Base structurelle des modes de liaison des ligands de l'EAAT2 humain

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 3329 (2022) Citer cet article

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Dans le système nerveux central (SNC), les transporteurs d'acides aminés excitateurs (EAAT) interviennent dans l'absorption du glutamate, un neurotransmetteur excitateur, et maintiennent ses faibles concentrations dans la fente synaptique pour éviter la cytotoxicité neuronale. Le dysfonctionnement des EAAT peut entraîner de nombreuses maladies psychiatriques. Nous rapportons ici les structures cryo-EM de l'EAAT2 humain dans une conformation tournée vers l'intérieur, en présence de substrat glutamate ou d'inhibiteur sélectif WAY-213613. Le glutamate est coordonné par de nombreuses liaisons hydrogène et stabilisé par HP2. L'inhibiteur WAY-213613 occupe une poche de liaison similaire à celle du substrat glutamate. Lors de l'association avec le WAY-213613, le HP2 subit un changement conformationnel substantiel et stabilise à son tour la liaison de l'inhibiteur en formant des interactions hydrophobes. Des expériences électrophysiologiques expliquent que le S441 unique joue un rôle central dans la liaison de hEAAT2 avec le glutamate ou WAY-213613, et que le cluster I464-L467-V468 agit comme un déterminant structurel clé pour l'inhibition sélective de ce transporteur par WAY-213613.

Le glutamate est le neurotransmetteur excitateur prédominant, qui joue un rôle clé dans le développement du système nerveux central des mammifères et participe au fonctionnement normal du cerveau, comme l'intégration de l'apprentissage, de la cognition et de la mémoire1. De plus, un excès de glutamate peut entraîner une excitotoxicité, qui peut tuer les cellules neuronales par une stimulation excessive des récepteurs du glutamate2. Ainsi, il est crucial de maintenir de faibles concentrations de glutamate dans les fluides extracellulaires. Les EAAT sont connus comme des transporteurs d'acides aminés excitateurs comprenant cinq sous-types (EAAT1-EAAT5), qui sont responsables de l'élimination du glutamate de la fente synaptique en se liant et en transportant rapidement les glutamates dans la pré-synapse ou les astrocytes, ce qui contribue à la terminaison de l'activité synaptique et à la clairance du glutamate extracellulaire potentiellement cytotoxique3. Parmi les cinq EAAT, l'EAAT2 humaine (hEAAT2) est principalement exprimée dans les astrocytes et serait responsable de 90 à 95 % de l'absorption de glutamate dans le cerveau antérieur par un mécanisme élévateur3,4. Par conséquent, hEAAT2 peut maintenir le glutamate extracellulaire à de faibles niveaux dans la fente synaptique, qui est l'un des EAAT les plus importants pour protéger les neurones5,6. Une carence en hEAAT2 provoque la mort neuronale progressive et des maladies psychiatriques ou neurologiques, notamment le trouble dépressif majeur, l'épilepsie, la maladie d'Alzheimer, les accidents vasculaires cérébraux, la maladie de Parkinson et la sclérose latérale amyotrophique (SLA), et donc hEAAT2 représente une cible thérapeutique potentielle6,7,8.

Les EAAT sont structurellement similaires à l'homologue archéen GltPh, qui sont tous des homotrimères composés de trois protomères identiques9,10. Le protomère individuel a huit hélices transmembranaires (TM 1–8) et deux boucles en épingle à cheveux (HP) organisées en deux domaines : le domaine d'échafaudage comprend TM1, 2, 4 et 5, qui est responsable de la stabilisation du domaine de transport ; le domaine de transport comprend les TM 3, 6, 7 et 8, HP1 et HP2. Des études antérieures ont montré que la sous-unité individuelle des EAAT peut transporter le substrat indépendamment11,12,13, et que le site de liaison au substrat est constitué par la région centrale déroulée de TM7 (motif NMDGT), TM8 et les pointes de HP1 et HP23,9.

Les structures des homologues archéens (GltPh4,9,10,14,15,GltTk16,17,18) et de quatre transporteurs SLC1 humains (hEAAT119, hEAAT320, hASCT121 et hASCT222,23,24,25) ont été résolues et partagent conservation élevée des séquences dans la poche de liaison au ligand, y compris TM7, TM8, HP1 et HP2. Cependant, il est toujours souhaitable de déterminer la structure de hEAAT2, car il partage de faibles identités de séquence avec ces homologues (34 % d'identité de séquence avec GltPh et GltTk, 50 % d'identité de séquence avec hEAAT1 et hEAAT3, 42 % et 39 % d'identité de séquence avec hASCT1 et hASCT2, respectivement). WAY-213613 est un inhibiteur puissant et hautement sélectif pour hEAAT2 (IC50 est de 85 nM), qui a une affinité 59 fois et 44 fois supérieure à celles de hEAAT1 et hEAAT3 (IC50 est de 5 et 3,8 μM, respectivement)26. Cependant, le mécanisme selon lequel WAY-213613 inhibe de manière hautement sélective le transport du glutamate par hEAAT2 reste insaisissable.

Nous rapportons ici deux structures cryo-EM de hEAAT2 trimérique en complexe avec du glutamate et WAY-213613, respectivement. Les deux structures sont déterminées à une résolution de 3,4 Å et stabilisées à l'état conformationnel orienté vers l'intérieur. Ces structures élucident la base structurelle de la façon dont le substrat est reconnu par hEAAT2 et comment le WAY-213613 inhibe sélectivement le transporteur. Les expériences électrophysiologiques ont été réalisées et ont confirmé nos spéculations.

En plus de la médiation du transport des acides aminés excitateurs, hEAAT2 agit également comme un canal sélectif pour les anions27,28,29. Le courant associé à hEAAT2 comprend trois composants : le courant anionique induit par le glutamate, le courant de fuite anionique dépendant de Na+ et le courant de transport du glutamate30,31. Les inhibiteurs compétitifs peuvent bloquer les trois composants du courant32. Pour mieux comprendre les sites de liaison du glutamate et des inhibiteurs, nous avons effectué des expériences électrophysiologiques en utilisant la technique du patch-clamp sur cellules entières dans des conditions similaires à celles décrites précédemment. Conformément aux rapports précédents25,31,33, l'application de glutamate de substrat a augmenté les amplitudes des courants de fuite d'anions (Fig. 1a supplémentaire). En revanche, le WAY-213613 a pu bloquer la conductance de fuite d'anions (Fig. 1b supplémentaire). L'activation des courants de fuite d'anions médiés par le glutamate et l'inhibition de ceux par WAY-213613 étaient toutes deux dépendantes de la dose et pouvaient être intégrées dans une équation de type Michaelis – Menten, donnant un Km de 30 ± 2,5 μM pour le glutamate et un Ki apparent de 0,07 ± 0,03 μM pour WAY-213613 (Fig. 1a, b), qui sont tous deux cohérents avec les rapports précédents26,34.

une relation dose-réponse de glutamate pour le courant associé à hEAAT2 en présence de 3 μM, 10 μM, 30 μM, 100 μM, 300 μM et 1000 μM de glutamate. Les tailles d'échantillon (n) testées de faibles à fortes concentrations sont de 5, 5, 5, 5, 5 et 8 cellules. Les lignes représentent le meilleur ajustement à une équation de type Michaelis-Menten avec un Km apparent moyen de 30 ± 2,5 μM pour le glutamate. Les courants ont été normalisés au courant maximal enregistré après l'application de 1000 μM de glutamate. b Relation dose-réponse WAY-213613 pour le courant associé à hEAAT2 en présence de 0,01 μM, 0,03 μM, 0,1 μM, 0,3 μM, 1 μM, 3 μM et 30 μM WAY-213613. Les tailles d'échantillon (n) testées de faibles à fortes concentrations sont de 5, 5, 5, 5, 5, 5 et 10 cellules. Les lignes représentent le meilleur ajustement à une équation de type Michaelis-Menten avec un Ki apparent moyen de 0,07 ± 0,03 μM pour WAY-213613. Les courants ont été normalisés au courant maximal enregistré après application de 30 μM de WAY-213613. Dans les figures a et b, toutes les expériences ont été exécutées à 0 mV et les données ont été présentées sous forme de valeurs moyennes ± SD. c Représentation en dessin animé de l'homotrimère hEAAT2 vu du cytoplasme. Les lignes pleines divisent l'homotrimère en trois protomères simples et les lignes courbes en pointillés délimitent le domaine de transport de chaque protomère. Chaque protomère est constitué du domaine d'échafaudage (blé) et du domaine de transport (vert pâle). Les éléments structurels HP1 (bleu) et HP2 (rouge) sont mis en évidence. Le même jeu de couleurs est adopté dans tout le manuscrit, sauf indication contraire. d Structure d'un seul protomère vu du plan de la membrane. Le domaine de transport, et HP1 et HP2 sont représentés sous forme de bande dessinée tandis que le domaine d'échafaudage est représenté sous forme de cylindres. Dans les figures c et d, les limites de la membrane cellulaire sont représentées par des lignes grises et les informations de dimension sont étiquetées à côté des flèches.

Pour élucider les caractéristiques structurelles de hEAAT2, nous avons exprimé et purifié la hEAAT2 de type sauvage dans des cellules HEK293 (Fig. 1c supplémentaire). Les études cryo-EM ont été réalisées en présence du substrat glutamate et de l'inhibiteur WAY-213613, générant deux cartes de 3, 4 Å (Figures supplémentaires 2, 3 et Tableau supplémentaire 1). hEAAT2 a une structure homotrimère ressemblant à d'autres EAAT (hEAAT119 et hEAAT320) et ses orthologues (hASCT121 et hASCT222,23,24,25) ou paralogues (GltPh4,9,10,14,15 et GltTk16,18). Chaque sous-unité du trimère hEAAT2 a huit hélices transmembranaires (TM1-TM8) et une paire d'épingles à cheveux en spirale demi-transmembranaires (HP1, HP2) (Fig. 1c, d). Ces structures secondaires s'assemblent en un domaine d'échafaudage (TM1, 2, 4, 5 et deux inserts de feuillets bêta extracellulaires dans TM4b et TM4c) et un domaine de transport (TM3, 6–8 et HP1, HP2), respectivement. Chacun des deux domaines présente une double symétrie interne reconnaissable. Le domaine d'échafaudage de chaque protomère individuel se connecte à ceux des deux autres protomères, ce qui constitue une intégration assez stable au niveau de la partie centrale de l'homotrimère. Et le domaine de transport est séparé par son propre domaine d'échafaudage et distribué comme un triangle équilatéral (Fig. 1c). Dans nos structures hEAAT2, le HP1 est situé approximativement parallèlement au plan membranaire et presque entièrement exposé dans le cytoplasme (Fig. 1d). La contrepartie HP2 est intégrée dans la bicouche lipidique et la pointe HP2 est accessible au solvant du côté cytoplasmique (Fig. 1d). Le hEAAT2 a une longueur d'environ 97 Å et une largeur d'environ 100 Å le long de la normale au plan de la membrane et d'environ 70 Å le long de la normale de la membrane (Fig. 1c, d).

En raison de la haute résolution de deux structures résolues de hEAAT2, de nombreuses densités en forme de bande réparties autour de la protéine ont été observées (Fig. 4a, b supplémentaires). Les lipides les plus abondants sont situés entre les deux sous-unités adjacentes du trimère hEAAT2, ce qui est similaire à la distribution des lipides trouvés dans les structures de hASCT2 (6RVX)23 ou GltPh (6 × 15)14. Lors de la préparation des échantillons de hEAAT2, nous avons constaté que le CHS avait un impact significatif sur l'homogénéité et le profil SEC de hEAAT2, comme un scénario similaire rapporté dans hASCT220. En fait, les densités ressemblant au CHS sont déterminées comme étant situées dans la cavité formée par TM3, TM6 et TM8 au niveau du lobe interne de la membrane plasmique (Fig. 4c, d supplémentaire), qui a également été trouvée dans les cartes de hEAAT335 et GltPh14 (6S3Q et 6 × 15, respectivement), suggérant que le cholestérol pourrait être corrélé à l'assemblage ou à la fonction des transporteurs SLC1 et de leurs homologues.

Les EAAT de mammifères transportent le l-glutamate, le l-aspartate et le d-aspartate avec des affinités micromolaires apparentes3. Afin de comprendre comment hEAAT2 se lie au glutamate, nous avons déterminé la structure de hEAAT2 en complexe avec le glutamate (hEAAT2Glu) à une résolution de 3, 4 Å (Fig. 2 supplémentaire). Dans la structure hEAAT2Glu, le glutamate est scellé par les extrémités des boucles HP1 et HP2 (Fig. 2a, b). En utilisant le domaine d'échafaudage comme référence, nous avons effectué une comparaison structurelle entre les structures hEAAT1Asp (PDB ID: 5LLU) 19 et hEAAT2Glu tournées vers l'extérieur et avons constaté que le domaine de transport de la structure hEAAT2Glu est déplacé d'environ 17 Å à travers la membrane vers cytoplasmique côté par rapport à celui de hEAAT1Asp, ce qui suggère que la structure de hEAAT2Glu est déterminée dans une conformation tournée vers l'intérieur (Fig. 5 supplémentaire). Un tel changement conformationnel du domaine de transport est également cohérent avec les observations précédentes24. A l'emplacement des résidus polaires hautement conservés d'une région déroulée de TM7 (motif NMDGT10), le TM8 amphipathique forme un large éventail d'interactions fortes (principalement des interactions de liaison hydrogène) avec le glutamate pour stabiliser la liaison de ce dernier au hEAAT2 (Fig. 2a). Plus précisément, le groupe α-carboxyle du substrat glutamate forme des contacts avec les chaînes latérales de T479TM8 et N482TM8, et la chaîne principale N de S364HP1 à la pointe de HP1. Le groupe amino du substrat glutamate est coordonné uniquement avec le groupe carboxyle de D475TM8. Le groupe δ-carboxyle du substrat glutamate interagit avec les chaînes latérales de T401TM7 et R478TM8 (Fig. 2c, d). Par comparaison avec les homologues eucaryotes (hEAAT119, hEAAT320, hASCT222) et les homologues procaryotes (GltPh14, GltTk17), les résidus clés impliqués dans la liaison au substrat sont hautement conservés entre hEAAT2 et les homologues mentionnés ci-dessus (Fig. 6 supplémentaire). Cependant, R478TM8 dans hEAAT2 est remplacé par C467TM8 à la position correspondante dans le transporteur d'acides aminés neutres hASCT2 (Fig. 6e supplémentaire), ce qui contribue à la sélectivité du substrat de hASCT2 pour les acides aminés neutres20. Pour valider le site de liaison du glutamate, nous avons muté D475TM8 et R478TM8 en alanine séparément (D475ATM8 et R478ATM8). Des expériences électrophysiologiques ont montré que le glutamate n'activait pas les courants anioniques de ces deux mutants à une concentration de glutamate jusqu'à 1 mM, par rapport à celle de hEAAT2 de type sauvage (Fig. 2e et Fig. 7a – c supplémentaires). Pour exclure la possibilité qu'une mutation dans l'un ou l'autre des résidus puisse perturber l'activité de hEAAT2 en tant que canal anionique, nous avons également testé les effets inhibiteurs de WAY-213613 sur les courants anioniques de ces deux mutants. En conséquence, les deux mutants, D475ATM8 et R478ATM8, pourraient toujours médier un courant anionique entrant, mis en évidence par un courant sortant apparent induit par le WAY-213613, bien que le Ki apparent de WAY-213613 ait été réduit à 30,48 μM et 1,68 μM pour D475ATM8 et R478ATM8, respectivement (Fig. 2f et Supplémentaires Fig. 7e, f). Par conséquent, nous supposons que les résidus D475TM8 et R478TM8 sont critiques pour la liaison de hEAAT2 avec le glutamate et pourraient également participer à la liaison de ce transporteur avec WAY-213613.

a Structure globale de l'homotrimère hEAAT2Glu avec le glutamate (sphères colorées) vue du plan membranaire. b Couper à travers la surface moléculaire d'un seul protomère de hEAAT2Glu montrant le glutamate (bâtonnets) et sa densité EM (maille bleue). c Site de liaison détaillé pour le glutamate (jaune) avec ses principaux résidus d'interaction (bâtonnets). d Tracé 2D représentant les interactions du glutamate avec ses résidus environnants par LigPlot+. e Comparaison des densités de courant liées au glutamate entre les mutants testés et hEAAT2 de type sauvage. Les courants ont été enregistrés à 1000 μM de glutamate et présentés après soustraction du courant de fuite dépendant de Na+. Les tailles d'échantillon (n) testées pour hEAAT2 de type sauvage, D475ATM8 ou R478ATM8 sont de 5, 4, 5 cellules. L'ANOVA unidirectionnelle a été suivie du test post hoc de Bonferroni, **** P < 0,0001. f Relations dose-réponse WAY-213613 pour les courants médiés par D475ATM8, R478ATM8 ou S441GHP2. WAY-213613 a été varié aux concentrations suivantes : 0,3 μM, 1 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM et 100 μM pour D475ATM8 et R478ATM8 ; 0,03 μM, 0,1 μM, 0,3 μM, 1 μM, 3 μM, 10 μM et 30 μM pour S441GHP2. Les courants ont été normalisés au courant maximal enregistré après application de 30 μM ou 100 μM WAY-213613. Les tailles d'échantillon (n) testées de concentrations faibles à élevées sont répertoriées comme suit : n = 4, 5, 5, 5, 5 et 9 cellules pour D475ATM8 ; n = 5, 5, 5, 4, 5 et 12 cellules pour R478ATM8 ; n = 4, 4, 4, 5, 5, 4 et 7 cellules pour S441GHP2. Les lignes représentent les meilleurs ajustements à une équation de type Michaelis-Menten. Les données de hEAAT2 de type sauvage de la Fig. 1b ont été comparées à celles des mutants testés. g Comparaison structurelle des domaines de transport entre hEAAT2Glu (vert pâle) et hEAAT3Apo (PDB ID : 6X3F, gris). h Relation dose-réponse du glutamate pour les courants médiés par S441GHP2 aux concentrations variées de 0,1 μM, 0,3 μM, 1 μM, 3 μM, 10 μM et 30 μM. Les lignes représentent le meilleur ajustement à une équation de type Michaelis – Menten avec un Km apparent moyen de 0,40 ± 0,03 μM. Les courants ont été normalisés au courant maximal enregistré après l'application de 30 μM de glutamate. Les tailles d'échantillon (n) testées de concentrations faibles à élevées sont de 4, 5, 5, 5, 12 et 5 cellules. Dans les figures, e, f et h, toutes les expériences ont été exécutées à 0 mV et les données ont été présentées sous forme de valeurs moyennes ± SD.

Comparé à hEAAT3 orienté vers l'intérieur à l'état apo (PDB ID: 6X3F) 20, nous avons constaté que le HP2 dans le complexe hEAAT2Glu se déplace remarquablement vers le côté intracellulaire lorsque le glutamate est lié (Fig. 2g), ce qui empêcherait la fuite du substrat. Cette conformation est stabilisée par des liaisons hydrogène entre HP2 et les hélices environnantes. En plus de participer directement à la liaison du glutamate, D475TM8 peut également former une liaison hydrogène avec l'azote du squelette de S444HP2 de HP2, ce qui contribue au gros plan de la pointe HP2 (Fig. 2g). De plus, le groupe carbonyle du squelette et la chaîne latérale de S441HP2 interagissent avec les chaînes latérales de S363HP1 et A394TM7, respectivement (Fig. 2g). Ensemble, trois paires de liaisons hydrogène, dont D475-S444, S363-S441 et S441-A394, sont essentielles pour que HP1 et HP2 restent proches l'une de l'autre. Fait intéressant, le S441HP2 n'est présent que dans le hEAAT2 et est remplacé par un résidu glycine conservé à la position correspondante de chaque homologue (Fig. 8 supplémentaire). Pour étudier le rôle fonctionnel du S441HP2, nous avons remplacé ce résidu par de la glycine (S441GHP2) et effectué des enregistrements électrophysiologiques par des applications de diverses concentrations de glutamate. De manière frappante, nous avons constaté que le mutant S441GHP2 affiche une sensibilité plus élevée au glutamate avec le Km à 0, 40 ± 0, 03 μM (Fig. 2h et Fig. 7d supplémentaire), qui est augmentée d'environ 77 fois plus élevée que celle de hEAAT2 de type sauvage, bien que le S441HP2 n'est pas directement impliqué dans la liaison au glutamate (Fig. 2c, d). Ce résidu est exclusivement présent dans le hEAAT2, par rapport à la glycine conservée à la position correspondante dans d'autres homologues (Fig. 8 supplémentaire). Nous supposons que le résidu unique S441HP2 fournit probablement des interactions supplémentaires pour stabiliser le HP2 lors d'une confirmation scellée et interdire la libération de glutamate du côté intracellulaire. Ainsi, une mutation dans le S441HP2 pourrait rompre ces interactions, faciliter la libération de glutamate, accélérer le cycle d'absorption du glutamate et, par conséquent, biaiser le hEAAT2 vers un canal avec une probabilité d'ouverture plus élevée. Le Ki apparent de WAY-213613 pour le mutant S441GHP2 a été réduit à 0,26 μM (Fig. 2f et Fig. 7g supplémentaire), ce qui laisse entendre que ce site affecte également la liaison de l'inhibiteur d'une certaine manière.

Le WAY-213613 affiche une sélectivité élevée pour le hEAAT2, il est donc souhaitable d'étudier ses différences de spécificité entre les hEAAT. Pour étudier le mécanisme inhibiteur de hEAAT2 par WAY-213613, nous avons déterminé une structure complexe de hEAAT2 avec cet inhibiteur à une résolution de 3, 4 Å (Fig. 3a et Fig. 3 supplémentaire). Le WAY-213613 est composé de trois groupes fonctionnels, dont les groupes bromofluorophénol, aniline et asparagine (Fig. 3b). Cette structure complexe adopte une conformation tournée vers l'intérieur. Une densité supplémentaire est identifiée au site de liaison du glutamate près du côté cytoplasmique de la membrane, ce qui est bien compatible avec l'inhibiteur WAY-213613 (Fig. 3b). Ci-après, nous avons appelé le hEAAT2 lié au WAY-213613 comme complexe hEAAT2W. Les interactions impliquées dans la stabilisation de l'inhibiteur WAY-213613 sont composées des interactions hydrophobes et des liaisons hydrogène entre l'inhibiteur et ses résidus environnants (Fig. 3c, d). Plus spécifiquement, le groupe α-carboxyle de WAY-213613 forme des contacts avec l'azote du squelette et le groupe hydroxyle de la chaîne latérale de S364HP1. Le groupe amino de WAY-213613 est coordonné avec le groupe carboxyle de la chaîne latérale de D475TM8 (Fig. 3c). De plus, R478TM8 forme non seulement un pont salin avec D475TM8, mais forme également deux interactions cation-π avec Y404TM7 et le groupe aniline de WAY-213613 (Fig. 3c). Ces observations structurelles sont également étayées par l'analyse fonctionnelle selon laquelle les mutants D475ATM8 et R478ATM8 présentaient des affinités de liaison significativement réduites avec le WAY-213613 par rapport à celles du hEAAT2 de type sauvage (Fig. 2f). De plus, le groupe bromofluorophénol est enveloppé dans une cavité hydrophobe formée par les résidus hydrophobes I464TM8, L467TM8, V468TM8, M450HP2 et L447HP2 (Fig. 3c). Le groupe bromofluorophénol est également stabilisé en formant une interaction de pile π−π avec Y404TM7 dans une configuration en forme de T (Fig. 3c). Dans la carte cryo-EM du complexe hEAAT2W, une molécule de type DDM s'est avérée prise en sandwich entre TM1 et l'hélice déroulée de TM8. Sa queue hydrophobe pointe vers le côté extracellulaire. Le groupe de tête est positionné à proximité du groupe bromofluorophénol et forme des interactions hydrophobes pour stabiliser la liaison WAY-213613 (Fig. 4b, e supplémentaires). Par conséquent, nous supposons qu'une molécule lipidique dans l'environnement membranaire peut occuper la position de liaison du DDM et participer aux effets inhibiteurs du transport du glutamate par le WAY-213613.

a Structure globale de hEAAT2W vue du plan de la membrane. WAY-213613 est représenté sous forme de sphères. b Couper à travers la surface moléculaire d'un seul protomère de hEAAT2W. Le WAY-213613 est affiché en bâtonnets et sa densité EM correspondante est affichée en maillage bleu. c Site de liaison détaillé pour WAY-213613 dans hEAAT2W. L'inhibiteur WAY-213613 (rose) et les résidus d'interaction clés sont représentés sous forme de bâtonnets ; les résidus hydrophobes de la poche de liaison sont représentés sous forme de sphères semi-transparentes. d Tracé 2D représentant les interactions de WAY-213613 avec ses résidus environnants par LigPlot+. e Changements de conformation du site de liaison du glutamate entre hEAAT2W (vert pâle) et hEAAT2Glu (gris). Le HP2 de hEAAT2W est surligné en rouge et les flèches noires indiquent le décalage du HP2.

Nous avons également superposé les structures de hEAAT2Glu et hEAAT2W (Fig. 3e). Puisqu'une partie du WAY-213613 est dérivée de l'asparagine, il n'était pas surprenant que l'inhibiteur forme des interactions de liaison hydrogène similaires en parallèle avec la situation de liaison au glutamate. Les groupes α-carboxyle et α-amino du WAY-213613 ou du glutamate sont coordonnés par le même groupe de résidus de TM8 et de la pointe HP1, tels que D475TM8 et S364HP1 (Figs. 2c, 3c). Cependant, lors de la liaison WAY-213613, le groupe bromofluorophénol hydrophobe de l'inhibiteur interagit avec les résidus hydrophobes du HP2, tels que M450HP2 et L447HP2, et éloigne par conséquent le HP2 de la pointe HP1 et ouvre la pointe HP2. La spirale HP2b subit une rotation vers l'extérieur avec un angle d'environ 22 °, et la pointe HP2 a un changement de distance à ~ 8, 0 Å (Fig. 3e). Juste en raison du mouvement de HP2, les résidus S441HP2 et S444HP2 à la pointe HP2 sont incapables de former des liaisons hydrogène avec la pointe HP1 et TM8, respectivement, qui est présent dans la structure hEAAT2 liée au glutamate (Fig. 2g). Au lieu de cela, le groupe hydroxy S441HP2 forme une liaison hydrogène avec le groupe carbonyle de T395TM7 et stabilise ainsi l'état lié à WAY-213613 (Fig. 3c), conformément à l'analyse fonctionnelle mentionnée ci-dessus selon laquelle la mutation S441GHP2 a diminué la sensibilité de hEAAT2 à WAY-213613. (Fig. 2f). Comme les résidus participant à la liaison de WAY-213613 proviennent des éléments HP1, HP2 et TM8, ce réseau d'interaction médié par WAY-213613 pourrait par conséquent stabiliser le hEAAT2 dans un état de conformation orienté vers l'intérieur. De plus, une telle conformation ouverte de HP2 stabilisée par WAY-213613 entrave le changement conformationnel, un processus clé pour l'activité hEAAT2.

Pour comprendre comment le WAY-213613 bloque sélectivement le hEAAT2, nous avons superposé la structure du hEAAT3Na orienté vers l'intérieur (PDB ID : 6X2L)20 avec celle du hEAAT2W (Fig. 4a – c). Nous avons constaté que le groupe asparagine de WAY-213613 est assez compatible avec la structure de hEAAT3. Cependant, certains résidus adjacents aux groupes bromofluorophénol sont substitués dans hEAAT3. En particulier, les résidus V468TM8, L467TM8 et I464TM8 de TM8 de hEAAT2 sont remplacés par I437TM8, I436TM8 et V433TM8 dans hEAAT3, respectivement (Fig. 4c et Fig. 8 supplémentaire). Par conséquent, ces substitutions dans hEAAT3 conduisent au rétrécissement de la poche de liaison du WAY-213613 dans hEAAT3, impliquant le mécanisme par lequel hEAAT3 ne peut pas présenter la même affinité élevée pour l'inhibiteur WAY-213613 que celle de hEAAT2 (Fig. 4a, b) . Pour valider les hypothèses ci-dessus, nous avons conçu trois mutations, dont I464VTM8, L467ITM8 et V468ITM8. Les expériences électrophysiologiques indiquent que les mutations n'affectent pas la liaison au glutamate. Pour ces trois mutants, l'application de glutamate dans la solution externe peut activer de manière significative le courant anionique avec une efficacité similaire à celle du hEAAT2 de type sauvage (Fig. 4d et Supplémentaire Fig. 9a – c). Cependant, ces mutations entraînent une diminution significative de la sensibilité au WAY-213613, avec Ki augmenté à ~ 0, 17 μM, ~ 0, 46 μM et ~ 0, 20 μΜ pour les mutants I464VTM8, L467ITM8 et V468ITM8, respectivement (Fig. 4e et Fig. 9d–f), soutenant nos spéculations selon lesquelles les résidus I464TM8, L464TM8 et V468TM8 sont cruciaux pour la spécificité de liaison de hEAAT2 avec WAY-213613.

a Représentation en surface de la poche WAY-213613 dans le hEAAT2W (vert pâle). Le WAY-213613 est affiché en sticks (rose). b Amarrage de WAY-213613 dans le hEAAT3Na (PDB ID : 6X2L). La représentation de surface de hEAAT3Na (bleu) indique un rétrécissement de la poche de liaison WAY-213613 dans hEAAT3. Le WAY-213613 est affiché en sticks (rose). c Comparaison structurelle du domaine de transport de hEAAT2W (vert pâle) et hEAAT3Na (PDB ID : 6X2L, gris). WAY-213613 et les résidus hydrophobes dans sa poche de liaison sont affichés en sticks. Le HP2 de hEAAT2W est coloré en rouge. d Relations dose-réponse du glutamate pour les courants médiés par I464VTM8, L467ITM8 ou V468ITM8. Les relations dose-réponse pour les mutants testés ont été analysées aux concentrations variées de glutamate indiquées sur la figure 1a. Les tailles d'échantillon (n) testées de concentrations faibles à élevées sont répertoriées comme suit : n = 5, 5, 5, 5, 5 et 5 cellules pour le mutant I464VTM8 ; n = 4, 4, 5, 5, 5 et 5 cellules pour le mutant L467ITM8 ; n = 5, 5, 5, 5, 4 et 6 cellules pour le mutant V468ITM8. e Relations dose-réponse WAY-213613 pour les courants médiés par I464VTM8, L467ITM8 ou V468ITM8. Les relations dose-réponse pour les mutants hEAAT2 en tant que WAY-213613 variaient aux concentrations indiquées sur la figure 1b. Les lignes représentent les meilleurs ajustements à une équation de type Michaelis-Menten avec un Ki apparent de 0,166 μM, 0,464 μM et 0,196 μM, respectivement. Les courants ont été normalisés au courant maximal enregistré après application de 30 μM de WAY-213613. Les tailles d'échantillon (n) testées de concentrations faibles à élevées sont : n = 5, 5, 5, 4, 4, 5 et 10 cellules pour I464VTM8 ; n = 5, 5, 5, 5, 5, 4 et 11 cellules pour L467ITM8 ; n = 5, 5, 5, 5, 5, 5 et 11 cellules pour V468ITM8. Les données de hEAAT2 de type sauvage de la Fig. 1b ont été comparées à celles des mutants testés. Aux figues. d et e, toutes les expériences ont été exécutées à 0 mV et les données ont été présentées sous forme de valeurs moyennes ± SD.

Jusqu'à présent, une série de structures d'homologues de hEAAT2 ont été déterminées en présence des différents types d'inhibiteurs, y compris les inhibiteurs compétitifs TBOA10,14,18, TFB-TBOA14,19,35, les isomères trans et cis de p-OMe-azo -TBOA36, Lc-BPE25 et inhibiteurs allostériques UCPH-10119. Des structures complexes avec une conformation tournée vers l'intérieur ont été adoptées pour une comparaison plus approfondie avec hEAAT2W (Fig. 10a supplémentaire), comprenant GltPhTFB-TBOA (ID PDB : 6 × 14) 14, GltPhTBOA (ID PDB : 6 × 16) 14 et hEAAT3TFB-TBOA (ID APB : 6S3Q)35. Dans les structures de GltPhTBOA et hEAAT3TFB-TBOA, les inhibiteurs s'insèrent dans les deux hélices de HP2 pour séparer HP2a de HP2b, et bloquent ainsi le changement conformationnel du transporteur (Fig. 10b, c supplémentaires). Cependant, l'orientation de WAY-213613 dans le complexe hEAAT2W est significativement différente de celle des inhibiteurs des complexes GltPhTBOA et hEAAT3TFB-TBOA (Fig. 10a – c supplémentaires). Le groupe bromofluorophénol de WAY-213613 est situé dans la "cavité hydrophobe profonde" formée par TM8, TM7b et HP2b (Fig. 3c et Fig. 10a supplémentaire). Le complexe GltPhTFB-TBOA présente un site de liaison distinct de celui du complexe hEAAT3TFB-TBOA (Fig. 10c, d supplémentaires). En revanche, le complexe GltPhTFB-TBOA semble afficher un site de liaison similaire à celui du complexe hEAAT2W (Fig. 10a, d supplémentaires). Cependant, le TFB-TBOA est incapable de s'approcher de la "cavité profonde" du WAY-213613 dans le hEAAT2 (Fig. 10e supplémentaire). Les résultats ci-dessus révèlent que le WAY-213613 est lié à une cavité précédemment non identifiée.

hEAAT2 est le transporteur d'acides aminés excitateurs le plus abondamment exprimé dans les astrocytes, qui est obligatoire pour l'absorption du glutamate de la fente synaptique dans les astrocytes pour prévenir la cytotoxicité neuronale3. Ici, nous rapportons la structure cryo-EM de hEAAT2Glu en complexe avec le glutamate, qui révèle les détails moléculaires de la façon dont hEAAT2 reconnaît le glutamate. Par comparaison avec les homologues eucaryotes (hEAAT119, hEAAT320, hASCT222) et les homologues procaryotes (GltPh14, GltTk17) (Fig. 6 supplémentaire), les résidus d'interaction clés impliqués dans la liaison au substrat sont hautement conservés entre hEAAT2 et les homologues mentionnés ci-dessus. Pendant ce temps, nous avons découvert qu'un résidu unique S441HP2 est exclusivement présent dans hEAAT2 et qu'il est remplacé par la glycine conservée à la position correspondante d'autres homologues (Fig. 8 supplémentaire). Des expériences électrophysiologiques ont montré que l'affinité de S441GHP2 pour le glutamate peut être significativement augmentée par rapport à celle de hEAAT2 de type sauvage (Fig. 2h). Notamment, le S441HP2 est situé à la pointe HP2 et ne participe pas directement à l'interaction avec le glutamate (Fig. 2g). Ainsi, nous supposons que S441HP2 peut affecter le taux de transport du glutamate. D'autres expériences seront nécessaires pour clarifier les rôles fonctionnels de S441HP2 dans hEAAT2.

Dans cette étude, nous avons également résolu la structure de hEAAT2 en complexe avec l'inhibiteur WAY-213613, ce qui élucide clairement la poche de liaison de hEAAT2 pour WAY-213613. Le complexe hEAAT2W est stabilisé à l'état conformationnel orienté vers l'intérieur. Les groupes α-carboxyle et α-amino et les groupes aniline de WAY-213613 forment des contacts avec les résidus S364HP1, D475TM8 et R478TM8 et partagent un site de liaison superposé avec le substrat glutamate, conformément à l'idée que WAY-213613 est un inhibiteur compétitif . Dans le complexe hEAAT2W, le HP2 subit un changement conformationnel remarquable et s'éloigne du HP1, créant ainsi suffisamment d'espace pour la liaison WAY-213613. Fait intéressant, il a été déterminé que le S441HP2 forme une liaison hydrogène avec T395TM7 et stabilise par conséquent le HP2 dans une conformation ouverte, ce qui s'avère que cette interaction est critique pour la liaison WAY-213613 (Figs. 3c, 2f). Pendant ce temps, le groupe bromofluorophénol de WAY-213613 est enveloppé par certains résidus hydrophobes de TM8, TM7b et HP2b, tels que I464TM8, L467TM8, V468TM8, M450HP2 et L447HP2 (Fig. 3c). Sur la base de la comparaison structurelle et de l'alignement des séquences, les résidus I464TM8, L467TM8 et V468TM8 de TM8 dans hEAAT2 varient par rapport aux résidus correspondants d'autres hEAAT (Fig. 4c). Les expériences électrophysiologiques démontrent que les trois résidus ci-dessus sont essentiels pour l'inhibition de hEAAT2 par WAY-213613 avec une puissance élevée et une mutation dans chacun des trois résidus réduit considérablement l'efficacité inhibitrice de hEAAT2 par WAY-213613 (Fig. 4e). Considérant que le cluster I464-L467-V468 dans hEAAT2 est remplacé par Val-Leu-Ile dans hEAAT3 ou Ile-Ile-Val dans hEAAT1/hEAAT4/hEAAT5, respectivement, nous supposons que le cluster I464-L467-V468 de TM8 agit comme un déterminant structurel clé pour l'inhibition sélective de hEAAT2 par WAY-213613.

Le gène hEAAT2 complet (accession UniProtKB : P43004) a été cloné à partir d'un ADNc HEK293 et construit dans un vecteur pEG BacMam modifié qui a un Strep∙ Tag II N-terminal suivi d'un superfolder GFP (sfGFP) et d'une PreScission Protease ( PPase) site de reconnaissance. Le système d'expression de baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen) a été utilisé pour exprimer les protéines recombinantes hEAAT2 dans les cellules HEK293F. Brièvement, le plasmide pEG-strep-GFP-hEAAT2 a été transformé dans des cellules d'Escherichia coli DH10bac pour acquérir un plasmide bacmide contenant le gène hEAAT2, conformément aux instructions du fabricant (Bac-to-Bac ; Invitrogen). Ensuite, le baculovirus a été obtenu dans des cellules Sf9 (cellules Spodoptera frugiperda-9), et les virus P2 ont été collectés après 72 h d'amplification. Les cellules HEK 293F ont été cultivées à une densité de 2,5 × 106 cellules/ml à 37 °C, et les virus P2 ont été ajoutés à un rapport de 1 % (v/v) pour initier la transfection et complétés simultanément avec du glutamate 1 mM (Sigma- Aldrich) ou 5 μM WAY-213613 (MedChemExpress) et 1 % (v/v) FBS (sérum bovin fœtal), puis incubé dans un agitateur à 37 °C avec 5 % de CO2. Après la culture de 8 à 12 h, du butyrate de sodium 10 mM a été ajouté et les cellules ont continué à être incubées pendant 48 h, suivies d'une centrifugation à 2500 × g pendant 5 min à 4 ° C pour la collecte des cellules.

Les culots de cellules ont été remis en suspension dans du tampon A (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, glutamate 1 mM ou WAY-213613 5 μM) additionné d'une dilution au 1:1000 de cocktail inhibiteur de protéase de mammifère (Sigma- Aldrich) ou congelés rapidement par de l'azote liquide et stockés à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. Les cellules remises en suspension ont été rompues dans un homogénéisateur Dounce. Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation à 10 000 × g pendant 10 min à 4 °C, et le surnageant a été ultracentrifugé à 100 000 × g pendant 0,5 h à 4 °C. Les culots de membranes brutes ont été remis en suspension dans du tampon A additionné d'un cocktail d'inhibiteurs de protéase et homogénéisés. 1 % (p/v) de n-dodécyl-β-d-maltopyranoside (DDM ; Anatrace) et 0,2 % (p/v) d'hémisuccinate de cholestérol (CHS ; Sigma-Aldrich) ont été ajoutés à la solution homogène, suivis d'une solubilisation de 2 h sous agitation douce à 4°C. Après ultracentrifugation à 100 000 × g pendant 0,5 h à 4 ° C, les débris insolubles ont été éliminés et le matériau solubilisé a été filtré à travers un filtre de 0, 22 μM (Merck Millipore). Par la suite, le filtrat est passé lentement sur une colonne de billes de streptactine (Smart-Lifesciences) pré-équilibrée avec le tampon B (tampon A additionné de 0,025 % (p/v) de DDM et de 0,005 % (p/v) de CHS) à un taux de ~0,2 ml/min. La colonne a été lavée avec 10 volumes de colonne (CV) de tampon B pour éliminer les matériaux non liés, et la protéine a été éluée avec quatre volumes de colonne de tampon C (tampon B additionné de d-desthiobiotine 5 mM). N-terminal Strep∙Tag II et GFP ont été digérés par incubation avec un rapport approprié de protéase PreScission maison à 4 ° C pendant 3 h. L'échantillon hEAAT2 a été concentré à 1 ml à l'aide d'un concentrateur à seuil de 100 kDa (Merck Millipore) et purifié davantage par chromatographie d'exclusion de taille à l'aide de Superose 6 Augmentation 10/300 GL (GE Healthcare) pré-équilibré avec le tampon B. Enfin, les fractions contenant la protéine purifiée ont été collectés et immédiatement concentrés pour la préparation de la grille cryo-EM.

Pour préparer les grilles pour l'imagerie cryo-EM, la protéine fraîchement purifiée a été concentrée et complétée avec du glutamate 2 mM ou 200 μM WAY-213613 sur de la glace et incubée pendant 30 min. Au total, 2,5 μl de complexe hEAAT2Glu à 12,6 mg/ml ou de complexe hEAAT2W à 10 mg/ml ont été appliqués sur des grilles cryo-EM en carbone troué (Quantifoil Cu R1.2/1.3, 300 mesh), qui ont été déchargées pendant 60 s en condition H2O2 par le nettoyeur plasma Solarus (Gatan). Les grilles ont été épongées pendant 2,5 s à 4 ° C et 100% d'humidité dans Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific), puis vitrifiées par plongée congelées dans de l'éthane liquide et stockées dans de l'azote liquide. Les données Cryo-EM ont été acquises à l'aide d'un microscope électronique à transmission Titan Krios de 300 kV (Thermo Fisher Scientific) équipé d'un détecteur d'électrons direct Gatan K2 Summit (Gatan) positionné après un filtre à énergie quantique GIF. Avec une fente de filtre d'énergie réglée sur 20 eV, SerialEM37 a été utilisé pour la collecte robotisée de piles de films en mode de comptage super-résolution à un grossissement de × 130 000 (taille de pixel de 1, 04 Å) avec une plage de défocalisation nominale de 1, 5 à 2, 5 μm. Les piles de films avaient une dose totale d'environ 50 e/Å2 répartie sur 60 images avec une plage de débit de dose de 8,5 à 9,0 e−/Å2/s.

Pour l'ensemble de données du complexe hEAAT2Glu, un total de 2256 films fractionnés par dose ont été collectés, le mouvement induit par le faisceau a été corrigé à l'aide de MotionCor238 et l'estimation de la fonction de transfert de contraste (CTF) a été déterminée par GCTF39. 148 images révélant une mauvaise estimation du CTF ou montrant une contamination par de la glace ont été rejetées, ce qui a donné 2108 images qui ont été sélectionnées pour une analyse ultérieure avec RELION-3.140, sauf mention spécifique. Un total de 1 509 287 particules ont été automatiquement sélectionnées à l'aide de Gautomatch, et les références initiales ont été calculées à l'aide de la reconstruction Ab-initio dans cryoSPARC41. Deux séries de classification 3D multi-références guidées ont été effectuées contre plusieurs cartes biaisées et résultant de bonnes références dans lesquelles la symétrie C3 a été imposée. La classe 4 résultante (41,8%) lors du premier tour de classification 3D et la classe 4 (82,8%) lors du deuxième tour de classification 3D affichaient des hélices transmembranaires clairement résolues et ont été soumises au raffinement 3D suivant, qui a donné un 3,9 Å carte de résolution. Pour améliorer encore la qualité de la carte hEAAT2, des classifications 3D sans alignement ont été réalisées en utilisant un masque serré et une symétrie C3 imposée. Les particules composant la meilleure classe de 6 classes (15,0 %) ont été sélectionnées pour un raffinement CTF et un raffinement automatique 3D supplémentaires en utilisant la symétrie C3 et le post-traitement avec un masque serré, et ont amélioré la carte finale à une résolution de 3,4 Å selon le critère GSFSC42 rapporté.

Pour l'ensemble de données du complexe hEAAT2W, un total de 465 films fractionnés par dose ont été collectés, le mouvement induit par le faisceau a été corrigé à l'aide de MotionCor238 et l'estimation CTF a été déterminée par GCTF39. Un total de 233 008 particules ont été sélectionnées parmi les 420 micrographies à l'aide du sélecteur de modèles dans cryoSPARC41. Les particules extraites ont été soumises à deux cycles de classification 2D. Les bonnes moyennes de classe 2D ont été sélectionnées et ont été soumises à un raffinement hétérogène 3D avec symétrie C3 imposée. La bonne classe 3D résultante avec 98 685 particules a été soumise à un raffinement non uniforme 3D pour produire une carte à une résolution de 3,7 Å. Les 98 685 particules ont été réextraites dans RELION-3.140, suivies d'un raffinement automatique 3D, d'un post-traitement et d'un polissage pour améliorer encore la qualité des particules, puis les particules polies ont été réimportées dans cryoSPARC. Après raffinement hétérogène 3D avec symétrie C3 imposée, 98 536 particules de la meilleure classe ont été soumises à un raffinement non uniforme. Au final, une carte à une résolution de 3,4 Å a été obtenue.

Pour la construction du modèle du complexe hEAAT2Glu, une structure cryo-EM précédemment publiée de hEAAT3 (PDB ID : 6S3Q)35 supprimant ses composants non protéiques a été utilisée comme modèle de référence ancré dans la carte de densité à l'aide de Chimera43, suivi d'un ajustement manuel dans COOT44. Cette carte à haute résolution peut visiblement attribuer la séquence protéique et modéliser en toute confiance la majorité des résidus (37–148, 162–195 et 229–507). Une densité solide orpheline a été trouvée dans chaque protomère au centre spatial recouvrant par le haut de HP2 et HP1, qui a été considérée comme une densité pour le glutamate 2 mM préexistant lorsque les grilles ont été préparées et que l'aspartate ou la glutamine de substrat analogue était lié à un site similaire dans les homologues hEAAT2. La molécule de glutamate a été ancrée manuellement dans la densité à l'aide de COOT. Les contraintes pour PC1 (1,2-Diacyl-sn-glycéro-3-phosphocholine) et CHS ont été dérivées par eLBOW45 dans Phenix. Ici, PC1 a été utilisé comme lipide modèle avec élimination des chaînes acyle ou des têtes d'éthanolamine pour s'adapter aux densités correspondantes. Par la suite, le modèle a été soumis à un ajustement manuel dans COOT et affiné par rapport à la carte en utilisant Phenix avec des cycles d'affinement en espace réel46 avec des paramètres par défaut. MolProbity47 a été utilisé pour la validation. Le modèle final de hEAAT2 a acquis une bonne géométrie (tableau supplémentaire 1). Les courbes de corrélation de coquille de Fourier (FSC) ont été calculées entre le modèle final raffiné non masqué et la carte masquée, ainsi que la validation croisée du modèle raffiné par rapport à la carte de hEAAT2 (Fig. 2 supplémentaire et Tableau supplémentaire 1). Les figures ont été préparées en utilisant UCSF ChimeraX48 et PyMOL49 ou LigPlot+50.

Des cellules de rein embryonnaire humain 293T (HEK293T) ont été cultivées dans un milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, Gibco) additionné de 15 % (v/v) de sérum bovin fœtal (FBS, PAN-Biotech) à 37 °C avec 5 % de CO2. Les cellules HEK293T ont été cultivées dans les boîtes de culture (d = 3,5 cm) (Thermo Fisher Scientific) pendant 24 h, puis 1 μg hEAAT2 de type sauvage et les plasmides mutants pour les boîtes ont été utilisés pour transfecter de manière transitoire HEK293T en utilisant 0,7 μg de réactif Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific). Les cellules ont été analysées à l'aide d'expériences électrophysiologiques entre 24 et 40 h après la transfection à température ambiante (21 à 25 ° C).

Des expériences électrophysiologiques ont été réalisées comme décrit précédemment avec une modification mineure25. Le tampon externe contenait 140 mM de NaCl, 2 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2 et 10 mM d'HEPES (pH = 7,4 avec NaOH et osmolarité d'environ 310 mosmol L-1) et tandis que la solution de pipette interne comprenait 130 mM de NaSCN, 2 mM de MgCl2, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM (pH = 7,4 avec NaOH et osmolarité d'environ 310 mosmol L-1) et glutamate 10 mM. Des solutions mères 50 mM WAY-213613 ont été préparées dans du diméthylsulfoxyde (DMSO), suivies de dilutions aux concentrations de travail avec le tampon externe mentionné ci-dessus. Le DMSO maximal de 0,5 % a été utilisé dans notre expérience et n'a pas affecté les résultats électrophysiologiques dans les cellules témoins. Des enregistrements d'expériences de patch-clamp sur cellules entières ont été effectués à partir de cellules HEK293T GFP-positives isolées (hEAAT2 de type sauvage et mutants). Au total, 3 à 6 MΩ ont été utilisés pour tirer une pipette polie (Sutter Instrument). Étant donné que le courant relativement faible et la compensation n'ont eu aucun effet sur l'amplitude des courants observés, la résistance série n'a pas été compensée dans ces expériences. Les cellules ont été immergées dans le tampon externe mentionné ci-dessus additionné d'une concentration spécifiée de glutamate ou de WAY-213613. Le courant anionique induit par le glutamate, le courant de fuite anionique dépendant du Na + et le courant de transport du glutamate ou les courants de fuite anioniques inhibés par WAY-213613 ont été enregistrés à l'aide d'un amplificateur EPC-10 (HEKA Electronic) à une fréquence d'échantillonnage de 20 kHz avec un filtre passe-bas à 5 kHz. Toutes les expériences ont été exécutées à 0 mV. Une fois le courant cellulaire stabilisé, le glutamate ou WAY-213613 a été maintenu aux concentrations indiquées à partir d'un dosage externe pendant au moins 6 s. Par la suite, la cellule a été lavée avec un tampon externe pour démarrer une nouvelle série d'applications ou mettre fin à l'expérience. Les courants de plateau ont été utilisés pour les calculs suivants. Pour l'analyse, les données ont été acquises par le programme PatchMaster (HEKA Electronic) à 5 s après l'enregistrement. Les relations dose-réponse non linéaires ont été intégrées dans une équation de type Michaelis – Menten illustrée ci-dessous pour obtenir les valeurs apparentes de Km et Ki en présence de glutamate ou de WAY-213613.

Dans cette équation, je représente le courant à différentes concentrations de glutamate ou d'inhibiteur, et Imax représente le courant maximal à la concentration saturante de glutamate ou d'inhibiteur. [C] représente la concentration de glutamate ou d'inhibiteur. Km/i représente la constante apparente.

La signification statistique a été évaluée à l'aide d'une ANOVA à une voie suivie du test post-hoc de Bonferroni décrit en détail comme dans les légendes des figures.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les cartes tridimensionnelles de densité cryo-EM de hEAAT2Glu et hEAAT2W ont été déposées dans la base de données EM sous les codes d'accession EMD-33407 et EMD-33408, respectivement, et les coordonnées des structures ont été déposées dans la banque de données sur les protéines sous accession codes 7XR4 et 7XR6, respectivement. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. Les données sources sont fournies avec ce document.

Danbolt, NC Absorption de glutamate. Programme. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).

Article CAS PubMed Google Scholar

Grewer, C., Gameiro, A. & Rauen, T. Transporteurs de glutamate SLC1. Pflug. Cambre. EUR. J. Physiol. 466, 3-24 (2014).

Article CAS Google Scholar

Vandenberg, RJ & Ryan, RM Mécanismes de transport du glutamate. Physiol. Rév. 93, 1621–1657 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Reyes, N., Ginter, C. & Boudker, O. Mécanisme de transport d'un homologue bactérien des transporteurs de glutamate. Nature 462, 880–885 (2009).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rothstein, JD et al. L'inactivation des transporteurs de glutamate révèle un rôle majeur du transport astroglial dans l'excitotoxicité et la clairance du glutamate. Neurone 16, 675–686 (1996).

Article CAS PubMed Google Scholar

Takahashi, K., Foster, JB & Lin, CLG Transporteur de glutamate EAAT2 : régulation, fonction et potentiel en tant que cible thérapeutique pour les maladies neurologiques et psychiatriques. Cellule. Mol. Vie Sci. 72, 3489-3506 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Fontana, ACK Approches actuelles pour améliorer la fonction et l'expression du transporteur du glutamate. J. Neurochem. 134, 982–1007 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

O'Donovan, SM, Sullivan, CR & McCullumsmith, RE Le rôle des transporteurs de glutamate dans la physiopathologie des troubles neuropsychiatriques. npj Schizophrène. 3, 32 (2017).

Yernool, D., Boudker, O., Jin, Y. & Gouaux, E. Structure d'un homologue de transporteur de glutamate de Pyrococcus horikoshii. Nature 431, 811–818 (2004).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Boudker, O., Ryan, RM, Yernool, D., Shimamoto, K. & Gouaux, E. Substrat de couplage et liaison des ions à la porte extracellulaire d'un transporteur d'aspartate dépendant du sodium. Nature 445, 387–393 (2007).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Grewer, C. et al. Les sous-unités individuelles de l'homotrimère EAAC1 du transporteur de glutamate fonctionnent indépendamment les unes des autres. Biochimie 44, 11913–11923 (2005).

Article CAS PubMed Google Scholar

Leary, GP, Stone, EF, Holley, DC & Kavanaugh, MP Les voies de perméation du glutamate et du chlorure sont colocalisées dans des sous-unités individuelles de transporteur de glutamate neuronal. J. Neurosci. 27, 2938-2942 (2007).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koch, HP, Brown, RL et Larsson, HP La conductance anionique activée par le glutamate dans les transporteurs d'acides aminés excitateurs est contrôlée indépendamment par les sous-unités individuelles. J. Neurosci. 27, 2943-2947 (2007).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, X. & Boudker, O. Les grands mouvements de domaine à travers la bicouche lipidique interviennent dans la libération du substrat et l'inhibition des transporteurs de glutamate. Elife 9, 1–20 (2020).

Google Scholar

Chen, I. et al. Les transporteurs de glutamate ont un canal chlorure avec deux portes hydrophobes. Nature 591, 327–331 (2021).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guskov, A., Jensen, S., Faustino, I., Marrink, SJ & Slotboom, DJ Mécanisme de liaison couplé de trois ions sodium et aspartate dans l'homologue du transporteur de glutamate Glt Tk. Nat. Commun. 7, 13420 (2016).

Arkhipova, V. et al. Liaison et transport du D-aspartate par l'homologue du transporteur du glutamate GltTk. Elife 8, 1–12 (2019).

Article Google Scholar

Arkhipova, V., Guskov, A. & Slotboom, DJ Ensemble structurel d'un homologue de transporteur de glutamate dans un environnement de nanodisque lipidique. Nat. Commun. 11, 1–9 (2020).

Article CAS Google Scholar

Canul-Tec, JC et al. Structure et inhibition allostérique du transporteur d'acides aminés excitateurs 1. Nature 544, 446–451 (2017).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qiu, B., Matthies, D., Fortea, E., Yu, Z. & Boudker, O. Les structures Cryo-EM du transporteur d'acides aminés excitateurs 3 visualisent la liaison et le transport couplés du substrat, du sodium et du proton. Sci. Adv. 7, 1–10 (2021).

Google Scholar

Stehantsev, P. et al. Une vue structurelle sur les mutations liées à la maladie dans l'échangeur d'acides aminés neutre humain ASCT1. Calcul. Structure. Biotechnol. J. 19, 5246–5254 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Garaeva, AA et al. Structure Cryo-EM du transporteur humain d'acides aminés neutres ASCT2. Nat. Structure. Mol. Biol. 25, 515–521 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Garaeva, AA, Guskov, A., Slotboom, DJ & Paulino, C. Un mécanisme d'ascenseur à une porte pour le transporteur d'acides aminés neutres humain ASCT2. Nat. Commun. 10, 1–8 (2019).

Article CAS Google Scholar

Yu, X. et al. Structures Cryo-EM du transporteur de glutamine humaine SLC1a5 (ASCT2) dans la conformation tournée vers l'extérieur. Elife 8, 1–17 (2019).

Google Scholar

Garibsingh, RAA et al. Conception rationnelle des inhibiteurs de l'ASCT2 à l'aide d'une approche expérimentale-informatique intégrée. Proc. Natl. Acad. Sci. ETATS-UNIS. 118, e2104093118 (2021).

Greenfield, A. et al. Synthèse et activités biologiques des analogues de l'acide aryl-éther-, biaryl- et fluorène-aspartique et de l'acide diaminopropionique en tant qu'inhibiteurs puissants du transporteur de glutamate de haute affinité EAAT-2. Bioorg. Méd. Chim. Lett. 15, 4985–4988 (2005).

Article CAS PubMed Google Scholar

Melzer, N., Biela, A. & Fahlke, C. Le glutamate modifie la conduction ionique et le déclenchement dépendant de la tension des canaux anioniques associés au transporteur d'acides aminés excitateurs. J. Biol. Chim. 278, 50112–50119 (2003).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wadiche, JI, Amara, SG & Kavanaugh, MP Flux d'ions associés au transport d'acides aminés excitateurs. Neurone 15, 721–728 (1995).

Article CAS PubMed Google Scholar

Fairman, WA, Vandenberg, RJ, Arriza, JL, Kavanaugh, MP & An, AS transporteur d'acides aminés excitateurs avec les propriétés d'un canal chlorure ligand-dépendant. Nature 375, 599–603 (1995).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Watzke, N. & Grewer, C. La conductance anionique du transporteur de glutamate EAAC1 dépend de la direction du transport du glutamate. FEBS Lett. 503, 121-125 (2001).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tao, Z., Zhang, Z. & Grewer, C. La neutralisation du résidu d'acide aspartique Asp-367, mais pas Asp-454, inhibe la liaison de Na+ à la forme sans glutamate et le cycle du transporteur de glutamate EAAC1. J. Biol. Chim. 281, 10263–10272 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Grewer, C., Watzke, N., Wiessner, M. & Rauen, T. La translocation du glutamate du transporteur neuronal du glutamate EAAC1 se produit en quelques millisecondes. Proc. Natl Acad. Sci. ETATS-UNIS. 97, 9706–9711 (2000).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Grewer, C. & Grabsch, E. De nouveaux inhibiteurs du transporteur neutre d'acides aminés ASCT2 révèlent sa fuite d'anions dépendante du Na+. J. Physiol. 557, 747–759 (2004).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arriza, JL et al. Comparaisons fonctionnelles de trois sous-types de transporteurs de glutamate clonés à partir d'un moteur humain. Cortex 14, 5559–5569 (1994).

CAS Google Scholar

Baronina, A. et al. Structure du transporteur d'acides aminés excitateurs humains 3 (EAAT3) en complexe avec TFB-TBOA https://doi.org/10.2210/pdb6s3q/pdb. (2020).

Arkhipova, V. et al. Aspects structurels de la photopharmacologie : aperçu de la liaison des inhibiteurs photocommutables et photocagés à l'homologue du transporteur du glutamate. Confiture. Chim. Soc. 143, 1513-1520 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mastronarde, DN Tomographie au microscope électronique automatisée utilisant une prévision robuste des mouvements des échantillons. J. Structure. Biol. 152, 36-51 (2005).

Article PubMed Google Scholar

Zheng, SQ et al. MotionCor2 : correction anisotrope du mouvement induit par le faisceau pour une cryomicroscopie électronique améliorée. Nat. Méthodes 14, 331–332 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, K. Gctf : détermination et correction du CTF en temps réel. J. Structure. Biol. 193, 1–12 (2016).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zivanov, J. et al. Nouveaux outils pour la détermination automatisée de la structure cryo-EM à haute résolution dans RELION-3. Elife 7, 1–22 (2018).

Article Google Scholar

Punjani, A., Rubinstein, JL, Fleet, DJ & Brubaker, MA CryoSPARC : algorithmes pour la détermination rapide et non supervisée de la structure cryo-EM. Nat. Méthodes 14, 290–296 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Scheres, SHW & Chen, S. Prévention du surajustement dans la détermination de la structure cryo-EM. Nat. Méthodes 9, 853–854 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF Chimera - un système de visualisation pour la recherche exploratoire et l'analyse. J. Comput. Chim. 25, 1605-1612 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, WG & Cowtan, K. Caractéristiques et développement de Foulque. Acta Crystallogr. Secte. D Biol. Cristallologue. 66, 486–501 (2010).

Article CAS Google Scholar

Workbench, O., Moriarty, NW, Ralf, W. & Paul, D. Établi de création et d'optimisation de ligands électroniques (eLBOW): un outil pour la génération de coordonnées et de contraintes de ligands. Acta Crystallogr. D Biol. Cristallologue. 65, 1074-1080 (2009).

Article CAS Google Scholar

Afonine, PV et al. Raffinement de l'espace réel dans PHENIX pour cryo-EM et cristallographie. Acta Crystallogr. Secte. Structure D. Biol. 74, 531-544 (2018).

Article CAS Google Scholar

Williams, CJ et al. MolProbity : des données de référence plus nombreuses et de meilleure qualité pour une meilleure validation de la structure de tous les atomes. Prorein Sci. 27, 293–315 (2017).

Goddard, TD et al. UCSF chimeraX : relever les défis modernes en matière de visualisation et d'analyse. Protéine Sci. 27, 14-25 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

DeLano, WL PyMOL : un outil graphique moléculaire open-source. CCP4 Newsl. Cristallogramme des protéines. 40, 82–92 (2002).

Google Scholar

Laskowski, RA & Swindells, MB LigPlot+ : plusieurs diagrammes d'interaction ligand-protéine pour la découverte de médicaments. J. Chem. Inf. Modèle. 51, 2778–2786 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

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Nous remercions B. Zhu et les autres membres du personnel du Center for Biological Imaging (CBI), Core Facilities for Protein Science at the Institute of Biophysics, Chinese Academy of Science (IBP, CAS) pour leur soutien à la collecte de données cryo-EM ; Nous remercions Bei Yang et Yan Wu pour leur service d'assistant de recherche. Ce travail est financé par les programmes nationaux chinois pour les sciences du cerveau et la technologie de l'intelligence semblable au cerveau (subvention n° 2022ZD0205800 à YZ), le programme de recherche prioritaire stratégique de l'Académie chinoise des sciences (subvention n° XDB37030304 à YZ), le programme national clé de recherche et de développement de Chine (Grant No. 2021YFA1301501 to YZ), the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 92157102 to YZ and Grant No. 32070031, 31770051 to JJ), the National Laboratory of Biomacromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences ( Grant No. 2021kf10 and 2022kf09), Chinese National Programs for Brain Science and Brain-like Intelligence Technology (Grant No. 2021ZD0202102 to ZH), and the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81371432 to ZH).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Zhenglai Zhang, Huiwen Chen, Ze Geng.

Département de microbiologie et de biotechnologie, Collège des sciences de la vie, Université agricole du Nord-Est, No. 600 Changjiang Road, Xiangfang District, Harbin, 150030, Chine

Zhenglai Zhang, Huiwen Chen et Juquan Jiang

Laboratoire national des biomacromolécules, CAS Centre d'excellence en biomacromolécules, Institut de biophysique, Académie chinoise des sciences, Pékin, 100101, Chine

Zhenglai Zhang, Huiwen Chen, Zhuoya Yu, Hang Li, Yanli Dong, Hongwei Zhang et Yan Zhao

State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Department of Molecular and Cellular Pharmacology, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University Health Science Center, Beijing, 100191, Chine

Ze Geng et Zhuo Huang

IDG/McGovern Institute for Brain Research, Université de Pékin, Pékin, 100871, Chine

Ze Geng et Zhuo Huang

State Key Laboratory of Brain and Cognitive Science, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, 15 Datun Road, Beijing, 100101, Chine

Zhuoya Yu et Yan Zhao

Collège des sciences de la vie, Université de l'Académie chinoise des sciences, Pékin, 100049, Chine

Zhuoya Yu, Hang Li, Hongwei Zhang et Yan Zhao

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YZ a conçu le projet et supervisé la recherche. ZZ a préparé un échantillon pour l'étude cryo-EM. HC et ZY ont collecté des données cryo-EM et calculé les cartes EM. ZZ et ZY ont construit et affiné le modèle atomique. HL, YD et HZ aident à purifier l'échantillon de protéines. YZ, JJ et ZZ ont analysé la structure. ZH et YZ ont conçu et ZG a réalisé les expériences électrophysiologiques. ZZ, HC et ZY ont contribué à la première ébauche du manuscrit. YZ et JJ ont édité le manuscrit avec la contribution de tous les auteurs dans la version finale.

Correspondance avec Zhuo Huang, Juquan Jiang ou Yan Zhao.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Rosemary Cater, Josep Font Sadurni et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Zhang, Z., Chen, H., Geng, Z. et al. Base structurelle des modes de liaison des ligands de l'EAAT2 humain. Nat Commun 13, 3329 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31031-x

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Reçu : 08 novembre 2021

Accepté : 31 mai 2022

Publié: 09 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-31031-x

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