Une nouvelle stratégie pour caractériser le modèle de β

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9177 (2023) Citer cet article

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Selon le CDC, Acinetobacter baumannii (CRAb) résistant aux carbapénèmes est une menace urgente pour la santé publique. Ce pathogène a peu d'options de traitement et provoque des infections nosocomiales graves avec un taux de mortalité > 50 %. Bien que des études antérieures aient examiné le protéome des CRAb, il n'y a pas eu d'analyses ciblées des changements dynamiques de l'expression de la β-lactamase pouvant survenir en raison de l'exposition au médicament. Ici, nous présentons notre étude protéomique initiale de la variation de l'expression de la β-lactamase qui se produit dans les CRAb avec différents antibiotiques β-lactamines. En bref, la résistance aux médicaments contre Ab (ATCC 19606) a été induite par l'administration de diverses classes d'antibiotiques β-lactamines, et le surnageant acellulaire a été isolé, concentré, séparé par SDS-PAGE, digéré avec de la trypsine et identifié par protéomique quantitative basée sur LC-MS sans étiquette. Treize protéines ont été identifiées et évaluées à l'aide d'une base de données de séquences de 1789 Ab β-lactamases d'UniProt, dont la majorité étaient des β-lactamases de classe C (≥ 80%). Il est important de noter que différents antibiotiques, même ceux de la même classe (par exemple la pénicilline et l'amoxicilline), ont induit des réponses non équivalentes comprenant diverses isoformes de sérine-β-lactamases de classe C et D, résultant en des résistomes uniques. Ces résultats ouvrent la porte à une nouvelle approche d'analyse et d'étude du problème de la multirésistance chez les bactéries qui dépendent fortement de l'expression de la β-lactamase.

Acinetobacter baumannii (Ab), un coccobacille Gram négatif aérobie, est l'un des agents pathogènes ESKAPE et est actuellement classé comme une menace urgente pour la santé publique par le CDC1. Cette classification est due à la gravité et à la mortalité élevée (dans certains cas supérieure à 50 %) des infections à Ac résistants aux carbapénèmes (ARC)2,3,4,5,6,7,8. De plus, ces infections sont généralement nosocomiales et surviennent fréquemment dans les unités de soins intensifs (USI ; représentant dans certains cas jusqu'à 31 % des infections en USI dans le monde) où les patients sont déjà plus sensibles2,9,10,11,12.

Afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter contre ces pathogènes, une meilleure compréhension de leurs mécanismes de résistance est nécessaire. En règle générale, les bactéries utilisent une combinaison de modification de la cible, de régulation de l'influx/efflux, des changements métaboliques et de la désactivation des médicaments par l'expression de β-lactamases, mais la contribution relative de ces multiples stratégies varie d'un agent pathogène à l'autre7,13. Par exemple, bien que les Ac et les CRAb puissent exprimer la protéine de liaison à la pénicilline modifiée (PBP), celle-ci n'est généralement pas considérée comme le principal mécanisme de résistance contrairement au Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline14. En ce qui concerne spécifiquement les CRAb, les premières études présentaient des points de vue opposés sur l'importance relative des modifications et de la régulation du PBP, des revues plus récentes suggérant que la production de carbapénèmase tend à être la méthode de résistance la plus importante pour les CRAb14,15,16. Les carbapénémases, en bref, sont des β-lactamases qui peuvent hydrolyser les carbapénèmes en plus d'autres antibiotiques β-lactamines. Des exemples de ceux-ci se trouvent dans les sérine β-lactamases de classe A et D et les métallo-β-lactamases de classe B, la sérine β-lactamase de classe D de type OXA étant régulièrement détectée dans CRAb17,18,19. Des études antérieures ont également rapporté qu'une variété de ces β-lactamases de type OXA peuvent être trouvées dans CRAb19 ; cependant, peu de travaux ont été effectués pour tenter de caractériser sélectivement l'ensemble des β-lactamases dans une seule souche et de les comparer avec des mutants résistants20,21,22,23.

Le catalogage et l'analyse de la collection de ces enzymes peuvent donc être une étape critique dans le développement de nouvelles thérapies combinées dans lesquelles les inhibiteurs de β-lactamase sont combinés avec des antibiotiques β-lactamines. Un rapport récent a même démontré qu'une nouvelle combinaison d'inhibiteurs de β-lactamase était utilisée dans le traitement réussi d'un patient souffrant d'une infection XDR Ab. Cependant, étant donné que les inhibiteurs eux-mêmes ne sont pas efficaces contre toutes les classes, il existe la possibilité que de futures mutations de la β-lactamase puissent rendre les inhibiteurs inefficaces24,25,26. La difficulté réside dans le fait que les bactéries résistantes aux médicaments peuvent porter plusieurs copies d'un gène de β-lactamase, qui n'ont pas besoin d'être exprimées simultanément (ou du moins pas dans une mesure égale) afin de maintenir une croissance cellulaire efficace. Par conséquent, les bactéries peuvent exprimer des collections uniques de β-lactamases, résultant en des résistomes spécifiques qui ne sont pas seulement de la classe des antibiotiques (par exemple les β-lactames) mais également dépendants des molécules. De plus, on ne sait pas dans quelle mesure ces résistomes conservent une "mémoire" de l'exposition précédente aux antibiotiques ou à quelle vitesse ils peuvent s'adapter aux nouveaux facteurs de stress environnementaux.

Pour comprendre la résistance aux antibiotiques chez les bactéries et les facteurs qui peuvent l'influencer, de nombreuses études ont utilisé diverses approches "-omiques" pour caractériser les changements génétiques (génomiques), transcriptionnels (transcriptomiques), métaboliques (métabolomique) et traductionnels (protéomiques) qui peuvent survenir chez les bactéries à la suite de l'administration de médicaments. Parmi ces omiques, la protéomique fournit les informations les plus directes concernant la réponse bactérienne aux stimuli externes tels que l'utilisation d'antibiotiques. Par conséquent, de nombreuses études récentes rapportent les profils protéomiques ou protéomes d'isolats cliniques résistants aux médicaments ainsi que de bactéries présentant une résistance aux médicaments induite en laboratoire20,27,28,29,30. En règle générale, le protéome entier est mesuré et montre l'expression différentielle de nombreuses protéines dans diverses bactéries résistantes aux médicaments, y compris celles liées au métabolisme, à la gestion des espèces réactives de l'oxygène, aux cibles médicamenteuses, à la modification de l'ADN/ARN, etc. Cependant, bien qu'un petit nombre d'études aient observé une corrélation entre divers antibiotiques et l'expression totale des protéines dans Ab, il n'y a pas eu d'enquête systématique sur l'exposition spécifique aux antibiotiques (mêmes ou différentes classes) sur les bactéries et leurs réponses enzymatiques spécifiques. À l'appui d'une telle étude, deux rapports récents ont spécifiquement identifié l'utilisation antérieure d'antibiotiques et l'exposition aux inhibiteurs de la β-lactamase comme facteurs de risque d'infections à Gram négatif résistantes aux médicaments5,33. Ces études et rapports suggèrent ensemble que les gènes, les protéines, les structures des médicaments et leurs fonctions spécifiques sont tous interconnectés pour développer une résistance aux médicaments. Par conséquent, nous pourrions émettre l'hypothèse que les différences structurelles entre divers antibiotiques β-lactamines peuvent être importantes pour différentes réponses de résistance bactérienne sous la forme de modèles d'expression β-lactamase modifiés.

Ici, nous présentons l'étude protéomique quantitative ciblée basée sur LC – MS de l'expression de la β-lactamase d'Ab (ATCC 19606; Ab19606) en réponse à l'exposition à divers antibiotiques β-lactamines. Cela a été accompli par la séparation du surnageant sans cellule du milieu de croissance bactérienne à l'aide de SDS-PAGE, suivie d'une analyse LC – MS – MS du mélange de protéines.

Pour déterminer et caractériser la résistance aux β-lactamines dans Ab19606, qui a été largement utilisée comme souche témoin dans des études impliquant la résistance aux antibiotiques, a été cultivée dans un bouillon nutritif avec quatre classes différentes d'antibiotiques β-lactamines (10 µg/mL). Pour confirmer que la résistance a été induite par une exposition répétée aux β-lactamines, des essais de diffusion sur disque ont été effectués sur de la gélose Mueller – Hinton (MH) (Fig. 1a). Les colonies ont été observées après 24 h d'incubation à 37 °C. Par rapport à l'ATCC 19606 sensible aux médicaments de type sauvage, les régions inhibitrices ont été réduites pour tous les antibiotiques contre les souches résistantes aux médicaments : la ceftazidime (céphalosporine) et la pipéracilline (pénicilline) ont été réduites de 5 mm et 6 mm, respectivement, et l'imipénème (carbapénème) et le méropénème (carbapénème) ont été réduits de 7 mm et 5 mm, respectivement. Cela a confirmé qu'Ab19606 pouvait générer une résistance significative des β-lactamines aux antibiotiques exposés.

( a ) Un essai de diffusion sur disque a été effectué via une souche Ab19606 de type sauvage et sélectionnée par β-lactamines pour confirmer la résistance induite par le traitement antibiotique. La résistance induite a été déterminée en mesurant la taille du diamètre, et toute la résistance a été confirmée par des répétitions en triple. ( b ) Schéma expérimental de sélection d'antibiotiques β-lactamines et de séparation / préparation d'échantillons pour l'approche protéomique.

Pour évaluer davantage le mécanisme de résistance survenant dans ces organismes, Ab19606 a été cultivé dans un bouillon nutritif et étalé sur des plaques de gélose contenant des concentrations sous-inhibitrices de divers antibiotiques bêta-lactamines et non bêta-lactamines. Les colonies ont été sélectionnées et cultivées dans des flacons d'un litre de bouillon nutritif avec une concentration de 5 μM de l'antibiotique correspondant. Une fois que la culture a atteint la phase stationnaire, les cellules ont été centrifugées et le surnageant a été concentré à l'aide d'unités de filtre centrifuge Ultra-15 (Fig. 1b).

Pour vérifier la présence d'enzymes β-lactamases à partir des souches Ab19606 sélectionnées par β-lactamines, la nitrocéfine, une céphalosporine chromogène, a été utilisée comme indicateur colorimétrique34,35. Initialement, ce surnageant acellulaire a été comparé au lysat cellulaire pour s'assurer de la présence de β-lactamases (Fig. S1 supplémentaire). Typiquement, on considère que seules les bactéries Gram-positives excrètent des β-lactamases dans l'espace extracellulaire36. Cependant, plusieurs publications ont démontré que les bactéries Gram-négatives, telles que les Ab, sont également capables de le faire37,38,39,40,41,42. Ceci est étayé qualitativement par notre expérience démontrant la capacité du surnageant acellulaire à hydrolyser également la nitrocéfine. Pour tous les échantillons de surnageant concentrés et acellulaires, l'activité enzymatique a pu être détectée et les paramètres d'activité biochimique (par exemple, Km, kcat) ont pu être obtenus en faisant varier la concentration de nitrocéfine de 0, 01 à 75 μM (tableau 1, Fig. S2 supplémentaire). Un échantillon de TEM-1 β-lactamase purifiée a été utilisé comme témoin positif de cinétique. Les résultats apparents de Km et kcat sont comparables aux paramètres cinétiques de contrôle TEM-1, montrant une plage raisonnable pour kcat/Km43. Ces résultats suggèrent que non seulement les enzymes β-lactamases étaient présentes dans le surnageant acellulaire concentré, mais qu'elles se trouvaient également dans une plage de concentration appropriée et qu'une caractérisation plus poussée pouvait se poursuivre.

Pour visualiser et séparer les β-lactamases exprimées par Ab19606, en préparation de LC – MS, nous avons effectué une séparation sur gel SDS des échantillons de surnageant hautement concentrés provenant d'échantillons Ab19606 après 72 h d'exposition à 5 μM d'antibiotiques (Fig. 2a). Une β-lactamase de classe A purifiée (TEM-1, 29 kDa/ligne 1) a été utilisée comme ligne de contrôle positif. Après SDS-PAGE, les protéines d-lactamase étaient facilement visibles après la coloration au bleu de Coomassie. Plusieurs pistes contenant des surnageants collectés à partir de divers échantillons d'Ab19606 exposés au β-lactame (échantillons 1 à 9) présentaient une bande distincte à un emplacement correspondant à une taille comprise entre 27, 5 et 42 kDa, correspondant à l'expression de β-lactamases. Fait intéressant, l'intensité des bandes était variable et les bandes de gel de protéines séparées présentaient différents modèles de protéines et niveaux d'expression en fonction de l'antibiotique utilisé pour induire la résistance.

( a ) SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie d'échantillons de surnageant sans cellules. La β-lactamase TEM-1 purifiée a été utilisée comme témoin. La zone possible de gel contenant toutes les classes de protéines β-lactamase (carré rouge) a été coupée pour une analyse protéomique plus poussée. (b) Proportions relatives de β-lactamases exprimées après exposition aux antibiotiques. ADC et AmpC sont des β-lactamases de type C ; OXA est de type D ; TEM est de type A ; Le PBP est la cible des antibiotiques β-lactamines mais présente des similitudes structurelles et un poids moléculaire similaire.

Après la séparation réussie des protéines par électrophorèse sur gel SDS, des sections du gel contenant les protéines β-lactamase (régions rouges sur la figure 2a) ont été coupées pour l'analyse protéomique. Les expériences de protéomique basées sur LC – MS / MS ont été réalisées à l'aide d'une méthode de protéomique sans étiquette (MaxLFQ) pour l'identification des isoformes de β-lactamase exprimées par les colonies résistantes aux médicaments. Plus précisément, la préparation des échantillons a été réalisée par digestion trypsique et les échantillons digérés ont été analysés par chromatographie liquide à haute résolution-spectrométrie de masse (LC-MS/MS). Les peptides identifiés ont ensuite été analysés et évalués via Mascot, Proteome Discoverer et MSFragger à l'aide d'un fichier FASTA comprenant la base de données de séquences de β-lactamase Ab19606.

Dans tous les échantillons, diverses séquences ont été identifiées qui correspondent, avec au moins 2 séquences peptidiques uniques, à diverses isoformes de β-lactamase (tableau 2). L'abondance relative de ces isoformes a ensuite été comparée en normalisant l'intensité sans étiquette à l'intensité totale mesurée pour l'échantillon. Diverses protéines, qui appartiennent à une classe plus large, ont ensuite été regroupées, par exemple, OXA-51 et OXA-66 sont combinées en un seul groupe OXA (Fig. 2b). Bien que diverses protéines non-β-lactamase aient également été identifiées à partir de l'analyse protéomique, les types de protéines les plus importants étaient l'ampicilline C (AmpC), l'AmpC dérivé d'Acinetobacter (ADC) et l'oxacillinase (OXA), qui appartiennent à la fois aux enzymes de classe C et D (Fig. 2b, Fig. S3 supplémentaire). Fait important, l'expression de ces enzymes par Ab19606 est en accord avec la présence des gènes blaAmpC et blaOXA catalogués par l'ATCC.44 Fait intéressant, les quantités relatives de ces trois types de protéines β-lactamase se sont avérées significativement différentes selon l'antibiotique auquel Ab19606 a été exposé. Ces données suggèrent que l'expression des β-lactamases peut être influencée par le traitement antibiotique spécifique, en particulier dans les cas où Ab19606 a été exposé à des concentrations d'antibiotiques supérieures à sa CMI. Ce concept est en outre étayé par l'observation que ces profils de résistance active sont également différents pour les antibiotiques de la même classe. Par exemple, la pénicilline G (penG), l'amoxicilline (amox) et la pipéracilline (pipe) sont tous des antibiotiques β-lactamines de la classe de pénicilline, mais ils produisent des réponses assez différentes (Fig. 2b, Fig. S3 supplémentaire).

Les antibiotiques ont donné à l'humanité un avantage décisif contre les agents pathogènes au cours du dernier demi-siècle. Cependant, les mutations et la sélection naturelle, combinées à des temps de génération rapides et à des tailles de population énormes, donnent désormais aux agents pathogènes un avantage décisif45,46,47,48. Pour reprendre le dessus, il est important de mieux comprendre la relation entre la structure et la fonction des antibiotiques et comment les agents pathogènes peuvent systématiquement évoluer pour les renverser afin que de nouvelles stratégies de traitement puissent être conçues.

Les bactéries ont régulièrement développé une résistance à de nombreuses classes d'agents antimicrobiens actuellement utilisés. Certaines bactéries, telles que Ab, ont une propension à développer des niveaux élevés de résistance aux médicaments, et sont donc classées comme extrêmement résistantes aux médicaments (XDR) et panrésistantes aux médicaments6,46,49,50. Notre choix d'antibiotiques Ab19606 et β-lactamines a donc été spécifiquement éclairé par le fait que le CRAb est désormais considéré comme une menace prioritaire par le CDC car il existe peu de traitements disponibles une fois qu'une infection s'est produite1,46,51. De plus, la résistance aux carbapénèmes se retrouve souvent dans les souches considérées comme MDR ou XDR50,52,53. Bien que les Ac et les CRAb, comme de nombreuses bactéries, disposent de plusieurs modes de résistance, certains considèrent que la désactivation des β-lactamines par l'action des β-lactamases pourrait être le mécanisme le plus important54,55. Cela présente plusieurs défis car les β-lactamases sont nombreuses, présentent une grande similitude, sont facilement transférables entre bactéries et mutent facilement pour fournir une plus grande activité dans des environnements à ressources limitées. Cependant, nous considérons que ces mêmes caractéristiques pourraient également fournir une opportunité d'identifier les interactions non spécifiques ou involontaires des antibiotiques avec des bactéries qui entraînent une résistance.

Nos résultats, présentés à la Fig. 2 et à la Fig. S3 supplémentaire, démontrent la variabilité de l'expression de la β-lactamase qui peut survenir à la suite d'une exposition aux antibiotiques. Il est important de noter que tous les antibiotiques ont entraîné des profils d'expression significativement différents de ceux de l'Ab19606 de type sauvage, qui s'est avéré exprimer principalement l'ADC. Des séquences uniques ont permis d'identifier chaque enzyme et ont été utilisées pour la quantification MaxLFQ de l'expression des protéines. Nous démontrons en outre, grâce à une comparaison de séquences côte à côte, que les enzymes ADC (A0A5C1K4D3) et AmpC (A0A009PJF4 à A0A8D6JWD9) sont en effet des isoformes uniques (Fig. 3)56.

Comparaison de séquences multiples des isoformes AmpC (A0A009PJF4 à A0A8D6JWD9) et ADC (A0A5C1K4D3) identifiées. Le rouge indique que le résidu correspond à la séquence de référence (AmpC). La figure a été générée à l'aide du programme prime qui est le package Schrödinger.

Les cartes de couverture de ces protéines et d'autres identifiées sont fournies dans la Fig. S4 supplémentaire. Fait intéressant, les β-lactamases de classe C, qui incluent AmpC et ADC, présentaient une très grande variabilité entre les différents échantillons d'Ab19606, mais semblent démontrer une dépendance à la sous-classe de β-lactamines (Fig. S5 supplémentaire). Plus précisément, les échantillons traités aux carbapénèmes (en particulier le méropénème et l'imipénème) exprimaient le plus d'AmpC (A0A009KWD8) avec une forte proportion d'ADC. De même, les échantillons traités avec les β-lactames dérivés de la pénicilline les plus courants, tels que la pénicilline G, l'amoxicilline et la pipéracilline, ont tous, en général, entraîné des proportions beaucoup plus élevées d'AmpC (A0A0R4J6T7). Cette différence pourrait être due à une incapacité des β-lactamases de classe C à cliver les carbapénèmes, tout en hydrolysant facilement les pénicillines ou les céphalosporines14,17,57. Ceci suggérerait que les bactéries traitées avec des carbapénèmes sont soumises à un stress plus important, ce qui conduit à une plus grande expression de β-lactamase et à un plus grand degré de mutation et à la plus grande présence d'isoformes apparentées.

Ce même concept semble s'étendre à l'expression variable des protéines OXA et PBP, même si aucune tendance claire ne peut être observée. L'expression variable d'OXA est cependant importante, car ces β-lactamases de classe D sont des carbapénémases connues et sont impliquées dans l'évolution de CRAb17,19,52. Dans nos données, il semble que tous les β-lactamines de la classe des carbapénèmes induisaient l'expression d'OXA, le méropénème et le faropénème entraînant la plus grande quantité relative parmi tous les échantillons. On ne sait pas pourquoi l'imipénem n'a pas nécessairement suivi cette tendance, ou pourquoi la pénicilline, l'amoxicilline et la pipéracilline ont toutes des niveaux d'expression d'OXA différents mais moindres.

L'observation de ces différences initiales entre les classes de β-lactamines et même entre les composés de la même sous-classe est prometteuse et suggère une relation plus complexe entre la structure de l'antibiotique et le développement de la résistance que ce qui a été précédemment rapporté. Pourtant, on ne sait pas dans quelle mesure ces études peuvent être corrélées à la génération de résistance in vivo, car la concentration du composé variera considérablement in vivo et sera affectée par la distribution, le métabolisme et le nombre de bactéries. De plus, notre étude n'a pas pu prendre en compte l'effet que les populations polymicrobiennes peuvent avoir sur la résistance due au transfert de gènes.

Grâce à l'utilisation d'une méthode protéomique sans étiquette dans laquelle les β-lactamases présentes dans une solution de surnageant acellulaire ont été analysées, il a été observé qu'Ab19606 avait produit différents profils de β-lactamases pour chaque antibiotique β-lactame appliqué. Ces résultats suggèrent que la β-lactamine spécifique, donc sa structure, peut affecter différemment les mêmes bactéries, suggérant qu'il existe une relation plus compliquée entre la structure/fonction de l'antibiotique et la génération de résistance. Des études futures examineront la possibilité que cette variation existe au sein des classes, ne soit pas aléatoire, et si des tendances dépendantes de la concentration peuvent être identifiées. L'élucidation plus poussée de ces relations élargirait non seulement considérablement notre compréhension des mécanismes de résistance bactérienne, mais elle pourrait également conduire à de nouveaux outils essentiels pour la conception d'antibiotiques de nouvelle génération ou de thérapies combinées qui pourraient éventuellement permettre l'inhibition ou l'évasion de la résistance à base de β-lactamase.

Ab19606 a été cultivé dans un bouillon nutritif à 37°C pendant une nuit. La culture a été diluée à 0, 5 McFarland standard (1, 5 × 108 UFC / ml) et 100 μL ont été étalés sur de la gélose Mueller – Hinton. Des quantités appropriées d'antibiotiques ont été ajoutées à des disques de 6 mm conformément au Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Les plaques ont été incubées à 37 °C pendant 18 h avant que les zones d'inhibition ne soient déterminées. Pour une exposition ultérieure, les bactéries ont été recueillies le long de la zone d'inhibition d'un disque et remises en culture dans un bouillon nutritif. Les cellules ont été préparées de manière identique, cependant, chaque plaque d'essai de diffusion de disque n'avait que des disques d'antibiotiques (3 ×) correspondant à ceux du disque créant la zone d'inhibition à partir de laquelle les bactéries ont été collectées. Des tests ultérieurs ont été effectués jusqu'à l'apparition de mutations permettant l'apparition de la résistance, généralement en 2 à 3 passages.

Ab19606 a été cultivé à 37 ° C dans un bouillon nutritif pendant une nuit et dilué à 0, 5 McFarland standard (1, 5 × 108 UFC / ml). Pour induire l'expression des β-lactamases, des cultures d'Ab19606 ont été étalées sur des plaques de gélose nutritive contenant des concentrations sous-inhibitrices d'antibiotique pour l'isolement des colonies en utilisant la méthode des stries et incubées à 37 ° C pendant 24 h. Les colonies ont ensuite été sélectionnées et cultivées, sous agitation, à 37 ° C pendant 72 h dans 1 L de bouillon nutritif avec 5 μM du même antibiotique que celui utilisé pour la sélection.

Les cultures d'un litre précédemment décrites ont été utilisées pour analyser la production de β-lactamase induite par l'antibiotique présent dans les milieux. Après 72 h d'incubation, le milieu a été centrifugé deux fois (8000 xg, 10 min). Nous avons filtré le surnageant clarifié à travers un filtre à seringue de 0,2 μm pour éliminer les bactéries pathogènes restantes. La totalité du surnageant a ensuite été concentrée à l'aide d'unités de filtre centrifuge Millipore Sigma Ultra-15 avec un seuil de coupure de 10 kDa (n° de catalogue UFC901008).

TEM-1 a été exprimé dans Escherichia coli BL21 (DE3) avec le vecteur pET-TEM-1, extrait par choc osmotique et purifié par chromatographie chélatrice de Zn et filtration sur gel (sephacryl-100). Tris 50 mM, pH 8,0 et NaCl 150 mM ont été utilisés pour le stockage.

Les TEM-1 et β-lactamases purifiées dans l'activité du surnageant ont été déterminées par spectrophotométrie (spectramax-M5-reader) à température ambiante dans un tampon phosphate de potassium 50 mM (pH 7,0) qui contribue à la stabilité de l'enzyme à ces volumes dans un volume total de 100 µl dans les conditions avec la nitrocéfine (ε486 nm = 20 500 M-1 cm-1) comme substrat rapporteur. La nitrocéfine (0,001 à 100 μM) a été fraîchement préparée dans du tampon potassium 50 mM (pH 7,0). Les valeurs apparentes de Km et kcat ont été dérivées d'au moins quatre mesures de vitesse initiales indépendantes en appliquant un ajustement de régression non linéaire avec le modèle de cinétique enzymatique de Michaelis – Menten dans GraphPad Prism 9.

Des échantillons de surnageant concentrés (7,5 μL) ont été mélangés dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL avec 2 × coloration tampon Laemmli, Bio-Rad (2,5 μL). Les échantillons ont été chauffés au bain-marie pendant 10 min à 100 °C puis centrifugés (12 000 tr/min, 10 min). Les protéines du surnageant des agents pathogènes bactériens sélectionnés par un antibiotique ont été séparées par un gel de résolution Novex Tris – glycine à gradient SDS-PAGE à 10% (Invitrogen, Carlsbad, Californie, États-Unis). Après séparation par électrophorèse à 130 V pendant 1 h, le gel a été fixé dans 50 % MeOH, 10 % HoAC, 40 % H2O pendant 20 min. Les gels ont été placés dans un plateau en plastique contenant un volume approprié (100 à 250 ml) de solution de coloration (0,25 % de bleu de Coomassie R-250) jusqu'à ce que le gel ait une couleur bleue uniforme. La coloration était terminée lorsque le gel n'était plus visible dans la solution de colorant. Pour décolorer le gel, 5 % de MeOH et 7,5 % de HoAC dans 87,5 % de dH20 ont été utilisés jusqu'à ce que le fond soit transparent. Les gels ont été stockés dans 7% HoAC.

Pour la digestion des protéines, les bandes ont été coupées pour minimiser l'excès de polyacrylamide, divisées en un certain nombre de morceaux plus petits. Les morceaux de gel sont lavés à l'eau et déshydratés dans l'acétonitrile. Les bandes ont ensuite été réduites avec du DTT et alkylées avec de l'iodoacétamide avant la digestion en gel. Toutes les bandes ont été digérées dans le gel à l'aide de trypsine, en ajoutant 5 μL de trypsine ou de chymotrypsine à 10 ng/μL dans du bicarbonate d'ammonium 50 mM et en incubant une nuit de digestion à température ambiante pour obtenir une digestion complète. Les peptides qui se sont formés ont été extraits du polyacrylamide dans deux aliquotes de 30 μL d'acétonitrile à 50 % avec 5 % d'acide formique. Ces extraits ont été combinés et évaporés à < 10 μL dans Speedvac, puis remis en suspension dans de l'acide acétique à 1 % pour constituer un volume final d'environ 30 μL pour l'analyse LC-MS. Le système LC-MS était un système de spectrométrie de masse Bruker TimsTof Pro2 Q-Tof fonctionnant en mode ions positifs, couplé à une source d'ions CaptiveSpray (tous deux de Bruker Daltonik GmbH, Brême). La colonne HPLC était une colonne de chromatographie capillaire en phase inverse Bruker 15 cm x 75 μm id C18 ReproSil AQ, 1,9 μm, 120 Å. Des volumes de 1 μL de l'extrait ont été injectés et les peptides élués de la colonne par un gradient acétonitrile/0,1% d'acide formique à un débit de 0,3 μL/min ont été introduits dans la source du spectromètre de masse en ligne. Les digestions ont été analysées à l'aide d'une méthode d'accumulation parallèle-fragmentation en série DDA a été utilisée pour sélectionner les ions précurseurs pour la fragmentation avec un balayage TIMS-MS suivi de 10 balayages PASEF MS/MS. Le balayage de sondage TIMS-MS a été acquis entre 0,60 et 1,6 Vs/cm2 et 100–1700 m/z avec un temps de rampe de 166 ms. Le temps de cycle total pour les scans PASEF était de 1,2 s et les expériences MS/MS ont été réalisées avec des énergies de collision comprises entre 20 eV (0,6 Vs/cm2) et 59 eV (1,6 Vs/cm2). Les précurseurs avec 2 à 5 charges ont été sélectionnés avec la valeur cible fixée à 20 000 ua et le seuil d'intensité à 2 500 ua. Les précurseurs ont été dynamiquement exclus pendant 0,4 s. Les données ont été analysées en utilisant tous les spectres CID collectés dans l'expérience pour rechercher une base de données Ab compilée à l'aide d'Uniprot à l'aide du programme MSFragger. Les paramètres de cette recherche comprennent une précision de masse précurseur de 20 ppm et une précision de masse de fragment de 0,05 Da, des peptides entièrement tryptiques avec deux clivages manqués autorisés, la méthionine oxydée et l'acétylation N-terminale de la protéine en tant que modifications variables et la carbamidométhylation en tant que modification statique. L'identification des protéines et des peptides a été validée à 1 % FDR à l'aide d'une stratégie de base de données leurre.

Notre méthode d'alignement de séquence a été utilisée pour la recherche dans la base de données d'une manière simple. Les outils d'alignement de séquences multiples du package Schrödinger ver. 2019-3 basé sur l'algorithme classique de Smith-Waterman ont été utilisés. La base de données de séquences de comparaison a été fournie par UniProt et NCBI Protein Data Bank.

Les ensembles de données générés pendant et/ou analysés pendant l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. De plus, les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE avec l'identifiant d'ensemble de données PXD042336.

CDC. (éd. Département américain de la santé et des services sociaux) (CDC, 2019).

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Le soutien à la recherche de Woo Shik Shin a été fourni par la Northeast Ohio Medical University, College of Pharmacy. Le département des sciences pharmaceutiques de la Northeast Ohio Medical University a fourni toutes les ressources de recherche nécessaires.

Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (1R01AG076699 à Woo Shik Shin) et une subvention de démarrage / recherche translationnelle de la Northeast Ohio Medical University.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Trae Hillyer et Bogdan M. Benin.

Département des sciences pharmaceutiques, Northeast Ohio Medical University, Rootstown, OH, États-Unis

Trae Hillyer, Bogdan M. Benin, Noah Aguirre & Woo Shik Shin

Département de neurologie, Université de Californie, Los Angeles, Californie, États-Unis

Soleil Chuanqi

Protéomique et Métabolomique Core, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, États-Unis

Belinda Willard

Département de biologie intégrative et de physiologie, Université du Minnesota, Minneapolis, MN, États-Unis

Yuk Yin Sham

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TH et NA ont cultivé des échantillons d'Ab19606 et préparé des échantillons pour la protéomique. BW a effectué des mesures protéomiques et l'identification des peptides. CS a purifié et fourni la protéine témoin TEM-1. BMB a analysé les résultats. BMB et WSS ont rédigé le manuscrit. WSS a supervisé les travaux. WSS et YYS ont conçu le projet. TH et BMB ont contribué à parts égales à ce travail. Tous les auteurs ont discuté des résultats et commenté le manuscrit.

Correspondance avec Woo Shik Shin.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Hillyer, T., Benin, BM, Sun, C. et al. Une nouvelle stratégie pour caractériser le modèle de résistance aux médicaments induite par les antibiotiques β-lactamines chez Acinetobacter baumannii. Sci Rep 13, 9177 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36475-9

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Reçu : 08 décembre 2022

Accepté : 04 juin 2023

Publié: 06 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36475-9

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