés par passe-bande et regroupés par 2 dans la plupart des cas pour l'annotation de caractéristiques, la segmentation, la production de films et d'autres fins d'affichage . L'épaisseur du tomogramme a été estimée en identifiant visuellement les tranches z les plus petites et les plus grandes avec des densités de contamination RBS-A ou de glace visibles et en convertissant le nombre de tranches en nanomètres. La moyenne des sous-tomogrammes a été tentée en utilisant EMAN2 v. 2.3964,65 pour les densités globulaires suspectées d'être des ribosomes, les densités de matrice sous la membrane externe, les taches du revêtement de surface périodique et les régions d'appendices de type pilus, mais aucune structure interprétable avec une résolution meilleure que ~ 50 Å ont été obtenus. Les gammes d'épaisseur et de longueur des appendices en forme de pilus ont été dérivées en balayant visuellement les tranches dans les tomogrammes pour les filaments individuels les plus minces et les faisceaux les plus épais perceptibles à l'œil nu et en mesurant leurs dimensions en tranches tomographiques regroupées par 4 à l'aide de la mesure outil de bande d'EMAN2 e2display.py. La distance de répétition du revêtement de surface périodique a été mesurée manuellement de la même manière que les appendices en forme de pilus des tranches tomographiques, avec environ 10 à 20 mesures de chacun des trois tomogrammes affichant au moins de petites régions où la répétition était perceptible. Cette quantification a donné une plage comprise entre ~ 6 et 10 nm, suggérant que les composants de la couche sont flexibles ou que la structure sous-jacente peut donner différentes distances apparentes entre ses sous-unités en fonction de l'angle auquel elle est tranchée. De plus, les régions montrant le motif beaucoup plus clairement dans les images de projection bidimensionnelle de montage à fort grossissement ont été rognées, tournées pour se trouver dans un plan horizontal, filtrées et masquées pour calculer les profils de densité de lignes parallèles à la membrane externe.

Nous avons initialement effectué une annotation tomographique de trois caractéristiques (recouvrement de surface périodique, membranes lipidiques et appendices en forme de pilus) pour trois tomogrammes à l'aide du pipeline semi-automatisé basé sur un réseau neuronal bidimensionnel d'EMAN266 et effectué un nettoyage manuel des faux positifs dans UCSF Chimère v. 1.1667. Les cartes de probabilité d'annotation de sortie d'EMAN2 v. 2.39 ont été transformées en segmentations en appliquant un seuil déterminé visuellement et en multipliant les tomogrammes à contraste inversé par la carte d'annotation seuillée. Les segmentations ont été filtrées passe-bas avec EMAN2 v. 2.39 pour lisser le bruit. Cependant, étant donné que la complexité des structures subcellulaires n'a pas été capturée par les annotations semi-automatisées, nous avons appliqué un processus similaire pour générer des segmentations de cinq caractéristiques (appendices en forme de pili, revêtement de surface périodique, membrane externe, matrice et membranes internes) à l'aide d'un manuel. annotations effectuées avec IMOD v. 4.12.9, suivant un protocole récent qui augmente l'efficacité de l'annotation manuelle68. Des instantanés pour la Fig. 6 affichant les fonctionnalités RBS-A en couleur ainsi que les films supplémentaires 2 et 3 montrant les résultats de segmentation ont été produits avec UCSF Chimera v. 1.16.

Nous avons d'abord identifié une grille contenant du RBS-As en utilisant la microscopie optique. À l'aide d'un Aquilous CryoFIB (ThermoFisher Scientific, MA, États-Unis), nous avons créé cinq lamelles en utilisant un courant de 30 kV, 30 pA et une durée de 5 µs. Les échantillons ont ensuite été chargés dans un cryoTEM pour l'observation des échantillons et la collecte de données. Nous n'avons pas pu identifier les RBS dans les lamelles.

Des cultures cellulaires d'Escherichia coli axénique MG1655, Skeletonema costatum non axénique LB 2308 (UTEX Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin, Austin, TX, USA), Caulobacter crescentus CB15N et Simonsiella muelleri ATCC 29453 ont été préparées comme témoins. E. coli a été cultivé dans du bouillon LB et cultivé à 37 °C, S. costatum a été cultivé dans du milieu d'Erdschreiber à 20 °C avec un cycle de lumière d'environ 12 h et d'obscurité d'environ 12 h, C. crescentus a été cultivé dans du milieu PYE à 30 °C. °C, et S. muelleri a été cultivé dans du milieu BSTSY (2,75 % (w/v) Tryptic Soy Broth, 0,4 % (w/v) extrait de levure, 10 % sérum bovin) à 37 °C.

Toutes les sondes FISH ont été commandées auprès de Integrated DNA Technologies (Coralville, USA) avec purification HPLC. Les séquences de sonde et les marqueurs de fluorescence sont les suivants : Euk-1209 : 5'-GGGCATCACAGACCTG-/3Alx660/-3', Bact338 : 5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-/Alx488/-3', BET42a : 5'-/Alx594/-GCCTTCCCACTTCGTTT- 3', GAM42a : 5'-/Alx488/-GCCTTCCACATCGTTT-3', non EUB : 5'-/Cy5/-ACTCCTACGGGAGGCAGC-3'.

Les cellules des témoins et des RBS-A ont été recueillies dans des tubes de microcentrifugeuse. Pour assurer une biomasse suffisante des écouvillons oraux de dauphins, les cellules de quatre écouvillons ont été condensées dans un seul tube. Le protocole FISH a été adapté de la réf. 69. Les cellules ont été fixées dans 1 mL de solution de formaldéhyde à 3,7 % (800 μL d'eau traitée au DEPC, 100 μL de PBS 10X, 100 μL de formaldéhyde à 37 %) pendant 30 min avec agitation douce à 700 tr/min. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois dans 1 ml de PBS 1X et perméabilisées dans un mélange de 300 μL d'eau traitée au DEPC et de 700 μL d'éthanol à l'épreuve des 200 avec une agitation douce à 700 tr/min pendant 2 h. Les sondes ont été ajoutées à 50 μL de solution d'hybridation à une concentration finale de 1 μM par jeu de sondes. Pour BET42a et GAM42a, la solution d'hybridation contenait une solution de formamide à 55 % (4 mL de DEPC-eau, 1 g de sulfate de dextran, 4,85 mL de formamide, 1 mL de 2X SSC, porté à un volume total de 10 mL avec du DEPC traité eau); pour les autres sondes, la solution d'hybridation contenait 40 % de formamide (5 mL de DEPC-eau, 1 g de sulfate de dextran, 3,53 mL de formamide, 1 mL de 2X SSC, porté à un volume total de 10 mL avec de l'eau traitée au DEPC) . Pour BET42a et GAM42a, les cellules ont été incubées dans 50 µL de tampon d'hybridation avec des sondes à 46 °C pendant 1 h ; pour les autres sondes, les cellules ont été incubées pendant une nuit dans 50 µL de tampon d'hybridation avec des sondes FISH à 30 °C. Les cellules ont été lavées deux fois en utilisant une solution de lavage (2 ml de tampon SSC 20X, 7,06 ml de formamide, 10,94 ml d'eau traitée au DEPC) et remises en suspension dans du tampon SSC 2X. Un microlitre de cellules a été monté sur des tampons d'agarose à 1 % contenant du PBS et 5 µg mL-1 de DAPI pour l'imagerie. Les données d'imagerie ont été traitées à l'aide de FIJI v. 2.0.070.

Cinquante-quatre échantillons oraux de dauphins ont été sélectionnés pour le séquençage de l'amplicon du gène ARNr 16S. L'ADN génomique a été extrait d'échantillons oraux de dauphins et de 32 contrôles négatifs (PBS) à l'aide du kit microbien DNeasy UltraClean 96 (Qiagen Cat. #10196-4) en suivant les instructions du fabricant. La région V4 de l'ARNr 16S a été amplifiée à l'aide des amorces 515F et 806rB à l'aide du Platinum™ II HotStart PCR Master Mix (ThermoFisher Cat. #14000013). Les produits de PCR ont été regroupés à volume égal et purifiés sur gel. La purification finale a été effectuée à l'aide du kit Macherey-Nagel NucleoSpin Gel and PCR Clean-up, Mini Kit (Fisher, Cat. #740609). Les amplicons ont été séquencés sur la plateforme Illumina MiSeq avec des lectures appariées de 250 pb au Stanford Chan Zuckerberg Biohub Facility, ce qui a donné une profondeur de lecture médiane de 92 077 lectures (min : 50 772, max : 265 108).

Le démultiplexage a été effectué à l'aide de Bcl2Fastq v. 2 (Illumina, CA, USA). Les ASV ont été déduits à l'aide de DADA271 v. 1.16.0, en suivant les directives du "Big Data Workflow" (https://benjjneb.github.io/dada2/bigdata_paired.html). Les affiliations taxonomiques ont été attribuées en utilisant la base de données SILVA 138 SSU72 comme référence. Les lectures avant et arrière ont été réduites à 240 et 180 nt, respectivement. Ce pipeline a produit un total de 1 116 taxons et 5 339 751 lectures sur les 54 échantillons. Les ASV ont été analysés à l'aide de phyloseq v. 1.28.072.

Pour confirmer que notre pipeline d'extraction, d'amplification, de séquençage et d'analyse bioinformatique de l'ADN était en mesure d'identifier les membres de la famille des Neisseriaceae, nous avons effectué une expérience de pointe. Nous avons d'abord sélectionné un échantillon oral de dauphin contenant du RBS-A, tel que déterminé par microscopie à contraste de phase. Nous avons ensuite créé deux aliquotes de cet échantillon. Pour le premier aliquot, nous dopés dans les cellules d'une culture pure de S. muelleri à un rapport de 1:1. L'autre partie aliquote n'a pas été touchée. Ces deux échantillons, ainsi qu'une aliquote de la culture pure de S. muelleri (témoin positif), ont subi une extraction d'ADN, une amplification par PCR et un protocole de séquençage comme décrit ci-dessus. Les trois échantillons ont été séquencés dans une seule analyse Illumina MiSeq, qui n'était pas dans la même voie que les autres échantillons d'amplicon de cette étude. Notez qu'en amplifiant par PCR S. muelleri dans le même environnement de laboratoire que l'échantillon de contrôle négatif, puis en le séquençant sur la même voie, une certaine contamination croisée est à prévoir. La première fois que l'échantillon de contrôle négatif a été séquencé (en l'absence de cultures pures de S. muelleri au laboratoire), aucun amplicon de la famille Neisseriaceae n'a été détecté.

Pour obtenir des identités candidates pour RBS-As, nous avons utilisé une approche mini-métagénomique. Pour limiter la contamination par l'ADN étranger, les réactifs, les tubes et le PBS ont été traités avec 11,4 J cm-2 de lumière ultraviolette en suivant les directives de la réf. 72. Les RBS-A ont été visualisés à l'aide d'un microscope inversé Olympus IX70 (Olympus, Waltham, USA) avec un objectif 40X et une optique de modulation Hoffman. Un micromanipulateur Eppendorf TransferMan (Eppendorf, Hambourg, Allemagne, Cat. #5193000020) avec un microinjecteur SAS-10 a été utilisé pour capturer RBS-As avec des micropipettes Polar Body Biopsy (coudées à 30°, biseautées et polies avec un diamètre intérieur de 13– 15 μm) (Cooper Surgical, Målov, Danemark, Cat. #MPB-BP-30). Après l'acquisition d'un RBS-A ou d'une chaîne de RBS-As, la pointe de la micropipette a été transférée dans un tube de collecte contenant 1X PBS et écrasée dans le tube pour s'assurer que le RBS-A(s) a été déposé dans le tube ; cette précaution a été adoptée car le RBS-As collait fréquemment à la micropipette en verre et ne pouvait pas être délogé. Aucune cellule de dauphin n'a été capturée, bien que l'ADN acellulaire et les petites cellules non cibles de l'échantillon aient probablement été acquises en tant que contaminants avec les RBS-A en fonction de la propension de ces derniers à se fixer à d'autres espèces (Fig. 5e). Quatre tubes de RBS-A ont été collectés (noms d'échantillons RBS1-4), ainsi que quatre tubes de contrôle négatif (NEG1-4). Les témoins négatifs consistaient en des prélèvements de PBS provenant du même échantillon qui ne contenait aucune cellule visible et étaient par ailleurs traités de manière identique aux échantillons contenant du RBS-A.

L'ADN de chaque tube a été amplifié via MDA en utilisant le kit monocellulaire Repli-g (Qiagen, Hilden, Allemagne, Cat. #150343) selon le protocole du fabricant. L'ADN a été purifié à l'aide d'une colonne de centrifugation Zymo Clean and Concentrate (Zymo Research Corporation, Irvine, États-Unis, Cat. #D4013) et les bibliothèques ont été préparées à l'aide du kit Kapa Hyper Prep (Kapa Biosystems, Wilmington, États-Unis, Cat. #KK8504) au WM Keck Center for Comparative Functional Genomics à l'Université de l'Illinois, Urbana-Champaign. Les huit bibliothèques ont été séquencées à l'aide de la plateforme Illumina MiSeq 2 × 250 nt P2 V2. Les échantillons RBS-A RBS1, RBS2, NEG1 et NEG2 ont été regroupés et séquencés sur une seule voie qui a produit 11 371 243 paires de lecture, et les échantillons RBS3, RBS4, NEG3 et NEG4 ont été regroupés et séquencés sur 1,5 voies, produisant collectivement 19 615 690 paires de lecture. Les adaptateurs de séquençage ont été supprimés par calcul au Keck Center.

Les lectures des huit échantillons ont été co-assemblées à l'aide de SPAdes v. 3.11.173 avec les modes cellule unique (–sc) et prudent (–attention) spécifiés. Un total de 61 973 866 paires de lecture ont été utilisées pour l'assemblage, ce qui a donné 1 406 échafaudages ≥ 5 kbp de long avec une longueur totale de 17 438 233 bp et un N50 de 14 592 pour les échafaudages ≥ 5 kbp de long. Les gènes codant pour les protéines ont été identifiés à l'aide de Prodigal v. 2.6.274. La couverture moyenne par échafaudage a été calculée en cartographiant les lectures par échantillon par rapport au co-assemblage à l'aide de Bowtie2 v. 2.2.475, en utilisant la fonction de profondeur samtools v. 1.676 pour calculer la couverture de lecture par base et un script personnalisé pour calculer la moyenne par base lire la couverture par échafaudage.

Une recherche du gène amiC2 dans les bacs récupérés de l'expérience de mini-métagénomique a été effectuée en interrogeant l'alignement Pfam PF01520 sur les séquences protéiques de chaque génome, à l'aide de la suite HMMER v. 3.1b277.

Pour déterminer l'identité taxonomique des cellules séquencées, nous avons utilisé une approche résolue par le génome. L'attribution des échafaudages aux bacs du génome a été effectuée en utilisant les fréquences tétranucléotidiques de tous les échafaudages ≥ 5 kbp de long sur des fenêtres de 5 kbp, comme décrit dans la réf. 78. Les résultats ont été calculés et visualisés à l'aide du logiciel Databionics ESOM Tools v. 1.179, conduisant à la reconstruction de 18 bacs génomiques (Fig. 3 supplémentaire). Pour affiner les bacs, nous avons supprimé les échafaudages pour lesquels <50 % des clés étaient affectées au bac. Les échafaudages <5 kbp de long n'ont pas été regroupés. L'exhaustivité et la contamination par bac ont été évaluées à l'aide de CheckM v. 1.0.780. Pour évaluer la représentativité du binning des génomes séquencés, nous avons estimé le nombre de génomes procaryotes susceptibles d'être récupérés en recherchant dans l'assemblage du métagénome un ensemble de 16 gènes bactériens à copie unique (bSCG) supposés être présents dans chaque génome de un seul exemplaire81, à savoir les protéines ribosomiques L2, L3, L4, L5, L6, L14, L15, L16, L18, L22, L24, S3, S8, S10, S17 et S19. Alignements pour ces protéines (PF00181, PF00297, PF00573, PF00281, PF00347, PF00238, PF00828, PF00252, PF00861, PF00237, PF17136, PF00189, PF00410, PF00338, PF003 66, et PF00203) ont été obtenus à partir de la base de données Pfam82 (consultée en mars 2019) et interrogé sur notre ensemble de données à l'aide de la suite HMMER v. 3.1b277. Le nombre médian de chaque bSCG était de 10, ce qui suggère qu'environ 10 génomes procaryotes étaient représentés dans notre ensemble de données de séquençage. Dans le cas du génome d'intérêt de la famille des Alcaligenaceae, le gène de l'ARNr 16S a été étendu manuellement à partir de l'extrémité d'un échafaudage ; en utilisant bowtie2 v. 2.2.4, nous nous sommes assurés que les lectures supportaient la séquence finale.

L'identification taxonomique des bacs a posé un défi car les gènes d'ARNr 16S/18S n'étaient pas amplifiés/séquencés/assemblés de manière fiable, et les génomes étaient partiels avec peu de bSCG phylogénétiquement informatifs présents dans l'ensemble de données. Par conséquent, nous avons utilisé BLAST v. 2.2.3083 pour interroger tous les gènes codant pour les protéines de chaque génome par rapport à la base de données de protéines non redondantes du NCBI en utilisant une valeur e de 10 à 10 et des attributions taxonomiques ont été effectuées en fonction de la correspondance protéique la plus proche. Les attributions taxonomiques de la cellule génomique étaient considérées comme hautement probables si ≥ 50 % des meilleurs résultats BLAST provenaient d'un seul taxon et étaient considérées comme plausibles si < 50 % mais ≥ 33 % des meilleurs résultats BLAST provenaient d'un seul taxon.

Il existe de nombreuses approches par lesquelles on pourrait évaluer si un bac est "présent" dans un échantillon, chacune avec des seuils largement arbitraires. Nous nous sommes concentrés sur l'abondance relative de chaque bac par échantillon (tableau supplémentaire 4) car elle tient compte de la longueur de chaque bac et permet des comparaisons entre des échantillons avec différents nombres de paires de lecture16.

Les phylogénies à probabilité maximale de la famille des Alcaligenaceae ont été déduites à l'aide du gène ARNr 16S (Fig. 4a supplémentaire) et de la protéine ribosomique S3 (Fig. 4b supplémentaire) pour confirmer l'affiliation taxonomique de bin 16, qui a été récupérée de l'expérience de mini-métagénomique. Des séquences de gènes/protéines ont été acquises pour chaque genre caractérisé de la famille des Alcaligenaceae, comme indiqué sur le NCBI Taxonomy Browser (consulté en août 2022), lorsque de telles séquences étaient disponibles dans le système NCBI (certains genres ont peu ou pas de représentation génomique). Nous avons également effectué des requêtes BLAST83 v. 2.2.30 du gène bin 16 16S rRNA et de la protéine rpS3 par rapport aux bases de données nr/nt et nr (consultées en août 2022), respectivement, et avons inclus les 10 séquences les plus similaires. Les séquences du gène de l'ARNr 16S ont été alignées à l'aide de SINA84 v. 1.2.11, en utilisant la version 138.1 de la base de données SILVA SSU comme référence, et les colonnes contenant > 3 % d'espaces ou de lignes avec < 50 % de séquence ont été supprimées. Les séquences de la protéine rpS3 ont été alignées à l'aide de Clustal Omega85,86 v. 1.2.4 et les colonnes contenant > 5 % d'espaces ou de rangées avec < 50 % de séquence ont été supprimées. Les deux phylogénies ont été déduites à l'aide de PhyML87 v. 3.1 avec 1000 réplicats bootstrap, avec une sélection de modèle effectuée à l'aide d'une sélection de modèle intelligente88 (GTR+R pour le gène ARNr 16S et Q.yeast+G+I pour la protéine rpS3). Les arbres ont été visualisés à l'aide d'iTOL89 v. 6.

Quatre échantillons oraux de dauphins dont la présence de RBS a été confirmée ont été sélectionnés pour les efforts de culture. Pour chaque échantillon, un millilitre de PBS stérile a été ajouté à un tube Eppendorf de 1,5 ml contenant l'échantillon d'écouvillon oral. Pour la culture liquide, 600 µL de chaque échantillon ont été utilisés pour inoculer 3 mL de BSTSY90 (2,75 % (w/v) Tryptic Soy Broth, 0,4 % (w/v) extrait de levure, 10 % sérum bovin), SHI91 ou mSHI media (SHI additionné de 0,9 g/L de NaCl, 2,5 g/L de K2PO4, 0,84 g/L de NaHCO3, 0,17 g/L de CaCl2, 0,04 g/L de MgCl2•6H2O et 5 g/L de dextrose). BSTSY a été sélectionné pour son utilisation dans la culture réussie de bactéries (S. muelleri en particulier) à partir des cavités buccales de divers mammifères90. SHI a été sélectionné parce que ce milieu a été conçu pour soutenir des communautés à haute diversité dérivées de la microflore orale humaine. mSHI (SHI modifié) a été inclus en tant que version à salinité plus élevée de SHI dans le but d'imiter davantage les conditions qui pourraient être trouvées dans la cavité buccale des dauphins. L'inoculation a été répétée dans des conditions anaérobies dans une chambre anaérobie (COY Lab Products, Grass Lake, USA); notez que tous les échantillons ont été inévitablement exposés à l'oxygène atmosphérique avant la culture. Les cultures ont été incubées à 37 °C pour imiter la température corporelle des dauphins. Aucun RBS n'a été détecté dans les milieux liquides par dépistage visuel au microscope après ~ 24, ~ 48, ~ 72 et ~ 96 h. Pour la culture en surface solide, environ 103 à 104 cellules (vérifiées par microscopie pour contenir du RBS-A) ont été directement étalées sur des plaques de gélose BSTSY ou BHI-blood (milieu BHI additionné de 5 % de sang de mouton) et incubées à 37 °C avec ou sans oxygène, respectivement. Aucune colonie ne s'est développée sur les plaques BSTSY après 3 semaines d'incubation ; les colonies cultivées sur les plaques de sang BHI ont été criblées par microscopie et aucun RBS n'était visible. En revanche, un témoin de S. muelleri strié sur des plaques BSTSY a développé des colonies visibles après 1 à 2 jours d'incubation avec de l'oxygène à 37 ° C, et les colonies ont été vérifiées au microscope pour se composer de cellules avec la morphologie attendue de S. muelleri.

Compte tenu du caractère exploratoire de cette étude descriptive, la plupart des expériences de caractérisation des RBS ont été réalisées en une seule fois.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données de séquençage pour ce projet sont disponibles via NCBI BioProject PRJNA174530. Les lectures brutes de l'enquête sur les amplicons ont été déposées auprès de la SRA et sont associées aux échantillons biologiques SAMN32739817-69 et SAMN19012476. Les données de l'expérience de pointe sont associées aux BioSamples SAMN32869723-5. Les lectures brutes de l'expérience de génomique unicellulaire ont également été déposées auprès de la SRA ; les RBS capturés et les contrôles négatifs ont été physiquement dérivés d'un seul écouvillon oral représenté par BioSample SAMN19012476, tandis que les lectures des huit répétitions expérimentales (quatre RBS, quatre contrôles négatifs) sont chacune associées individuellement aux BioSamples SAMN19022663-SAMN19022670. Le co-assemblage d'échafaudages d'une longueur ≥ 5 kb provenant de l'expérience de génomique unicellulaire a été déposé en tant que projet Whole Genome Shotgun à DDBJ / ENA / GenBank sous l'accession JAHCSF000000000, après la suppression des séquences d'origine humaine. La version décrite dans cet article est JAHCSF010000000. Les bacs génomiques 2 à 5 et 7 à 18 de l'expérience de génomique unicellulaire ont été déposés dans le cadre d'un projet Whole Genome Shotgun à DDBJ / ENA / GenBank sous les accessions JAGYHI000000000-JAGYHX000000000. Les versions décrites dans cet article sont JAGYHI010000000-JAGYHX010000000. Le génome bin 1 (humain) n'a pas été déposé. Les échafaudages pour le génome bin6 (<100 000 nucléotides) ont été déposés en tant que soumission GenBank non génomique sous les numéros d'accès MZ126582-MZ126593. Les ensembles de données et bases de données publics utilisés dans cette étude sont les suivants : la version 138.1 de la base de données SILVA SSU a été utilisée comme référence pour attribuer des identités taxonomiques aux ASV. Les bases de données NCBI nr/nt, nr et taxonomique (consultées en août 2022) ont été utilisées pour obtenir des séquences de gènes d'ARNr 16S (n = 77) et des séquences de protéines ribosomales S3 (n = 63) pour des représentants de genres de la famille des Alcaligenaceae. Les numéros d'accès NCBI pour ces séquences sont disponibles dans les Fig. 4 et 5, respectivement. Enfin, nous avons effectué des analyses avec des alignements provenant de la base de données Pfam82. L'alignement Pfam PF01520 a été utilisé pour rechercher des bacs génomiques pour les protéines AmiC2 (consulté en août 2022). Les alignements Pfam suivants ont été utilisés pour rechercher 16 gènes bactériens à copie unique (consultés en mars 2019) : PF00181, PF00297, PF00573, PF00281, PF00347, PF00238, PF00828, PF00252, PF00861, PF00237, PF17136, PF 00189, PF00410, PF00338, PF00366 , et PF00203.

Leeuwenhoek, AV Observations, communiquées à l'éditeur par M. Antony van Leewenhoeck, dans une lettre hollandaise du 9 octobre. 1676. ici anglais'd : concernant les petits animaux par lui observés dans la pluie-bien-mer-et l'eau de neige ; comme aussi dans l'eau où le poivre avait été infusé. Philos. Trans. R. Soc. Londres. 12, 821–831 (1677).

Google Scholar

Nikitin, D., Vasilyeva, L. & Lokhmacheva, R. Dans les formes nouvelles et rares de micro-organismes du sol (Nauka, Moscou, 1966).

Vasilyeva, L. Stella, un nouveau genre de prothécobactéries du sol, avec des propositions pour Stella humosa sp. nov. et Stella vacuolata sp. nov. Int. J. Syst. Évolut. Microbiol. 35, 518-521 (1985).

Google Scholar

Dworkin, M. Introduction aux myxobactéries. Dans Prokaryotic Development (eds YV Brun & LJ Shimkets) (ASM Press, Washington, DC, 1999, pp 219–242).

Voelz, H. & Reichenbach, H. Structure fine des fructifications de Stigmatella aurantiaca (Myxobacterales). J. Bactériol. 99, 856–866 (1969).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Young, KD La valeur sélective de la forme bactérienne. Microbiol Mol. Biol. Rév. 70, 660–703 (2006).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Young, KD Morphologie bactérienne : pourquoi avoir des formes différentes. Courant. Avis. Microbiol. 10, 596–600 (2007).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Fenno, L., Yizhar, O. & Deisseroth, K. Le développement et l'application de l'optogénétique. Annu Rev. Neurosci. 34, 389–412 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ishino, Y., Krupovic, M. & Forterre, P. Histoire de CRISPR-Cas de la rencontre avec une mystérieuse séquence répétée à la technologie d'édition du génome. J. Bactériol. 200, e00580–17 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Anantharaman, K. et al. Des milliers de génomes microbiens mettent en lumière les processus biogéochimiques interconnectés dans un système aquifère. Nat. Commun. 7, 13219 (2016).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brown, CT et al. Biologie inhabituelle dans un groupe comprenant plus de 15 % du domaine Bactéries. Nature 523, 208-211 (2015).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Castelle, CJ et al. L'expansion génomique du domaine archaea met en évidence les rôles des organismes de nouveaux phylums dans le cycle anaérobie du carbone. Courant. Biol. 25, 690–701 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Rinke, C. et al. Aperçu de la phylogénie et du potentiel de codage de la matière noire microbienne. Nature 499, 431–437 (2013).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Burstein, D. et al. Nouveaux systèmes CRISPR-Cas à partir de microbes non cultivés. Nature 542, 237-241 (2017).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Donia, MS et al. Une analyse systématique des grappes de gènes biosynthétiques dans le microbiome humain révèle une famille commune d'antibiotiques. Cellule 158, 1402–1414 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dudek, NK et al. Nouvelle diversité microbienne et potentiel fonctionnel dans le microbiome oral des mammifères marins. Courant. Biol. 27, 3752–3762.e3756 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wrighton, KC et al. Fermentation, métabolisme de l'hydrogène et du soufre dans plusieurs phylums bactériens non cultivés. Sciences 337, 1661-1665 (2012).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Wu, D. et al. Une encyclopédie génomique axée sur la phylogénie des bactéries et des archées. Nature 462, 1056-1060 (2009).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hug, LA et al. Une nouvelle vision de l'arbre de vie. Nat. Microbiol 1, 16048 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Pilhofer, M., Ladinsky, MS, McDowall, AW & Jensen, GJ Bacterial TEM : nouvelles perspectives de la cryo-microscopie. Méthodes Cell Biol. 96, 21-45 (2010).

Article PubMed Google Scholar

Moissl, C., Rachel, R., Briegel, A., Engelhardt, H. & Huber, R. La structure unique de l'archée 'hami', des appendices cellulaires très complexes avec des crochets nano-grappins. Mol. Microbiol 56, 361-370 (2005).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tocheva, EI, Li, Z. & Jensen, GJ Cryotomographie électronique. Cold Spring Harb. Perspective. Biol. 2, a003442 (2010).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Bik, EM et al. Les mammifères marins abritent des microbiotes uniques façonnés par la mer et pourtant distincts de celle-ci. Nat. Commun. 7, 10516 (2016).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Walsby, AE Une bactérie carrée. Nature 283, 69–71 (1980).

Annonces d'article Google Scholar

Oren, A., Ventosa, A., Gutierrez, MC et Kamekura, M. Haloarcula quadrata sp. nov., un archéon carré et mobile isolé d'une mare de saumure du Sinaï (Égypte). Int. J. Syst. Bactériol. 49, 1149-1155 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Xu, Y., Zhou, P. & Tian, ​​X. Caractérisation de deux nouvelles archées haloalcaliphiles Natronorubrum bangense gen. nov., sp. nov. et Natronorubrum tibetense gen. nov., sp. nov. Int. J. Syst. Bactériol. 49, 261-266 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Weber, PM et al. Fission médiée par FtsZ d'un symbiote bactérien cuboïde. iScience 25, 103552 (2022).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Alam, M., Claviez, M., Oesterhelt, D. & Kessel, M. Flagelles et comportement de motilité des bactéries carrées. EMBO J. 3, 2899-2903 (1984).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Horner, RA Un guide taxonomique de certains phytoplanctons marins communs (Biopress Ltd., Bristol, Angleterre, 2002).

Zinder, SH & Dworkin, M. Diversité morphologique et physiologique. Dans Les Procaryotes. A Handbook on the Biology of Bacteria 3rd edn (eds Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K.-H. & Stackebrandt, E.) pp 185–220 (Springer, New York, 2006 ).

Leisch, N. et al. Croissance en largeur et positionnement longitudinal de l'anneau FtsZ chez un symbiote gammaprotéobactérien. Courant. Biol. 22, R831–R832 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Leisch, N. et al. Division asynchrone par FtsZ non cyclique chez le symbiote gammaprotéobactérien de Robbea hypermnestra. Nat. Microbiol. 2, 16182 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Pende, N. et al. Croissance cellulaire polarisée par l'hôte chez les symbiotes animaux. Courant. Biol. 28, 1039–1051.e1035 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McCowan, RP, Cheng, KJ & Costerton, JW Colonisation d'une partie de la langue bovine par des bactéries filamenteuses inhabituelles. Appl. Environ. Microbiol. 37, 1224-1229 (1979).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramond, E., Maclachlan, C., Clerc-Rosset, S., Knott, GW et Lemaitre, B. Division cellulaire par scission longitudinale chez l'endosymbiote d'insecte Spiroplasma poulsonii. mBio 7, e00881–16 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Foissner, W. Kentrophoros (Ciliophora, Karyorelictea) a des vestiges oraux : une réinvestigation de K-fistulosus (Faure-Fremiet, 1950) par imprégnation au protargol. Cambre. Protistenkd 146, 165-179 (1995).

Article Google Scholar

Seah, BKB et al. Symbiotes oxydant le soufre sans gènes canoniques pour la fixation autotrophe du CO2. mBio 10, e01112–e01119 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shi, H., Colavin, A., Lee, TK & Huang, KC Strain Library Imaging Protocol pour la microscopie unicellulaire automatisée à haut débit de grandes collections bactériennes disposées sur des plaques multipuits. Nat. Protocole 12, 429–438 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hedlund, BP & Kuhn, DA Les genres Simonsiella et Alysiella. Dans The Prokaryotes (eds Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K.-H. & Stackebrandt, E.) pp. 828–839 (Springer, New York, 2006).

Limon, JJ, Skalski, JH & Underhill, DM Champignons commensaux dans la santé et la maladie. Microbe hôte cellulaire 22, 156–165 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Katayama, T. et al. L'isolement d'un membre du phylum candidat 'Atribacteria' révèle une structure de membrane cellulaire unique. Nat. Commun. 11, 6381 (2020).

Lyons, NA & Kolter, R. Sur l'évolution de la multicellularité bactérienne. Courant. Avis. Microbiol. 24, 21-28 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Diebolder, CA, Koster, AJ & Koning, RI Repousser les limites de résolution dans la cryotomographie électronique des structures biologiques. J. Microsc. 248, 1–5 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Martynowycz, MW, Clabbers, MTB, Unge, J., Hattne, J. & Gonen, T. Analyse comparative de l'épaisseur idéale de l'échantillon en cryo-EM. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 118, e2108884118 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hospenthal, MK, Costa, TRD et Waksman, G. Un guide complet sur la biogenèse des pilus chez les bactéries Gram-négatives. Nat. Rév. Microbiol. 15, 365–379 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Proft, T. & Baker, EN Pili dans les bactéries Gram-négatives et Gram-positives - structure, assemblage et leur rôle dans la maladie. Cellule Mol. Vie Sci. 66, 613–635 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Galaz-Montoya, JG & Ludtke, SJ L'avènement de la biologie structurale in situ par tomographie cryo-électronique à une seule particule. Biophys. Rep. 3, 17–35 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J. et Mannella, C. Amincissement par faisceau d'ions focalisé d'échantillons biologiques congelés et hydratés pour la microscopie cryoélectronique. Nat. Méthodes 4, 215–217 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wu, GH et al. Microscopie Cryo-corrélative 3D multi-échelles pour cellules vitrifiées. Structure 28, 1231–1237.e1233 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Apprill, A., Mooney, TA, Lyman, E., Stimpert, AK & Rappe, MS Les baleines à bosse abritent une combinaison de bactéries cutanées spécifiques et variables. Environ. Microbiol. Rep. 3, 223–232 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Luef, B. et al. Diverses cellules bactériennes ultra-petites non cultivées dans les eaux souterraines. Nat. Commun. 6, 6372 (2015).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Wanger, G., Onstott, TC & Southam, G. Étoiles du sous-sol profond terrestre : un nouveau morphotype bactérien en forme d'étoile provenant d'une mine de platine sud-africaine. Géobiologie 6, 325–330 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Augmentation, S. et al. Evolution de la division longitudinale chez les bactéries multicellulaires de la famille des Neisseriaceae. Nat. Commun. Rev.13, 4853 (2022).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Steed, PA Simonsiellaceae fam. nov. avec caractérisation de Simonsiella crassa et Alysiella filiformis. J. Gen. Microbiol. 29, 615–624 (1962).

Article CAS PubMed Google Scholar

Fagan, RP & Fairweather, NF Biogenèse et fonctions des couches S bactériennes. Nat. Rév. Microbiol. 12, 211-222 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sleytr, UB et al. Les couches S comme trousse à outils pour les applications nanobiotechnologiques. Microbiol FEMS. Lett. 267, 131–144 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wildhaber, I. & Baumeister, W. L'enveloppe cellulaire de Thermoproteus tenax : structure tridimensionnelle de la couche de surface et son rôle dans le maintien de la forme. EMBO J. 6, 1475–1480 (1987).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Danev, R. & Baumeister, W. Élargir les limites de cryo-EM avec des plaques de phase. Courant. Avis. Structure. Biol. 46, 87–94 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Castelle, CJ & Banfield, JF De nouveaux groupes microbiens majeurs élargissent la diversité et modifient notre compréhension de l'arbre de la vie. Cellule 172, 1181-1197 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ponomarova, O. & Patil, KR Interactions métaboliques dans les communautés microbiennes : démêler le nœud gordien. Courant. Avis. Microbiol. 27, 37–44 (2015).

Article PubMed Google Scholar

Mastronarde, DN SerialEM : un programme pour l'acquisition automatisée de séries d'inclinaison sur les microscopes Tecnai utilisant la prédiction de la position de l'échantillon. Microsc. Microanal. 9, 1182-1183 (2003).

Annonces d'article Google Scholar

Kremer, JR, Mastronarde, DN & McIntosh, JR Visualisation par ordinateur de données d'images tridimensionnelles à l'aide d'IMOD. J. Structure. Biol. 116, 71–76 (1996).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tang, G. et al. EMAN2 : une suite extensible de traitement d'images pour la microscopie électronique. J. Structure. Biol. 157, 38–46 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Galaz-Montoya, JG, Flanagan, J., Schmid, MF et Ludtke, SJ Tomographie à particules uniques dans EMAN2. J. Structure. Biol. 190, 279-290 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Galaz-Montoya, JG et al. Algorithmes d'alignement et correction CTF par particule pour la tomographie cryo-électronique à une seule particule. J. Structure. Biol. 194, 383–394 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, M. et al. Réseaux de neurones convolutifs pour l'annotation automatisée de cryo-tomogrammes cellulaires. Nat. Méthodes 14, 983–985 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF Chimera - un système de visualisation pour la recherche exploratoire et l'analyse. J. Comput. Chim. 25, 1605-1612 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Danita, C., Chiu, W. & Galaz-Montoya, JG Annotation manuelle efficace des tomogrammes électroniques cryogéniques à l'aide d'IMOD. Protocole STAR 3, 101658 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Skinner, SO, Sepulveda, LA, Xu, H. & Golding, I. Mesure du nombre de copies d'ARNm dans des cellules Escherichia coli individuelles à l'aide d'une hybridation in situ fluorescente à une seule molécule. Nat. Protocole 8, 1100–1113 (2013).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Schindelin, J. et al. Fidji : une plate-forme open source pour l'analyse d'images biologiques. Nat. Méthodes 9, 676–682 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Callahan, BJ et al. DADA2 : inférence d'échantillons haute résolution à partir des données d'amplicon Illumina. Nat. Méthodes 13, 581–583 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Woyke, T. et al. Décontamination des réactifs MDA pour l'amplification du génome entier d'une seule cellule. PLoS One 6, e26161 (2011).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bankevitch, A. et al. SPAdes : un nouvel algorithme d'assemblage du génome et ses applications au séquençage unicellulaire. J. Comput. Biol. 19, 455–477 (2012).

Article MathSciNet CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hyatt, D. et al. Prodigue : reconnaissance des gènes procaryotes et identification du site d'initiation de la traduction. BMC Bioinformatics 11, 119 (2010).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Langmead, B. & Salzberg, SL Alignement rapide en lecture lacunaire avec Bowtie 2. Nat. Méthodes 9, 357–359 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, H. et al. Le format Sequence Alignment/Map et SAMtools. Bioinformatique 25, 2078-2079 (2009).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Eddy, SR Recherches accélérées de profils HMM. Calcul PLoS. Biol. 7, e1002195 (2011).

Article ADS MathSciNet CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dick, GJ et al. Analyse à l'échelle communautaire des signatures de séquences de génomes microbiens. Génome Biol. 10, R85 (2009).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Ultsch, A. & Mörchen, F. ESOM-Maps : Outils de regroupement, de visualisation et de classification avec SOM émergent Vol. 46 (Université de Marbourg, 2005).

Parks, DH, Imelfort, M., Skennerton, CT, Hugenholtz, P. & Tyson, GW CheckM : évaluation de la qualité des génomes microbiens récupérés à partir d'isolats, de cellules individuelles et de métagénomes. Génome Res. 25, 1043-1055 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hug, LA et al. Les analyses génomiques de la communauté limitent la distribution des traits métaboliques dans le phylum Chloroflexi et indiquent des rôles dans le cycle du carbone des sédiments. Microbiome 1, 22 (2013).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Finn, RD et al. La base de données des familles de protéines Pfam : vers un avenir plus durable. Nucleic Acids Res. 44, D279–D285 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ Outil de recherche d'alignement local de base. J. Mol. Biol. 215, 403–410 (1990).

Article CAS PubMed Google Scholar

Pruesse, E., Peplies, J. & Glöckner, FO SINA : alignement précis de séquences multiples à haut débit de gènes d'ARN ribosomal. Bioinformatique 28, 1823–1829 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Goujon, M. et al. Un nouveau cadre d'outils d'analyse bioinformatique à l'EMBL–EBI. Nucleic Acids Res. 38, W695–W699 (2010).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sievers, F. et al. Génération rapide et évolutive d'alignements de séquences multiples de protéines de haute qualité à l'aide de Clustal Omega. Mol. Syst. Biol. 7, 539 (2011).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Guindon, S. et al. Nouveaux algorithmes et méthodes pour estimer les phylogénies à vraisemblance maximale : évaluer les performances de PhyML 3.0. Syst. Biol. 59, 307–321 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lefort, V., Longueville, J.-E. & Gascuel, O. SMS : sélection intelligente de modèles en PhyML. Mol. Biol. Évol. 34, 2422-2424 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Letunic, I. & Bork, P. Interactive Tree Of Life (iTOL) v5 : un outil en ligne pour l'affichage et l'annotation d'arbres phylogénétiques. Nucleic Acids Res. 49, W293–W296 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kuhn, DA, Gregory, DA, Buchanan, GE Jr., Nyby, MD & Daly, KR Isolement, caractérisation et taxonomie numérique des souches de Simonsiella des cavités buccales des chats, des chiens, des moutons et des humains. Cambre. Microbiol. 118, 235-241 (1978).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tian, ​​Y. et al. Utilisation du profilage DGGE pour développer un nouveau milieu de culture adapté aux communautés microbiennes orales. Mol. Oral. Microbiol. 25, 357–367 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meheust, R., Burstein, D., Castelle, CJ & Banfield, JF La distinction des bactéries CPR des autres bactéries en fonction de la teneur en famille de protéines. Nat. Commun. 10, 4173 (2019).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Nous remercions les membres du laboratoire Relman pour des discussions perspicaces, Katharine Ng et Brian Yu pour leur aide dans les tentatives de capture de RBS-As à l'aide de la microdissection par capture laser et de la microfluidique, respectivement, Melissa Clark pour son aide à la coloration de Gram, Michael Schmid pour l'analyse de la surface périodique couvrant sur RBS-As, et en particulier Celeste Parry et ses collègues du US Navy Marine Mammal Program à San Diego, en Californie, pour la collecte d'échantillons oraux de dauphins. Ce travail a été soutenu par la subvention NIH P41GM103832 (WC), une bourse postdoctorale James S. McDonnell (HS), le Fonds scientifique autrichien (TV, SB) et la dotation Thomas C. et Joan M. Merigan de l'Université de Stanford (DAR) . KCH et DAR sont les enquêteurs de Chan Zuckerberg Biohub.

Natasha K. Dudek

Adresse actuelle : Quantori, Cambridge, MA, 02142, États-Unis

Mégane Mayer

Adresse actuelle : Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School, Boston, MA, 02115, États-Unis

Département de médecine, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, Californie, 94305, États-Unis

Natasha K. Dudek et David A. Relman

Département d'écologie et de biologie évolutive, Université de Californie, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, 95064, États-Unis

Natasha K. Dudek

Département de bioingénierie, Université de Stanford, Stanford, CA, 94305, États-Unis

Jesus G. Galaz-Montoya, Handuo Shi, Cristina Danita, Gong-Her Wu, Kerwyn Casey Huang & Wah Chiu

Département de microbiologie et d'immunologie, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, CA, 94305, États-Unis

Handuo Shi, Arianna I. Celis, Kerwyn Casey Huang, Wah Chiu et David A. Relman

Division de CryoEM et Bioimagerie, SSRL, SLAC National Accelerator Laboratory, Menlo Park, CA, 94025, USA

Megan Mayer & Wah Chiu

Département d'écologie fonctionnelle et évolutive, Groupe de biologie cellulaire environnementale, Université de Vienne, Vienne, Autriche

Tobias Viehboeck & Silvia Bulgheresi

Division d'écologie microbienne, Centre de microbiologie et de science des systèmes environnementaux et École doctorale d'écologie et d'évolution de Vienne, Université de Vienne, Vienne, Autriche

Tobias Viehboeck

Département d'obstétrique et de gynécologie, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, CA, 94305, États-Unis

Barry Behr

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, Californie, 94158, États-Unis

Kerwyn Casey Huang et David A. Relman

Section des maladies infectieuses, Veterans Affairs Palo Alto Health Care System, Palo Alto, CA, 94304, États-Unis

David A. Relman

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Conceptualisation : NKD, KCH, DAR Méthodologie et investigation : NKD, JGG-M., HS, MM, CD, AIC, G.-HW, TV, SB, BB, KCH, WC, DAR Analyse formelle : NKD, JGG-M ., HS, CD Visualisation : NKD, JGG-M., HS, CD Writing—ébauche originale : le manuscrit a été principalement écrit par NKD et JGG-M. basé sur le projet original de NKD, avec des révisions par tous les autres auteurs. Rédaction — révision et édition : tous les auteurs. Encadrement : KCH, WC, DAR

Correspondance à David A. Relman.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Brian Hedlund et les autres examinateurs, anonymes, pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Dudek, NK, Galaz-Montoya, JG, Shi, H. et al. Structures bactériennes rectangulaires précédemment non caractérisées dans la bouche du dauphin. Nat Commun 14, 2098 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37638-y

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Reçu : 01 novembre 2021

Accepté : 23 mars 2023

Publié: 13 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-37638-y

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