Concevoir des micro-usines d'oxygène pour ralentir la progression tumorale via des micro-environnements hyperoxiques

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 4495 (2022) Citer cet article

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Alors que l'hypoxie favorise la carcinogenèse, l'agressivité tumorale, les métastases et la résistance aux traitements oncologiques, les impacts de l'hyperoxie sur les tumeurs sont rarement explorés car fournir un apport d'oxygène durable in vivo est un défi majeur. Ici, nous construisons des usines de micro-oxygène, à savoir des microcapsules de photosynthèse (PMC), par encapsulation de cyanobactéries acquises et de nanoparticules de conversion ascendante dans des microcapsules d'alginate. Ce système permet un apport d'oxygène durable grâce à la conversion du rayonnement externe en émissions de longueur d'onde rouge pour la photosynthèse des cyanobactéries. Le traitement PMC supprime la voie NF-kB, la production de HIF-1α et la prolifération des cellules cancéreuses. Le microenvironnement hyperoxique créé par un implant PMC in vivo inhibe la croissance et les métastases de l'hépatocarcinome et a des effets synergiques avec l'anti-PD-1 dans le cancer du sein. Les usines d'ingénierie de l'oxygène offrent un potentiel pour les études de biologie tumorale dans les microenvironnements hyperoxiques et inspirent l'exploration de traitements oncologiques.

L'hypoxie est la caractéristique la plus répandue des microenvironnements des tumeurs solides1,2 et résulte d'un déséquilibre entre un apport insuffisant en oxygène et une consommation accrue d'oxygène par les cellules cancéreuses à prolifération rapide. Par conséquent, les cellules cancéreuses ont recours à de multiples voies adaptatives et modifications génomiques pour survivre dans des environnements hypoxiques3. Le facteur de transcription facteur 1α inductible par l'hypoxie (HIF-1α), le médiateur le plus reconnu des réponses hypoxiques, joue un rôle central dans la stimulation de la néovascularisation dans les tumeurs pour améliorer l'apport d'oxygène et de nutriments4. Paradoxalement, ces vaisseaux sont souvent organisés de façon irrégulière (p. ex., structures tordues, hyperperméables et aveugles) et présentent des défauts de diffusion ou de perfusion d'oxygène5, entraînant des expansions des régions hypoxiques dans les tumeurs. Parallèlement, le microenvironnement hypoxique, une caractéristique des tumeurs malignes, a été signalé comme étant non seulement la principale barrière protégeant la tumeur de diverses thérapies en créant un environnement d'immunosuppression6, en activant la voie de réparation de l'ADN7 et en permettant le flux autophagique8, mais aussi un promoteur de la carcinogenèse9 , invasion tumorale et métastase1,2. Ces découvertes ont inspiré l'exploration de technologies pour convertir des microenvironnements hypoxiques en microenvironnements hyperoxiques pour la biologie tumorale ou des études thérapeutiques.

C'est un défi majeur de construire un microenvironnement hyperoxique durable dans les tumeurs en raison du manque de sources d'oxygène constantes et biocompatibles. Considérant que les microbes algaux sont les principaux fournisseurs d'O2 sur Terre, la photosynthèse dans les chloroplastes d'algues pourrait potentiellement être explorée pour des suppléments d'O2 dans les tumeurs. La machinerie photosynthétique nécessite une source lumineuse adaptée émettant des photons de 650 à 700 nm. Étant donné que les nanoparticules de conversion ascendante à base de terres rares (UCNP) ont montré une capacité extraordinaire à convertir les lasers biotransparents dans le proche infrarouge (NIR) en lumière visible10, ces matériaux pourraient être exploités pour fournir des photons disponibles dans la photosynthèse. Nous avons donc émis l'hypothèse qu'un microenvironnement hyperoxique de longue durée pourrait être créé par la construction rationnelle de microbes algaux et d'UCNP.

Dans cette étude, nous sommes les pionniers d'une microcapsule de photosynthèse (PMC) en encapsulant des cyanobactéries et des UCNP dans des microcapsules d'alginate (MC) qui peuvent être fabriquées par une technique de gouttelettes électrostatiques. Quatre souches de cyanobactéries ont été soumises à une sélection d'acclimatation pour acquérir une souche adaptée à l'accommodation des conditions physiologiques. Nous explorons de manière approfondie les impacts du rayonnement NIR, de la population cellulaire et de la dose d'UCNP sur la production d'O2 pour concevoir une formule optimisée de PMC. Les impacts des microenvironnements hyperoxiques créés par les PMC sont examinés dans neuf lignées cellulaires cancéreuses et deux modèles de tumeurs, y compris le cancer du sein orthotopique chez la souris et l'hépatocarcinome transplanté chez le lapin.

Pour démontrer notre hypothèse, nous avons d'abord tenté de concevoir le système PMC proposé, y compris la sélection de microbes algaux acclimatés aux conditions physiologiques, la synthèse d'UCNP compatibles avec la photosynthèse et l'encapsulation de microbes algaux et d'UCNP dans des MC. Quatre microbes algaux parents, c'est-à-dire la forme sphérique Synechocystis sp. 6803 (S. sp. 6803), Chlorella ellipsoidea (C. ellipsoidea), le Synechococcus allongé en forme de bâtonnet 7942 (S. allongé. 7942) et le Scenedesmus obliquus en forme de bateau (S. obliquus), ont été sélectionnés dans cette recherche (Figure 1 supplémentaire). Étant donné que ces microbes d'algues cultivés dans des milieux BG11 à 25 ° C ne peuvent pas survivre dans des milieux de culture de cellules de mammifères (par exemple, DMEM) à 37 ° C, ils ont été soumis à une procédure d'acclimatation qui a permis aux cellules de se développer dans des conditions physiologiques par alternances de température par étapes ( 25 à 37 °C) et la composition du milieu (milieu BG11 au DMEM). L'acclimatation pourrait être évaluée par l'évaluation de la densité cellulaire basée sur l'absorbance de la chlorophylle α à 650–700 nm11. Comme le montre la Fig. 2 supplémentaire, alors que la prolifération de S. obliquus et C. ellipsoidea était significativement inhibée à des températures> 32 ° C, S. sp. 6803 et S. allongés. 7942 ont pu s'acclimater aux augmentations de température. Des changements progressifs du milieu BG11 au DMEM nous ont permis d'acquérir un S. sp. 6803 (eS. sp. 6803), qui a maintenu son activité à 37 ° C dans du DMEM (Fig. 3 supplémentaire). Cette souche a donc été sélectionnée pour la construction de PMC. Nous avons ensuite synthétisé une série d'UCNPs avec différentes émissions par la méthode de croissance cristalline10. Une nanotige de NaYF4 dopée Er3 + - et Yb3 + (15, 3 × 30, 2 nm) s'est avérée émettre une forte fluorescence à 660 nm, correspondant parfaitement à l'absorbance de la chlorophylle α (Fig. 4 supplémentaire et Fig. 5 supplémentaire), qui est le principal composant responsable pour la photosynthèse. Ensuite, nous avons conçu les PMC en encapsulant des microbes algaux et des UCNP dans les microsphères d'alginate-calcium sous un champ électrostatique via un système de génération de gouttelettes électrostatiques. Comme le montre la figure 1, l'ensemble du processus implique quatre étapes : (i) mélange homogène de microbes algaux avec des UCNP dans de l'alginate de sodium ; (ii) dispersion d'une solution d'alginate de sodium en gouttelettes uniformes sous un champ électrostatique ; (iii) encapsuler les UCNP et les microbes par de l'alginate-calcium réticulé dans des solutions de CaCl2 ; et (iv) revêtement de microsphères d'alginate-calcium par de la poly-L-lysine (PLL), un polycation hydrosoluble résistant à la dégradation enzymatique et capable d'empêcher les fuites de microbes (Fig. 6 supplémentaire). Les PMC résultants ont été examinés par microscopie à luminescence à conversion ascendante. Alors que les MC vides et les MC encapsulés dans des algues n'avaient pas de signaux de fluorescence, les PMC émettaient une forte fluorescence rouge sous excitation à 980 nm (Fig. 2a). Ces résultats ont indiqué que les UCNP encapsulés conservaient parfaitement leurs propriétés optiques. Nous avons examiné de manière approfondie les impacts de la densité microbienne et de la concentration d'UCNP sur l'activité photosynthétique des PMC (Fig. 2b). Une formule optimisée de PMC (3 × 103 cellules d'algues et 0,67 μg d'UCNP par MC) a été acquise pour une production efficace d'oxygène (1,6 μg/min). La génération d'oxygène des PMC désignés dépendait de l'intensité et du temps d'exposition du rayonnement NIR, indiquant un apport en oxygène contrôlable (Fig. 7 supplémentaire). Les microbes algaux encapsulés dans les PMC ont survécu dans le DMEM pendant plus d'un mois (Fig. 8 supplémentaire).

(i) mélange homogène de microbes algaux avec des UCNP dans de l'alginate de sodium ; (ii) dispersion d'une solution d'alginate de sodium en gouttelettes uniformes sous un champ électrostatique ; (iii) encapsuler les UCNP et les microbes par de l'alginate-calcium réticulé dans des solutions de CaCl2 ; et (iv) revêtement de microsphères d'alginate-calcium par la poly-L-lysine (PLL).

a Imagerie de PMC construits. Les MC vides, les MC contenant des cellules d'algues (eS. sp. 6803@MCs) et les PMC entièrement construits ont été soumis à une imagerie par microscopie de luminescence à conversion ascendante à 980 nm. Le bord des MC est décrit par un contour blanc. b Une carte thermique présentant la production d'O2 par les PMC avec différentes formulations. Des cellules d'algues à 107-1011 cellules/mL, des UCNP à 0-100 mg/mL et 1 mL d'alginate de sodium ont été mélangés pour préparer différentes formulations de PMC par un système de génération de gouttelettes électrostatiques. Les PMC résultants ont été exposés à un rayonnement NIR de 900 mW/cm2 pendant 20 minutes pour mesurer les niveaux d'O2 à l'aide d'un compteur d'oxygène dissous portable. c Visualisation des espèces d'oxygène synthétisées dans les PMC par coloration DCFH. PMC, eS. sp. Les 6803@MC et les UCNP@MC cultivées dans l'obscurité pendant 12 h ont été incubées avec 10 μg/mL de DCFH pendant 10 min, puis exposées à un rayonnement NIR de 300 mW/cm2 à 980 nm pendant 0, 1, 3 et 10 min. Les microsphères traitées ont été immédiatement visualisées par microscopie confocale à 488 nm d'excitation. Le bord des MC est décrit par un contour blanc. d Image schématique montrant la détection de la pO2 dans les tumeurs. e Mesures des pressions partielles d'oxygène (pO2) dans les noyaux des tumeurs à différents moments. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± ET dérivées de trois tumeurs. f affichage visuel de la pO2 dans les tumeurs. Une électrode à oxygène de Clark a été utilisée pour mesurer la pO2 dans les tumeurs mammaires de souris recevant des traitements salins, PMC, NIR, oxygène hyperbare (60 %) et NIR-PMC. Les valeurs de pO2 ont été enregistrées dans des tumeurs à 5 mm de profondeur pendant 7 jours ou à différentes profondeurs de tumeurs 1 h après les traitements NIR-PMC. Les valeurs de pO2 à la plus grande section transversale de tumeurs ont été intégrées par Python pour les constructions des cartes thermiques. Le bord de la tumeur est décrit par un contour noir. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Ensuite, nous avons examiné la capacité d'oxygénation des PMC dans des solutions physiologiques ainsi que des tumeurs. Les PMC ont d'abord été incubés dans du DMEM à 37 °C. L'oxygène est souvent généré avec d'autres espèces d'oxygène dans la photosynthèse des chloroplastes12. La production de radicaux oxydatifs dans les PMC a été examinée par coloration à la 2′,7′-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH)13 pour évaluer l'activité photosynthétique. La DCFH non fluorescente pourrait être oxydée en 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCF), émettant une fluorescence verte dans des conditions hyperoxiques. Comme le montre la figure 2c, des signaux de fluorescence intenses ont été détectés dans des PMC entièrement construites, tandis que les PMC sans algues et sans UCNP ont montré des signaux limités. L'oxygène libéré dans le milieu a été contrôlé en continu pendant 24 h. Comme le montre la Fig. 9 supplémentaire, les PMC pouvaient synthétiser de manière stable l'oxygène, qui atteignait 6,2 ± 0,5 mg/L 1 h après l'exposition au NIR et diminuait lentement à 3,0 ± 0,3 mg/mL en 24 h. Compte tenu des pressions interstitielles à 20–40 mmHg dans les tumeurs solides14,15,16, leurs impacts sur la photosynthèse des PMC ont été examinés. Comme le montre la Fig. 10 supplémentaire, nous avons conçu un dispositif composé d'une seringue scellée de 10 ml, de poids calibrés et d'électrodes Clark pour la détection dynamique de la pression partielle d'oxygène (pO2) à différentes pressions. Alors que la pO2 dans le DMEM atteignait 105,7 ± 6,1 mmHg à pression atmosphérique normale, la pression supplémentaire avait peu d'effet sur les profils d'oxygénation des PMC. De plus, l'oxygénation des PMC a été évaluée dans les tumeurs mammaires. Comme le montre la Fig. 2d, e, la pO2 dans le noyau (~ 5 mm de la couche externe) des tumeurs a atteint des pics (27,2–35,4 mmHg) à 1 h après l'exposition NIR et a lentement diminué jusqu'à des niveaux basaux de 10,8–12,3 mmHg à 24h. Les courbes d'oxygénation affichaient des schémas similaires dans sept cycles d'exposition NIR, indiquant une activité photosynthétique stable des PMC dans les tumeurs. Par rapport à l'oxygène hyperbare, la pO2 dans les noyaux tumoraux a atteint des niveaux 6,7 fois plus élevés dans le traitement NIR-PMC. Des cartes thermiques ont été construites pour évaluer visuellement la pO2 de la couche externe de la tumeur au noyau interne (Fig. 2f). Alors que les tumeurs non traitées (témoins) présentaient une hypoxie sévère dans les tumeurs profondes, les couleurs vert jaunâtre des tumeurs traitées par NIR-PMC suggéraient des élévations significatives des niveaux d'oxygène. Ces résultats ont bien documenté la capacité d'oxygénation des PMC in vitro et in vivo.

Nous nous sommes alors demandé si l'apport d'O2 par les PMC pouvait avoir un impact sur la prolifération des cellules cancéreuses. Les effets des PMC ont été évalués dans neuf lignées de cellules cancéreuses, dont celles du sein (MCF-7, 4T1), du poumon (A549), du foie (HepG2, VX2), de l'intestin (HCT116), du pancréas (PANC-1), de l'estomac (MGC- 803) et cervicales (HeLa), à travers trois espèces de mammifères (humain, souris et lapin) et trois lignées cellulaires primaires (fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), cellules cardiaques et rénales). Les activités métaboliques cellulaires ont été examinées par un substrat colorimétrique dans un test MTS. Pour prévenir les effets cytotoxiques de la chaleur dans le rayonnement NIR, la dose d'exposition NIR a été fixée à 300 mW/cm2 pendant 20 min (Fig. 11 supplémentaire). Trois intervalles de rayonnement NIR ont été appliqués aux PMC en culture de 24 h pour créer un biocontexte hyperoxique avec des niveaux d'oxygène de 1,8 à 5,3 mg/L. Comme le montrent la figure 3a et la figure supplémentaire 12, les PMC couplées au NIR (NIR-PMC) avaient peu de cytotoxicité dans trois lignées cellulaires normales, mais inhibaient la prolifération de huit lignées cellulaires cancéreuses. Notamment, les milieux suffisants en oxygène ont complètement supprimé les duplications des cellules HCT116, HepG2, MCF-7 et 4T1. Nous avons examiné en détail les impacts des intégrations PMC, y compris les MC, les algues et les UCNP, sur les cellules MCF-7 et HepG2 avec ou sans rayonnement NIR. En conséquence, l'effet de suppression a été principalement détecté dans les cellules sous traitement NIR-PMC (Fig. 3b et Fig. 13 supplémentaire). Pour démontrer davantage ce point, nous avons visualisé les nouvelles cellules cancéreuses filles à l'aide d'un kit de test de prolifération BeyoClick-iT® EdU-594 composé d'EdU (5-éthynyl-2′-désoxyuridine) qui pourrait être incorporé dans l'ADN nouvellement synthétisé et marqué par fluorescence par une réaction de clic spécifique17. Comme le montre la figure 3c, le traitement NIR-PMC a supprimé de manière significative la proportion de cellules filles séparées des cellules du cancer du sein (MCF-7) et de l'hépatocarcinome (HepG2), comme en témoigne la réduction des cellules EdU-positives (rouge). Notamment, le milieu d'hyperoxie est devenu invalide une fois que l'oxygène dissous a été éliminé par purge de N2 (Fig. 14 supplémentaire), ce qui suggère que l'oxygène plutôt que les métabolites des cellules d'algues étaient responsables de l'effet de suppression des NIR-PMC. L'analyse par cytométrie en flux a indiqué peu de morts cellulaires apoptotiques (Fig. 15 supplémentaire).

a Évaluation de la prolifération cellulaire. Les cellules HCT116, 4T1, HepG2, VX2, MCF-7, PANC-1, MGC-803, HeLa et A549 incubées avec ou sans PMC (25 μL, 3,6 × 104/mL) ont été exposées à un rayonnement NIR de 300 mW/cm2 pendant trois intervalles. Après 24 h, la viabilité cellulaire a été examinée par des tests MTS (n = 6). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. ***p < 0,001 par rapport aux cellules témoins selon le test t de Student bilatéral. b Impacts des intégrations dans les PMC. Les cellules HepG2 ont été incubées avec des MC, des UCNP @ MC, des e-synechocystis @ MC et des PMC en présence ou en l'absence de rayonnement NIR pour l'évaluation de la viabilité cellulaire (n = 6). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. ***p < 0,001 et **p < 0,01 par rapport au groupe témoin selon le test t de Student bilatéral. c Visualisation confocale de nouvelles cellules filles. Les cellules HepG2 et MCF-7 après traitement NIR-PMC ont été colorées avec un kit de test BeyoClick-iT® EdU-594 (barre d'échelle : 20 μm) pour l'imagerie confocale. d Les effets cellulaires des NIR-PMC sur la voie de signalisation NF-κB. Les cellules HepG2 ont été prétraitées avec des NIR-PMC (rayonnement NIR de 300 mW/cm2 pendant trois intervalles). Après 24 h, toutes les cellules ont été prétraitées avec 20 nM de BMS et 2 µL de diméthylsulfoxyde (DMSO) (blanc) pendant 2 h avant stimulation avec 200 ng/mL de TNFα pendant 10 min. Les lysats cellulaires ont été collectés et soumis à une analyse Western blot de IκBα et IκBα phosphorylée (n = 3, les échantillons proviennent de la même expérience et que les transferts ont été traités en parallèle). Les rapports p-IκBα vs β-actine ont été déterminés par ImageJ 1.51. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. *p < 0,05 par rapport aux cellules témoins selon le test t de Student bilatéral. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Étant donné que les NIR-PMC avaient un effet limité sur les cellules primaires mais supprimaient de manière significative la prolifération des cellules cancéreuses, nous avons émis l'hypothèse que l'hyperoxie pourrait avoir un impact spécifique sur les signaux dans les voies de cancérogenèse. Étant donné que le facteur nucléaire kappa B (NF-κB), la phosphoinositol 3'-kinase (PI3K), la protéine kinase B (AKT), la cible mammifère de la rapamycine (mTOR), la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) et la kinase régulée par le signal extracellulaire ( ERK) jouent un rôle crucial dans la survie et la prolifération des cellules cancéreuses18,19,20,21, ils ont été examinés dans des cellules HepG2 par immunotransfert. Le facteur de croissance endothélial (EGF), l'insuline et le TNF-α ont été exploités comme inducteurs22,23,24, et la 3-méthyladénine (3-MA), le MK-2206, la rapamycine, le PD98059 et le BMS-345541 (BMS) ont été inclus comme inhibiteurs25, 26,27,28,29,30. Comme le montrent la figure 3d et la figure supplémentaire 16, une suppression significative de l'IκBα phosphorylé (p-IκBα) a été détectée dans les cellules traitées au PMC. En revanche, les NIR-PMC ont eu peu d'impact sur les expressions de ERK, PI3K, AKT et mTOR. Ces résultats ont indiqué que l'effet des NIR-PMC sur l'inhibition de la prolifération était principalement associé à la voie NF-κB. Pour confirmer davantage le rôle de NF-κB, nous avons tenté de modifier l'activité de NF-κB en présence ou en l'absence de PMC pour examiner la prolifération cellulaire en colorant de nouvelles cellules filles (Fig. 17 supplémentaire). La prolifération des cellules cancéreuses pourrait être inhibée par le BMS mais renforcée par le TNF-α en l'absence de PMC. Notamment, en présence de PMC, alors que BMS a montré un effet inhibiteur plus fort sur la croissance cellulaire, le TNF-α n'a pas réussi à stimuler les duplications cellulaires.

Des études substantielles ont montré que l'hypoxie est responsable de la suppression immunitaire du microenvironnement tumoral par la libération de HIF-1α et d'adénosine induite par l'hypoxie dans les cellules cancéreuses et l'inhibition de la fonction des cellules immunitaires en augmentant la quantité de récepteurs de l'adénosine A2A (A2AR)31,32 ,33. Nous avons émis l'hypothèse que l'hyperoxie par les NIR-PMC pourrait stimuler l'activité immunitaire en éliminant l'axe hypoxie/HIF-1α/adénosine/A2AR. Pour tester cette spéculation, nous avons examiné les effets des NIR-PMC dans des sphéroïdes de cellules cancéreuses construits par encapsulation de cellules HepG2 ou MCF-7 dans du Matrigel. Tout d'abord, l'hypoxyprobe FITC-MAb1 a été utilisé pour évaluer l'état de l'hypoxie dans les sphéroïdes de cellules cancéreuses. Comme le montre la figure 4a, une fluorescence verte intense a été observée dans les sphéroïdes non traités, indiquant une hypoxie sévère, tandis que le traitement NIR-PMC a élevé les niveaux d'oxygène et amélioré l'état de l'hypoxie. La quantification du facteur 1α inductible par l'hypoxie (HIF-1α) dans les lysats cellulaires par ELISA a indiqué que le traitement NIR-PMC réduisait considérablement les niveaux de HIF-1α de 335,7 à 148,3 pg / mg de protéine dans les sphéroïdes de cellules HepG-2 et de 614,6 à 107,9 pg / mg de protéine dans des sphéroïdes de cellules MCF-7 (Fig. 4b). Par conséquent, les productions d'adénosine ont respectivement diminué de 42, 9% et 71, 7% dans les sphéroïdes de cellules MCF-7 et HepG-2 (Fig. 4c). La production d'IFN-γ34,35 a été examinée pour évaluer la fonction effectrice des lymphocytes T après un traitement par hyperoxie. Ainsi, l'acétate de myristate de phorbol (PMA) a été inclus comme inducteurs d'activations des lymphocytes T. Comme le montre la Fig. 4d, e, en l'absence de PMA, les cellules T prétraitées avec ou sans NIR-PMC ne produisaient que des niveaux négligeables d'IFN-γ. En revanche, le pourcentage de cellules T productrices d'IFN-γ dans le groupe de traitement NIR-PMC était remarquablement élevé à 13, 5% en présence de PMA, ce qui était environ 2, 6 fois plus élevé que celui sans prétraitement NIR-PMC. Pour tester l'effet potentiel des NIR-PMC sur l'activité cytolytique des cellules NK, la lignée cellulaire de lymphome de souris dépourvue de CMH Yac-1 hautement sensible aux cellules NK a été utilisée comme cellules cibles36,37. Comme le montre la figure 4f, après co-culture pendant 6 h, jusqu'à 95,6 % des cellules Yac-1 ont été éliminées par les cellules NK lors du traitement NIR-PMC, et à l'opposé, seules 58,3 % des cellules Yac-1 ont été tuées. dans les groupes témoins. Ces résultats ont indiqué la redynamisation de la fonction effectrice des cellules T et NK dans un environnement hyperoxique créé par les NIR-PMC.

a Imagerie confocale de l'état hypoxique. Des cellules HepG2 et MCF-7 ont été incorporées dans du matrigel pour préparer des sphéroïdes. Après 7 jours d'incubation, les sphéroïdes construits ont été exposés à 3600/mL de PMC et ont reçu un rayonnement NIR de 300 mW/cm2 pendant trois intervalles. Les sphéroïdes traités ont été soumis à une coloration par le kit HypoxyprobeTM-1 Plus (vert) et Hoechst 33342 (bleu). b HIF-1α et productions d'adénosine c dans les sphéroïdes de cellules cancéreuses (n = 3). Les cellules dans les sphéroïdes ont été collectées et lysées pour la détection de HIF-1α ou d'adénosine par ELISA et LC-MS, respectivement. d Images représentatives et e quantification de l'expression de l'IFN-γ dans les lymphocytes T par analyse par cytométrie en flux (n = 3). Les cellules T ont été traitées avec 50 ng/ml de PMA et 1 µL/mL d'inhibiteur de Golgi pendant 18 h avec/sans NIR-PMC pendant trois intervalles. Les cellules traitées ont été fixées, perméabilisées et colorées par anti-IFN-γ-FITC pour analyse par cytométrie en flux. f Impacts de l'hyperoxie sur l'activité cytolytique des cellules NK (n = 3). Les cellules NK triées (2 × 105 cellules/puits) ont été mélangées avec des cellules Yac-1 dans des rapports de 1:1 ou 2:1 dans des plaques à 24 puits, et co-cultivées avec/sans PMC, suivies de trois intervalles de Exposition NIR. Après 6 h d'incubation, les mélanges cellulaires ont été collectés pour lyser les cellules Yac-1. La luminescence des lysats cellulaires a été mesurée par un lecteur de microplaques. Les données sont exprimées en moyenne ± SD. **p < 0,01 et ***p < 0,001 par rapport aux cellules Ctrl par test t de Student bilatéral. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Ensuite, nous avons examiné les impacts in vivo des suppléments d'oxygène sur l'hépatocarcinome par implantation in situ de PMC dans le foie de lapins. Pour déterminer une dose de rayonnement sûre et efficace in vivo, nous avons examiné les impacts du rayonnement NIR sur les changements pathologiques cutanés ainsi que sur la génération d'oxygène. Une dose de rayonnement NIR de 900 mW / cm2 pendant 20 min a été sélectionnée pour le traitement des animaux car elle créait un microenvironnement hyperoxique (2, 7–3, 4 mg / L) et empêchait les lésions tissulaires induites par l'hyperthermie (Fig. 18 supplémentaire). Plus de 65% des cyanobactéries présentes dans les PMC ont survécu dans le foie pendant au moins 1 mois (Fig. 19 supplémentaire). Comme indiqué dans le schéma de traitement (Fig. 5a), des lapins porteurs d'hépatocarcinome ayant reçu une injection intratumorale de PMC (500 μL, 3, 6 × 104 / mL) ont été exposés à un rayonnement NIR de 980 nm pendant 42 jours. Le traitement NIR-PMC a créé un microenvironnement tumoral hyperoxique de longue durée, mis en évidence par une réduction spectaculaire de l'expression de HIF-1α (Fig. 5b). Par conséquent, les cibles en aval de HIF-1α, y compris la protéine 3 interagissant avec les protéines BCL2/adénovirus E1B (BNIP-3), le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), le facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF-2), la métalloprotéinase-2 matricielle ( MMP2) et le facteur de croissance transformant alpha (TGF-α), ont considérablement diminué après le traitement NIR-PMC (Fig. 20 supplémentaire et Tableau supplémentaire 2). Ces cibles jouent un rôle crucial dans la survie, la prolifération et les métastases des cellules cancéreuses, et leur déclin implique la suppression de la croissance tumorale38,39,40,41.

a Illustration du traitement NIR-PMC chez des lapins porteurs d'hépatocarcinome. 14 jours après l'implantation de la tumeur (la taille des tumeurs est d'environ 1 cm3), 500 µL de PMC (3,6 × 104/mL) ont été injectés par voie intratumorale à des lapins, suivis d'un rayonnement NIR de 900 mW/cm2 pendant 42 jours. b Immunomarquage de HIF-1α dans les tumeurs hépatiques. Après 28 jours, les lapins ont été sacrifiés pour prélever des tissus tumoraux. Les échantillons de tissus ont été fixés dans du formol à 4 % pour la coloration immunohistochimique. Les ratios de cellules HIF-1α-positives (panneau de gauche) ont été calculés par un scanner de pathologie numérique (DMetrix). Les données sont présentées sous la forme de la moyenne ± ET dérivée de trois images de tumeurs hépatiques de lapin indépendantes. **p < 0,01 par rapport au véhicule témoin selon le test t de Student bilatéral. c Images CT axiales représentatives de la croissance tumorale. Des lapins porteurs de tumeurs ont été traités avec ou sans NIR-PMC. Des animaux sains, porteurs de tumeurs et traités par NIR-PMC ont été soumis à une imagerie CT à 0, 14, 28 et 42 jours. La forme/le bord des tumeurs de l'hépatocarcinome sont décrits par un contour jaune (barres d'échelle, 1 cm). d Mesure de la taille des tumeurs par images CT. Les tailles des tumeurs de l'hépatocarcinome ont été mesurées par Neusoft PACS/Ris V5.5 à 28 jours après le traitement (n = 3). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. **p < 0,01 par rapport aux données des lapins porteurs d'hépatocarcinome non traités selon le test t de Student bilatéral. e Images CT axiales représentatives des métastases tumorales pulmonaires. Les poumons des animaux ont été imagés par CT à 0, 14, 28 et 42 jours après le traitement. Les nodules de métastases pulmonaires sont décrits par des flèches jaunes. f Le nombre de nodules de métastases pulmonaires dans les poumons de lapin (n = 3). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. *p < 0,05 par rapport aux animaux non traités selon le test t de Student bilatéral. g Courbes de Kaplan-Meier montrant les taux de survie des lapins indiqués à 140 jours (n = 10). Les données sont présentées sous la forme *p < 0,05, par rapport aux données des lapins porteurs d'une tumeur hépatocarcinome non traités selon le test Log rank du logiciel SPSS Statistics 17.0. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

La croissance tumorale a été examinée par imagerie CT pendant 42 jours (Fig. 5c). Alors que la taille des tumeurs chez les lapins non traités a rapidement augmenté à 4 cm3 le 14e jour et à 16 cm3 le 28e jour, le traitement NIR-PMC a complètement inhibé la croissance tumorale en 14 jours et a affiché une lente augmentation de la taille des tumeurs à 4 cm3 le 28e jour. (Fig. 5d). Le poumon étant l'organe cible le plus courant pour les métastases d'hépatocarcinome42, nous avons également examiné cet organe par imagerie CT. Comme le montre la figure 5e, des signes notables de métastases ont pu être différenciés dans les poumons de lapins porteurs de tumeurs non traités à 14 jours, et un grand nombre de foyers tumoraux (51 ± 25/poumon) se sont formés le 28e jour. Notamment, il y avait peu de métastases pulmonaires détectables dans les traitements NIR-PMC, même au 42e jour (Fig. 5f, Fig. 21 supplémentaire). De manière constante, les coupes de foie de lapins recevant un traitement NIR-PMC ont montré une réduction spectaculaire de la molécule d'adhésion cellulaire vasculaire-1 (VCAM-1) 43 (Fig. 22 supplémentaire). Les diagrammes de Kaplan-Meier pour les comparaisons des taux de survie ont été générés par une surveillance quotidienne continue des animaux au moment de l'état moribond ou de la mort spontanée. Les tests de log-rank ont ​​démontré un bénéfice de survie statistiquement significatif (p < 0,05) pour le traitement NIR-PMC par rapport au traitement témoin véhicule (Fig. 5g). Notamment, deux lapins sur dix ont vécu plus de 140 jours et ont été presque guéris, car il n'y avait pas de nodules tumoraux détectables dans le foie et les poumons par imagerie CT et examen ex vivo (Fig. 23 supplémentaire). À notre grande surprise, des PMC luminescentes pouvaient encore être observées dans le foie et conservaient des morphologies sphériques (Fig. 23 supplémentaire). Ces résultats ont indiqué que le microenvironnement hyperoxique créé par les NIR-PMC pourrait ralentir considérablement la progression tumorale, inhiber les métastases tumorales et améliorer les taux de survie des lapins porteurs d'hépatocarcinome.

Étant donné que les espèces d'oxygène ont été largement rapportées comme conditions préalables à l'activation immunitaire, nous avons émis l'hypothèse que des suppléments d'oxygène de longue durée par les NIR-PMC pourraient faciliter l'immunothérapie en activant les réponses immunitaires adaptatives dans le microenvironnement tumoral. Nous avons vérifié cela par analyse LC-MS de l'adénosine et immunomarquage de l'expression de CD4, CD39, CD206 et CD73 dans un modèle de tumeur mammaire orthotopique en inoculant des cellules tumorales 4T1 (fLuc-4T1) transfectées par la luciférase de luciole dans les coussinets mammaires de souris BALB/c. . Comme le montrent les Fig. 6a, b, le traitement NIR-PMC a significativement amélioré la production de HIF-1α et d'adénosine, amélioré l'expression de CD4 et réduit les expressions de CD39, CD206, CD73 et A2AR dans les coupes tumorales; cela indiquait que les cellules T auxiliaires, les cellules B et les cellules NK étaient activées et que la différenciation des macrophages M1 dans le microenvironnement tumoral s'était produite45,46. Par conséquent, un effet thérapeutique synergique pourrait être attendu pour un traitement combiné des NIR-PMC et des inhibiteurs de point de contrôle. Les souris porteuses de tumeurs examinées par imagerie par bioluminescence (BLI) ont été séparées au hasard en quatre groupes : aucun traitement (contrôle du véhicule), traitement NIR-PMC, traitement anti-PD-1 (200 μg/souris deux fois par semaine) et cotraitement avec NIR -PMC et anti-PD-1. La figure 6c affiche le schéma de traitement combiné. Comme le montre la figure 6d, une croissance tumorale rapide a été détectée chez des souris porteuses de tumeurs non traitées par la luminescence intensive des cellules 4T1 ainsi que dans les images en champ clair. La prolifération rapide des cellules cancéreuses du sein a entraîné une carence en nutriments et une nécrose cellulaire, comme en témoigne la diminution de la luminescence dans les noyaux tumoraux. Alors que le co-traitement avec les NIR-PMC et l'anti-PD-1 a montré un effet thérapeutique puissant, les traitements NIR-PMC et anti-PD-1 ont simplement supprimé la croissance tumorale au cours des 2 premières semaines, mais ont ensuite augmenté rapidement. Ce résultat a été confirmé par les données sur le volume de la tumeur. La taille des tumeurs en co-traitement était trois fois plus petite que celle du traitement anti-PD-1 (Fig. 6e, Fig. 24 supplémentaire). Les métastases tumorales ont également été examinées dans les poumons d'animaux. Comme le montre la figure 6f, alors que l'anti-PD-1 avait un effet limité sur les métastases tumorales, le traitement NIR-PMC réduisait de manière significative les nodules tumoraux dans les poumons disséqués. Notamment, il n'y avait pas de métastases tumorales pulmonaires détectables dans le groupe de cotraitement. Nous avons également comparé les taux de survie des animaux dans les différents traitements (Fig. 6g). Tous les animaux porteurs de tumeurs non traités étaient soit morts, soit moribonds en 25 jours, alors que les traitements NIR-PMC ou anti-PD-1 prolongeaient significativement la survie des animaux (+ 40 %). Fait intéressant, aucun décès d'animal n'a été observé après co-traitement pendant 50 jours, et 8 souris sur 10 ont survécu pendant plus de 60 jours. Dans l'ensemble, ces données suggèrent que la combinaison d'implants PMC avec des inhibiteurs de point de contrôle immunitaire a montré un fort effet synergique (IC = 0,23) chez les souris porteuses d'un cancer du sein.

a Images représentatives de la coloration immunohistochimique (CD4, CD39, CD206, CD73 et A2AR) des tumeurs du sein. b Productions de HIF-1α et d'adénosine dans les tumeurs mammaires orthotopiques. HIF-1α ou adénosine dans les lysats tumoraux ont été détectés par ELISA et LC-MS, respectivement (n = 6 et 3). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. * p < 0, 05, *** p < 0, 001 par rapport aux souris atteintes d'un cancer du sein non traitées par le test t de Student bilatéral. c Illustration schématique d'un traitement combiné avec NIR-PMC et anti-PD-1. À 7 jours après l'implantation de la tumeur (taille de la tumeur ~ 100 mm3), des PMC (25 μL, 3,6 × 104/mL) ont été injectés par voie intratumorale à des souris porteuses de tumeur, puis les souris ont été soumises à un rayonnement NIR de 300 mW/cm2 pendant 28 jours. Une seule injection de PMC a été administrée tout au long de la procédure de traitement de la tumeur. Chaque souris a reçu 10 mg/kg d'anti-PD-1 deux fois par semaine. d Image de bioluminescence (BLI) et images en champ clair (BF) de souris porteuses d'un cancer du sein. Les animaux ayant reçu différents agents thérapeutiques ont été soumis à une imagerie par bioluminescence par caméra et un système de spectre d'imagerie IVIS à 0, 7, 14, 21 et 28 jours. e, Courbes de croissance tumorale moyenne des souris. Le volume tumoral des souris individuelles a été mesuré par un pied à coulisse tous les 2 jours pendant 20 jours (n = 6). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. ***p < 0,001 par rapport aux souris atteintes d'un cancer du sein non traitées selon le test t de Student bilatéral. f Imagerie ex vivo des métastases pulmonaires. Les animaux ayant reçu différents traitements ont été sacrifiés à 21 jours pour la visualisation des nodules métastatiques dans les poumons. Les nodules des métastases pulmonaires sont décrites par un contour noir. g Courbes de Kaplan-Meier montrant les taux de survie des souris indiquées à 60 jours (n = 10). Les données sont présentées sous la forme ***p < 0,001, par rapport aux données des lapins porteurs d'une tumeur hépatocarcinome non traités selon le test Log rank du logiciel SPSS Statistics 17.0. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour évaluer la biosécurité des NIR-PMC chez les animaux, les PMC ont été administrées à des souris saines par injection intrapéritonéale ou sous-cutanée et exposées à un rayonnement NIR. Les tissus animaux ont été prélevés pour des examens histologiques. Comme le montre la Fig. 25 supplémentaire, la coloration H&E a montré des changements pathologiques négligeables dans tous les organes testés, et la coloration TUNEL n'a indiqué aucune mort cellulaire nécrotique dans les coupes de peau. Bien que les résultats des tests sanguins aient montré des modifications limitées des plaquettes sanguines, des neutrophiles et des monocytes au 1er ou 3e jour après les injections, ils ont tous récupéré au 8e jour. Ces résultats ont bien démontré la biosécurité des PMC (tableau supplémentaire 4 et tableau supplémentaire 5).

Les stratégies thérapeutiques tumorales reposent sur notre compréhension des mécanismes de cancérogenèse. Alors que la sélection somatique est souvent reconnue comme la principale cause de la carcinogenèse, des quantités importantes de recherches ont visé à la découverte de chimiothérapies ou de physiothérapies pour éliminer les cellules mutantes7,47. Bien que des millions de patients atteints de cancer aient réussi à prolonger leur vie en raison de la destruction des tumeurs, les effets secondaires, la résistance aux médicaments48 et les métastases tumorales49 sont devenus de formidables obstacles. Cela a nécessité de repenser les stratégies thérapeutiques contre le cancer. Des intérêts de recherche substantiels ont été suscités pour améliorer les microenvironnements tumoraux hypoxiques. Une chambre hyperbare est une installation conventionnelle dans les cliniques pour élever les niveaux d'oxygène dans le sang. Elle a été découverte par Joseph Priestley en 1775, mais la première application thérapeutique a été menée dans le mal de décompression 150 ans plus tard50. Par la suite, ces installations ont également été utilisées pour la chirurgie cardiaque51, les maladies infectieuses52 et les thérapies antitumorales53. Cependant, la faible spécificité vis-à-vis des tissus cibles et la faible efficacité de l'oxygène hyperbare limitent ses applications chez les patients cancéreux53. Pour surmonter ces limites, des transporteurs de médicaments ont été explorés pour délivrer spécifiquement de l'oxygène dans les tumeurs. Par exemple, Liang et al. ont conçu des nanoparticules O2@PFOB@PGL, qui pourraient agir comme des réservoirs d'oxygène importants et fournir efficacement de l'oxygène aux tumeurs hypoxiques pour améliorer la thérapie photodynamique54. Les nanoparticules à base de platine pourraient réagir avec le H2O2 endogène pour générer de l'O2 à l'intérieur du site tumoral et améliorer le microenvironnement hypoxique pour la thérapie combinée55,56. Les perfluorocarbures (PFC), des matériaux synthétiques présentant une forte capacité de charge en oxygène, ont pu décharger l'oxygène dans un microenvironnement tumoral hypoxique57. Cependant, ces approches pourraient simplement fournir des suppléments d'O2 transitoires. Ici, nous avons construit une usine de micro-oxygène intelligente par encapsulation d'UCNP et d'algues dans des microcapsules. Contrairement à la stratégie d'apport d'oxygène rapportée, les PMC résultants ont exploité des lasers NIR pour contrôler la photosynthèse des algues et permettre des suppléments d'oxygène de longue durée. Bien que les NIR soient appliqués quotidiennement aux animaux, la pO2 dans les tumeurs a atteint des pics (27,2 à 35,4 mmHg) à 1 h après l'exposition au NIR et est revenue à l'état hypoxique (10 mmHg) en 24 h. La supplémentation périodique en oxygène peut avoir un impact sur le réseau métabolique et les phénotypes des cellules cancéreuses, qui doivent être pris en compte dans les études de suivi. À cet égard, un antagonisme durable des microenvironnements hypoxiques dans les tumeurs peut supprimer la duplication cellulaire et ralentir la progression tumorale. Nos résultats chez les lapins porteurs d'hépatocarcinomes ont soutenu cette hypothèse, car aucun agent tueur de tumeurs n'a été inclus. Notamment, chez les dix animaux testés, deux lapins étaient sans cancer, car ils vivaient cinq fois plus longtemps (> 140 jours) que les animaux non traités (durée moyenne de survie ~ 27 jours) et n'avaient pas de ganglions tumoraux détectables. Cependant, ces résultats peuvent nécessiter plus de validation sur différents modèles de tumeurs.

Bien que la chirurgie soit le premier choix pour 30 à 40 % des patients atteints de cancer à chaque stade précoce (stade 0) ou précoce (stade I)58,59, les PMC peuvent être administrés seuls ou peuvent agir en synergie avec les effets de la chimioembolisation transartérielle (TACE) et thérapies interventionnelles, immunitaires et ciblées chez les patients atteints de cancer à des stades intermédiaires ou avancés (> stade II) pour établir un contrôle local et une palliation. Les PMC ont été délibérément conçus pour accueillir le dispositif interventionnel. Bien que l'injection intratumorale ait été choisie pour l'administration des PMC chez les animaux, les PMC pourraient être appliquées chez les patients humains par chimioembolisation artérielle transcathéter. Pour faciliter les applications cliniques futures, la dose et la durée du rayonnement NIR doivent être soigneusement examinées. En prenant l'hépatocarcinome comme exemple, un rayonnement NIR de 900 mW/cm2 à 980 nm a été appliqué à des lapins pendant 60 min/jour. Étant donné que la profondeur de l'hépatocarcinome chez le lapin est de 0,3 à 0,7 cm, la tumeur a reçu un rayonnement de 300 à 500 mW/cm2 après pénétration dans le ventre de l'animal60. Pour acquérir une telle intensité d'excitation chez les patients humains, la dose de rayonnement doit être augmentée à 2000 mW/cm2 ou la durée doit être étendue à 180 min car les hépatocarcinomes chez les patients humains sont souvent plus profonds que chez les lapins61,62,63 et parce que l'intensité du rayonnement NIR à 980 nm diminuerait à <30% après la pénétration de tissus abdominaux de 0,7 à 1,0 cm chez l'homme. Cependant, cette quantité de rayonnement NIR peut induire des dommages d'hyperthermie. Alternativement, le rayonnement NIR-II à 1200-1700 nm serait plus adapté aux applications cliniques, car les photons NIR-II ont une capacité de pénétration beaucoup plus profonde que les lasers NIR à 980 nm64. Les UCNP avec des excitations dans la région NIR-II pourraient être exploitées pour construire des PMC pour des applications potentielles dans les cliniques. Étant donné que la thérapie interventionnelle est un traitement conventionnel chez les patients atteints d'hépatocarcinome, les PMC sont un implant prometteur pour les applications cliniques.

En plus du modèle d'hépatocarcinome, nous avons examiné les effets des PMC chez des souris porteuses d'un cancer du sein. Les effets des différents constituants des PMC ont été examinés en détail. Conformément aux résultats in vitro (Fig. 3b), les effets thérapeutiques ont été principalement observés chez les animaux ayant reçu un traitement NIR-PMC (Fig. 26 supplémentaire et Fig. 27 supplémentaire). La biodistribution des PMC dans les tumeurs a été examinée par observation visuelle de la luminescence, et leurs emplacements ont peu changé (Fig. 28 supplémentaire). Il a été rapporté que l'oxygène active les réponses immunitaires antitumorales, telles que la différenciation des macrophages associés aux tumeurs M2 (TAM) en M165 et l'activation des cellules T66 et des cellules NK par la synthèse de radicaux superoxydes67. Hatfield et al. ont proposé de supprimer l'axe hypoxie/HIF-1α/adénosine/A2AR par des agents oxygénants pour améliorer l'immunothérapie anticancéreuse ou mettre en synergie d'autres traitements oncologiques31,44. Notre étude a démontré que les NIR-PMC pouvaient améliorer de manière significative l'état d'hypoxie et inhiber la production de HIF-1α et d'adénosine dans les sphéroïdes de cellules cancéreuses et les tumeurs du sein. De plus, l'hyperoxie par les NIR-PMC pourrait revigorer la fonction effectrice des cellules T et NK en termes de production d'IFN-γ et de capacité cytolytique in vitro. Les tumeurs traitées par NIR-PMC ont montré une expression plus faible d'A2AR mais une expression accrue de CD4, suggérant l'apparition d'une réponse immunitaire anticancéreuse accrue dans les tumeurs du sein. La combinaison de NIR-PMC avec des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires a montré des avantages considérables en termes de survie chez des souris porteuses de tumeurs mammaires. Ces résultats appuient fortement la stratégie thérapeutique proposée par Hatfield et al.

La métastase tumorale est un processus complexe impliquant la dissémination du cancer ; transition épithéliale-mésenchymateuse ; et invasion par migration collective, circulation des cellules cancéreuses, interaction avec les cellules immunitaires, colonisation métastatique, etc. Quelques biomolécules, dont FAT168, les protéines ribosomales69, la protéine transmembranaire CCDC2570, Nrf271 et la E-cadhérine72, se sont récemment avérées réguler la progression des métastases. De plus, en tant que facteur microenvironnemental puissant, il a été rapporté que l'hypoxie favorise plusieurs étapes (par exemple, l'invasion, la migration, l'intravasation et l'extravasation) au sein de la cascade métastatique1. Bien que les métastases tumorales soient la principale cause d'échec thérapeutique chez les patients cancéreux et soient responsables de 90 % de la mortalité liée au cancer73, il existe peu d'interventions cliniques. Cependant, l'usine d'oxygène in vivo construite dans cette étude pourrait être potentiellement exploitée dans les traitements contre le cancer pour la suppression des métastases tumorales. Les implants PMC ont considérablement empêché les métastases tumorales dans les modèles de cancer du sein orthotopique et d'hépatocarcinome transplanté. Les microenvironnements hyperoxiques créés par les PMC NIR peuvent bloquer l'invasion des cellules cancéreuses en antagonisant les signaux de métastases74.

En résumé, nous avons construit avec succès des usines à oxygène (PMC) en encapsulant des cyanobactéries et des UCNP dans des microcapsules d'alginate-polylysine. Les PMC ont permis la photosynthèse sous rayonnement NIR et ont fourni une oxygénation durable et contrôlable dans des contextes biologiques. L'O2 complété par les PMC a inhibé la production de HIF-1α et l'activation de NF-κB dans les cellules cancéreuses et a considérablement empêché la duplication des cellules cancéreuses de manière non toxique. Des microenvironnements hyperoxiques in vivo ont été créés par des implants de PMC dans des hépatocarcinomes orthotopiques et des tumeurs mammaires et ont inhibé de manière significative la croissance tumorale et les métastases. Un puissant effet synergique a été démontré dans le cancer du sein de souris recevant un co-traitement avec des implants PMC et un inhibiteur de point de contrôle (anti-PD-1). Dans l'ensemble, nos résultats ont démontré l'effet suppresseur du microenvironnement hyperoxique sur la progression tumorale.

Les anticorps pour Western-blot dans cette étude, y compris anti-phospho-IκBα (Cat. 9246), anti-IκBα (Cat. 4814), ont été achetés auprès de Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, USA). 3-Methyladenine (HY-19312), MK-2206 (HY-10358), Rapamycin (HY-10219) et PD98059 (HY-12028) et IL-2 (HY-P7077) ont été achetés chez MedChemExpress (New Jersey, USA) . Poly-L-Lysine (MW : 15000–30000, P4832), BMS-345541 (Cat. 401480), PMA (P1585) et Anti-β-actin anticorps (A2066) ont été achetés chez Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo , ETATS-UNIS). L'anti-PD-1 a été acheté auprès de BioXCell (BE0146, Liban, États-Unis). Les kits de test MTS ont été achetés auprès de Promega (Madison, WI, USA). La pénicilline, la streptomycine, la trypsine-EDTA et le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et le milieu RPMI-1640 ont été achetés auprès du laboratoire Hyclone (South Logan, Utah, États-Unis). L'anti-AKT (bsm-33278M) a été acheté chez Bioss (Pékin, Chine). L'anti-PI3K (AF6241), l'anti-phospho-PI3K (AF3242) ont été achetés chez Affinity Biosciences (USA). L'insuline, Hoechst 33342, le lysat RIPA, le DCF-H, le kit de test SYBR Green, le kit de coloration LIVE/DEAD et le kit de test Click-iT®EdU-594 ont été achetés auprès de Thermo Fisher Scientific (Grand Island, NY, USA). protéine recombinante TNF-α (ab9642), EGF (ab9697), anti-phospho-AKT (ab38449), anti-mTOR (ab134903), anti-phospho-mTOR (ab109268), anti-ERK (ab32537) et anti-phospho- ERK (ab214036) a été acheté chez Abcam (Shanghai, Chine). 5-FU (F100149) ont été achetés chez Aladdin (Shanghai, Chine). Le kit de coloration HIF-1 alpha a été acheté auprès de R&D (Minnesota, USA). L'inhibiteur de Golgi (Cat. 554724), le tampon Cytofix/Cytoperm (Cat. 554722), le tampon Perm/Wash (Cat. 554723) et l'anti-IFN-γ-FITC (Cat. 554411) ont été achetés auprès de BD (Biosciences, Bedford, MA ). L'anticorps anti-CD28 de souris (Cat. 102102) et l'anticorps anti-CD3 de souris (Cat. 100302) ont été achetés auprès de Biolegend (Shanghai, Chine). Le kit HypoxyprobeTM-1 Plus a été acheté auprès de HPI Inc. (Burlington, MA, USA). Le kit de test de mort cellulaire apoptotique Annexin V-FITC/PI (abs50001) était Absin Bioscience Inc (Shanghai, Chine). L'IL-15 (CLY200-07AF) a été acheté auprès de Cedarlane (Canada). Le chlorhydrate de xylazine a été acheté auprès de Shengda Animal Products Co., Ltd (Jilin, Chine). La membrane PC Transwell-24 (Cat. 3422) et la matrice Matrigel ont été achetées auprès de Corning (New York, États-Unis). Le milieu de croissance cellulaire Blue Green Algal (BG-11) a été acquis auprès de l'Institut d'hydrobiologie (Wuhan, Chine). L'alginate de sodium (poids moléculaire, 460 kDa; rapport molaire de l'acide mannuronique à l'acide guluronique, 2/1) a été acheté auprès de Qingdao Bright Moon Seaweed Group Co., LTD (Qingdao, Chine). Des nanoparticules de conversion ascendante (NaYREF4, RE : Yb, Er@NaYF4) ont été synthétisées selon une méthode rapportée75. Tous les autres réactifs étaient de qualité analytique.

Naturel Synechocystis sp. 6803 (n° de catalogue FACHB-898), Synechococcus elongates 7942 (n° de catalogue FACHB-805), Scenedesmus obliquus (n° de catalogue FACHB-417) et Chlorella ellipsoidea (n° de catalogue FACHB-40) acquis auprès de l'Institut d'hydrobiologie ( Wuhan, Chine) ont été soumis à une évolution sélective pour l'acclimatation des conditions physiologiques par des alternances progressives des conditions de croissance, y compris la température (25 à 37 ° C) et la composition du milieu (BG11 à DMEM). La température de culture et les compositions des milieux ont été progressivement modifiées pour permettre l'évolution des microbes pour la survie dans des conditions physiologiques76,77,78. En détail, 3 mL de microbes d'algues en phase stationnaire (1,0 × 108 cellules/mL) ont été dispersés dans 10 mL de milieu BG11 dans des flacons à fond déflecteur avec des bouchons ventilés (n° de catalogue 4116-0125, Thermo Fisher Scientific Inc.) dans un agitateur pour changement progressif des conditions de culture. Des microbes d'algues cultivés à 25°C ont été utilisés comme contrôle. La prolifération cellulaire a été calculée en utilisant Eq. (1) en détectant la valeur de densité optique à 660 nm (OD660) :

Où VAT et VmT ​​sont les valeurs OD660 des microbes algaux et des milieux de culture, respectivement, dans les conditions testées ; VA et VM sont les valeurs OD660 des microbes algaux et du milieu BG11, respectivement, dans des conditions de culture normales (25 ° C).

Une fois que les cellules se sont adaptées à la température testée et ont montré une prolifération cellulaire > 85 %, nous avons augmenté la température de culture (1 °C). Sinon, nous avons maintenu la température pendant encore 24 h. Après 30 jours de culture, les microbes algaux évolués ont été acquis et conservés dans du milieu BG11 à 37 ° C pour des tests ultérieurs. Ensuite, nous avons répété la procédure ci-dessus en changeant progressivement la composition du milieu de BG11 à DMEM. Le Synechocystis évolué sp. 6803 cultivé à 37 ° C dans du DMEM a été noté eS. sp. 6803.

eS. sp. 6803 a été recueilli par centrifugation à 1000 × g pendant 10 min (Centrifuge 5810 R, Eppendorf) dans des tubes de 50 mL et remis en suspension dans du PBS pour la construction PMC. Les cellules en suspension ont été mélangées avec des UCNP aux concentrations souhaitées dans des solutions d'alginate de sodium à 1,5 % en poids. Après vortex, le mélange a été extrudé à travers une aiguille de 0,5 mm dans une solution de CaCl2 0,1 M (bain gélifiant) avec un générateur de gouttelettes électrostatique pour préparer des billes d'alginate-Ca. Les perles ont été trempées dans une solution de polylysine à 0, 05% en poids (rapport volumique à 1: 10) pendant 10 minutes pour former un revêtement de polylysine. Les microcapsules enrobées ont été mises en suspension dans 5 ml de PBS et comptées au microscope. Tous les PMC fraîchement préparés ont été cultivés dans l'incubateur éclairant (HerryTech KE-200, Shanghai, Chine) à 37 ° C pour d'autres utilisations.

La morphologie et la taille des PMC ont été déterminées par microscopie (FV1200, Olympus, Tokyo, Japon). MC vides, eS. sp. 6803@MCs et PMCs à 3600/mL ont été ajoutés dans une chambre à huit puits pour l'évaluation des activités de photoluminescence par microscope confocal à conversion ascendante avec un objectif 20× à 980 nm d'excitation laser. Les spectres de photoluminescence des UCNP ont été mesurés avec un analyseur fluorimétrique Edingbour NanoSpectralyzer (Applied NanoFluorescence, FLS980). Pour acquérir le profil de libération d'oxygène, des PMC fraîchement préparées à 3600/mL ont été mises en suspension dans 10 mL d'eau sans oxygène qui a été soumise à une extraction sous vide de 1 h (1,45 × 10−3 psi) avec reflux de CO2. Les suspensions de PMC (10 ml) dans des tubes Eppendorf transparents ont été exposées à un rayonnement de 980 nm à 0, 100, 300, 900 mW/cm2 pendant 0 à 60 min. Un compteur d'oxygène dissous portable (capteur d'oxygène JPB-70A, Qiwei Instrument Co., Ltd. Hangzhou, Chine) a été appliqué pour enregistrer les concentrations d'oxygène dissous. Les suspensions contenant des UCNP@MC ont également été incluses comme blanc.

Les cellules HCT116, HepG2, VX2, MCF-7, PANC-1, MGC-803, 4T-1, HeLa et A549 ont été achetées auprès de l'ATCC (USA). Une analyse STR a été réalisée pour authentifier la cellule HeLa dans notre étude. Les locus STR sont amplifiés à l'aide d'amorces PCR marquées par fluorescence qui flanquent les régions hypervariables. Le résultat a montré que la cellule HeLa utilisée dans notre étude était associée à HeLa dans l'ATCC (tableau supplémentaire 6). Les cellules Yac-1 ont été achetées auprès de la National Collection of Authenticated Cell Caltures (Shanghai, Chine). Des cellules MEF (fibroblastes embryonnaires de souris) ont été données par le Dr Sudan He (Suzhou Institute of Systems Medicine, Chinese Academy of Medical Science, Chine). Des cellules cardiaques et rénales primaires ont été acquises à partir de souris BALB/c. En détail, le cœur et le rein de souris disséqués ont été coupés en petits morceaux (<3 mm), suffisamment lavés par du PBS froid (4 ° C) pour éliminer les cellules sanguines et transférés dans des tubes de dissociation contenant 5 ml de solutions de travail de kits de dissociation cardiaque ou rénale ( Bio-leader Inc, Jiangxi, Chine). Les tubes ont été fixés sur le manchon d'un dissociateur de tissus (Bio-leader Inc, Jiangxi, Chine) pendant 1 min de broyage à 100 g (30 s allumé, 30 s éteint), suivi d'une digestion enzymatique de 60 min à 37 °C. Les suspensions cellulaires ont été recueillies par filtration (70 μm). Les culots de cellules cardiaques et rénales ont été comptés et remis en suspension dans des milieux de culture cellulaire. Toutes les lignées cellulaires ont été cultivées dans du milieu DMEM ou du milieu RPMI-1640 additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (Gemini, Woodland, États-Unis), 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine à 37 °C 5 % de CO2 ou en condition hypoxique ( 2% O2 et 5% CO2).

Les cellules testées ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à 5 × 103/puits pour une incubation d'une nuit, suivie de l'ajout de 25 μL de PBS, de MC vides, d'UCNP@MC et de PMC (25 μL, 3,6 × 104/mL). Les cellules et les PMC ont été cultivées dans une atmosphère hypoxique humidifiée avec 2 % d'O2 et 5 % de CO2 à 37 °C pendant 24 h avec ou sans rayonnement NIR de 300 mW/cm2 pendant trois intervalles. Après élimination des surnageants et des PMC résiduels, des aliquotes de 120 μL de solution de travail MTS diluée ont été ajoutées à chaque puits et incubées à 37 ° C pendant 2 h supplémentaires. Les surnageants ont été transférés dans de nouvelles plaques (100 μL/puits) pour une détection d'absorbance à DO 490 nm par un Microplate Reader (Synergy NEO HTS, Biotek, USA). La viabilité cellulaire a été déterminée par Eq. 2 :

où AN, AC et AB représentent l'absorbance du substrat MTS à 490 nm dans les cellules traitées, non traitées et les échantillons vierges, respectivement.

Les cellules NK triées (2 × 105 cellules/puits) ont été co-cultivées avec des cellules fLuc-Yac-1 (lymphome de souris) aux ratios de 1:1 ou 2:1 en présence ou en l'absence de PMC, suivies de trois intervalles de l'exposition NIR. Après incubation pendant 6 h, les mélanges cellulaires ont été collectés pour lyser les cellules Yac-1 par 100 μL de tampon de lyse Glo (Cat. E266A, Promega, WI, USA). Après cela, 50 μL/puits One-Lite® Luciferase Assay System (Cat. DD1203-01, Vazyme, Nanjing, Chine) ont été ajoutés pour mesurer la luminescence des lysats cellulaires dans un lecteur de microplaques. La luminescence des cellules Yac-1 a été mesurée pour déterminer les pourcentages de mort cellulaire qui ont été utilisés pour évaluer l'activité cytolytique des cellules NK79. Le pourcentage de mort cellulaire a été déterminé par Eq. 3 :

où Io et Ilysate représentent l'intensité de luminescence du lysat cellulaire dans les cellules non traitées et co-cultivées avec des cellules NK, respectivement.

La matrice Matrigel (1,5 ml) a été décongelée dans un bain de glace à 4 ° C et mélangée avec 0,5 ml de suspensions cellulaires HepG2 ou MCF-7 (4 × 106 cellules / ml dans du DMEM pré-refroidi). Les solutions ont été mélangées doucement pour éviter la génération de bulles d'air. Des aliquotes de suspensions de 300 μL ont été ajoutées dans des plaques de 24 puits pré-refroidies ou des boîtes confocales de 35 mm. Les plaques ou boîtes ont été cultivées à 37 ° C pendant 30 minutes pour polymériser la matrice, suivies de l'ajout de 1 ml de DMEM sur le dessus du gel dans chaque puits / boîte pour une culture supplémentaire. Des sphéroïdes de cellules cancéreuses matures ont été acquis après une culture de 7 à 10 jours une fois que la taille des agglomérats de cellules est > 50 μm.

Les sphéroïdes traités dans des plaques à 24 puits ont été soumis à une liquéfaction sur de la glace par la solution de récupération de cellules (BD Biosciences, Bedford, MA). Les sphéroïdes cellulaires ont été collectés par centrifugation à 500 × g pendant 5 min, lavés par du PBS et lysés dans du PBS (50 μL) par trois cycles répétés de congélation-décongélation dans de l'azote liquide. Les tumeurs fraîches ont été pesées et des échantillons de 50 mg ont été dissociés dans 100 μL de PBS à 4 ° C par un homogénéisateur (OSE-Y30, TIANGEN, Chine). Les solutions tissulaires homogénéisées et les lysats cellulaires ont été centrifugés à 500 × g pendant 5 min pour éliminer les débris. Les concentrations de protéines dans les surnageants ont été détectées par dosage de Bradford. Les lysats ont été stockés à -20 ° C pour l'analyse de l'adénosine ou des cytokines.

Un équipement laser (Xi'an Lei Ze Electronics Tech Co., Ltd, Shanxi, Chine) a été utilisé pour fournir un rayonnement NIR pour piloter la photosynthèse dans les PMC par un laser de 980 nm à 0–900 mW/cm2. Les PMC dans un milieu de 10 ml (PBS, BG11 ou DMEM) ont été placés dans des tubes Eppendorf transparents et exposés à un laser NIR de 100 à 900 mW/cm2 pendant 0 à 60 min. Les cellules et les sphéroïdes cultivés dans des plaques multipuits ou des plats confocaux ont été exposés à un rayonnement NIR de 300 mW/cm2 pendant trois intervalles (20 min pour chaque intervalle, 15 min On et 5 min Off). Des souris et des lapins porteurs de tumeurs ont été exposés à trois intervalles (20 min pour chaque intervalle, 15 min On et 5 min Off) de rayonnement NIR de 300 mW/cm2 et 900 mW/cm2 chaque jour, respectivement.

Pour visualiser la génération d'oxygène dans les PMC, le kit de coloration DCFH a été utilisé pour visualiser la génération d'oxygène. PMC, eS. sp. 6803@MCs et UCNP@MCs à 1500/puits ont été cultivés dans 1 mL de milieu DMEM dans une boîte confocale de 35 mm pendant 12 h dans l'obscurité à 37 °C. Ensuite, les PMC traitées ont été incubées avec 10 μg/mL de DCFH pendant 10 min, puis exposées à un rayonnement NIR de 300 mW/cm2 à 980 nm pendant 0, 1, 3 et 10 min. La fluorescence du DCF a été immédiatement visualisée par microscopie confocale à 488 nm d'excitation.

Pour évaluer l'état hypoxique, des sphéroïdes de cellules HepG2 et MCF-7 matures dans des plats confocaux de 35 mm ont été cultivés avec 1 mL de DMEM frais avec ou sans suspensions de PMC (4500/mL dans du DMEM). Ensuite, les sphéroïdes ont été exposés à un rayonnement NIR de 300 mW/cm2 pendant trois intervalles. Ensuite, les sphéroïdes ont été incubés avec du chlorhydrate de pimonidazole 100 μM pendant 12 h à 37 ° C, lavés au PBS et fixés au paraformaldéhyde à 4% pendant 30 min à température ambiante. Les cellules en sphéroïdes ont été perméabilisées par 0,5 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 1 h et colorées par 0,5 μg/mL de FITC conjugué à l'anticorps monoclonal IgG1 de souris (FITC-MAb1) dans du PBS pendant 6 h et 10 μg/mL Hoechst 33342 dans du PBS à température ambiante pendant 30 min. Les cellules colorées ont été lavées trois fois avec du PBS pour l'imagerie par microscopie à des longueurs d'onde d'excitation de 405 nm et 488 nm.

Pour la nouvelle imagerie des cellules filles, les cellules HepG2 et MCF-7 prétraitées avec ou sans PMC 4500/mL ont été exposées à trois intervalles de rayonnement NIR. Les cellules traitées ont été incubées avec 1 ng/mL de TNF-α pendant 12 h ou 40 μM de BMS pendant 12 h. Après cela, les surnageants ont été remplacés par 500 μL de solution de travail EdU (10 μM) dans un kit de test Click-iT®EdU-594. Après une culture supplémentaire de 2 h à 37 ° C, les cellules ont été fixées par du formaldéhyde à 4 % pendant 30 min à température ambiante et perméabilisées dans du Triton X-100 à 0,5 % dans du PBS pendant 20 min. Après élimination des surnageants et lavage trois fois par 3% de BSA, le cocktail de réaction de clic contenant 860 μL de tampon de réaction, 40 μL de CuSO4, 2 μL d'Azide 594 et 100 μL de solution d'additif de clic a été fraîchement préparé et ajouté dans les cellules perméabilisées. Après 30 minutes de réaction à température ambiante, le cocktail réactionnel a été éliminé. Les cellules ont été lavées deux fois avec du BSA à 3 % dans du PBS et incubées avec 0,5 mL de Hoechst 33342 (10 μg/mL) pour la coloration du noyau. Après 10 min d'incubation, les échantillons cellulaires marqués ont été visualisés par microscopie confocale (FV1200, Olympus, Japon)

Les cellules HepG2 ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits à une densité de 6 × 105 cellules/puits. Après une nuit d'incubation, les cellules ont été exposées à trois rayonnements NIR d'intervalle en présence ou en l'absence de 1,2 × 104/mL de PMC, suivis d'incubations avec du TNF-a (200 ng/mL), de l'EGF (200 ng/mL) et de l'insuline ( 100 nM) pendant 10 min. Après cela, les surnageants ont été remplacés par des milieux frais ou des milieux contenant des inhibiteurs pour d'autres incubations, y compris 20 µM BMS pendant 2 h, 2 mM 3-méthyladénine pendant 1 h, 4 μM MK-2206 pendant 4 h, 100 nM rapamycine pendant 4 h ou 100 μM PD98059 pendant 2 h. Après un lavage suffisant au PBS, les culots cellulaires ont été recueillis et mis en suspension dans un tampon de lyse (10 % de glycérol, 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1 mM de Na3VO4, 1 % de Triton X-100, 25 mM de β-glycérol- phosphate, fluorure de phénylméthanesulfonyle 0,1 mM) avec 2 % d'inhibiteurs de phosphatase cocktail (Cat : P5726, Sigma) et 5 % de protéase (Cat : P5147, Sigma). Les suspensions cellulaires ont été vortexées pendant 10 s, puis incubées sur la glace pendant 30 min, puis centrifugées à 2000 × g pendant 20 min. Les concentrations de protéines dans les surnageants ont été déterminées et ajustées par dosage de Bradford. Les échantillons ont été séparés sur un gel SDS-PAGE 8–15 % (Beyotime, Shanghai, Chine) en utilisant un tampon tris-glycine-SDS comme tampon de fonctionnement dans le système Mini-PROTEAN Tetra (Bio-Rad, CA, USA) à 100 V et transféré sur une membrane de nitrocellulose à 300 mA. Les membranes ont été bloquées avec du lait 5 % (Biofrox, Einhausen, Allemagne) dans 0,1 % Tween 20/PBS à température ambiante pendant 2 h, puis incubées avec IκBα (1:1000), IκBα phosphorylé (1:1000), PI3K ( 1:500), PI3K phosphorylé (1:500), AKT (1:1000), AKT phosphorylé (1:1000), mTOR (1:10000), mTOR phosphorylé (1:10000), ERK (1:1000), anticorps phosphorylés ERK (1: 1000) et β-actine (1: 5000) pendant une nuit à 4 ° C. Après trois lavages avec du Tween 20 à 0,1 % v/v dans du TBS (tampon de lavage) et une incubation avec un anticorps secondaire conjugué à la HRP (1:5000) pendant 2 h à température ambiante, les membranes ont été suffisamment lavées. La solution de chimiluminescence hypersensible ECL fraîchement préparée a été utilisée pour imager les membranes par un système d'analyse d'imagerie par chimiluminescence à fluorescence multicolore (FluorChem M, Alpha, USA).

Des lysats d'échantillons de sphéroïdes (50 μL) et de tumeurs (100 μL) constitués de 0, 1 à 0, 4 mg de protéines ont été mélangés avec 1 mL de méthanol pré-refroidi et incubés à -20 ° C pendant 16 h. Le mélange a été centrifugé à 20 000 × g pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les précipités de protéines. Les métabolites dans les surnageants ont été séchés avec du N2 sous un concentrateur de soufflage de gaz sous pression (VSD150-2, Woxin Instrument Manufacturing Co., Chine) et redissous dans 150 μL de tampon A (acide formique à 0, 1% dans de l'eau DI). Des étalons d'adénosine dissous dans le tampon A à 0-1000 nM ont également été préparés. Des aliquotes d'échantillons de 5 μL ont été injectées et séparées dans une colonne en phase inverse C18 (2,1 mm × 150 mm, 100 Å, 3,5 μm). L'analyse LC-MS a été réalisée sur un système LC Agilent série 1100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) couplé à un spectromètre de masse LTQXL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). La phase mobile a été programmée par un système isocratique constitué de 70 % de tampon A et 30 % de tampon B (100 % ACN). Le débit a été maintenu à 300 μL/min. La détection MRM MS a été opérée en mode d'ionisation positive pour collecter des données. La détection MS a été effectuée à une tension de source de 3 kV et à une température capillaire de 350 ° C. Les débits de gaine et de gaz auxiliaire ont été fixés à 55 arb et 15 arb, respectivement. Les données MS ont été analysées par le logiciel Xcalibur. Les concentrations d'adénosine dans les échantillons testés ont été déterminées par sa courbe standard.

Pour examiner si le traitement NIR-PMC induisait des morts cellulaires apoptotiques, des cellules HepG-2 (5 × 105 cellules / puits) ont été ensemencées dans des plaques à six puits et cultivées dans du DMEM pendant 16 h. Ensuite, les surnageants ont été remplacés par du milieu frais ou du DMEM contenant 500 µg/mL de 5-FU ou PMC à 3600/puits et exposés au NIR pendant trois intervalles. Après 24 h d'incubation, les cellules ont été collectées et colorées par un kit de coloration Annexin V-FITC/PI selon le protocole du fabricant avant l'analyse par cytométrie en flux.

Un test de coloration intracellulaire a été effectué pour examiner l'effet du traitement NIR-PMC sur la production d'IFN-γ de cellules T. Les cellules T de souris pré-activées avec les anticorps CD3 et CD28 ont été remises en suspension dans du RPMI-1640 additionné de 10 % de FBS, puis ensemencées dans les chambres inférieures de plaques à 24 transwells (2 × 106 cellules/puits, 2 mL) avec 50 ng/mL PMA et 1 µL/mL d'inhibiteur de Golgi. Des PMC ont été ajoutés dans la chambre supérieure (3600/puits) avec une taille de pores de 8,0 µm sur des membranes PC. Ensuite, les cultures entières ont été exposées à un rayonnement NIR à trois intervalles. Après 18 h, les cellules ont été centrifugées à 700 g pendant 5 min et les cellules culottées ont été fixées dans du tampon BD Cytofix/Cytoperm pendant 30 min. Les cellules fixées ont été lavées une fois avec le tampon BD Perm/Wash (Cat. 554723, BD Biosciences), puis les cellules ont été remises en suspension dans le tampon BD Perm/Wash contenant 5 µL/test anti-IFN-γ-FITC (Cat. 554411, BD Biosciences) pour une incubation à température ambiante pendant 30 min. Après trois lavages dans du tampon BD Perm/Wash, les cellules remises en suspension ont été soumises à une analyse par cytométrie en flux (FACSVerse, BD). L'analyse des données a été réalisée à l'aide du logiciel FlowJo (Tree Star Inc.)

Des souris femelles BALB/c (âgées de 6 à 8 semaines, ~ 20 g) ont été obtenues auprès du Experimental Animal Center de Gempharmatech Co. Ltd à Nanjing, en Chine. Des lapins blancs néo-zélandais femelles (âgés de 6 mois, pesant de 2 à 2, 5 kg) ont été obtenus auprès de Qingdao Kangda Rabbit Co., Ltd. (Qingdao, Chine). Tous les animaux ont été élevés dans une animalerie dans des conditions d'air filtré (22 à 25 °C), avec un cycle d'obscurité/lumière de 12 h (lumière de 8 h 00 à 20 h 00 ; obscurité de 20 h 00 à 8 h 00) et d'humidité relative ( 40–70 %) dans des cages en plastique avec des copeaux de bois stérilisés pour la litière. Toutes les expériences sur les animaux ont été strictement effectuées selon les directives du Conseil chinois pour la protection des animaux approuvées par le Comité de protection des animaux des animaux de laboratoire de l'Université de Soochow (n ° ECSU-202109A0401). Les critères d'évaluation approuvés pour l'humanité ont été appliqués aux animaux porteurs de tumeurs une fois qu'ils remplissaient l'un des critères suivants : (i) le diamètre de la tumeur est > 2 cm pour les souris ou le volume de la tumeur est > 80 cm3 pour les lapins ; (ii) l'alimentation, l'abreuvement ou les déplacements des animaux sont gravement affectés. Pour développer les tumeurs hépatiques VX2 chez le lapin, des suspensions de cellules VX2 (2 × 106 cellules, 200 μL) ont été implantées dans les muscles de la cuisse de lapins donneurs. Une fois que les tailles des tumeurs étaient> 2 cm (~ 2 semaines), les lapins donneurs ont été anesthésiés par injection intraveineuse à une dose létale de 2 ml / kg de chlorhydrate de xylazine pour la récolte des tissus tumoraux. Chaque tumeur a été découpée en morceaux de 1 mm3 par des ciseaux ophtalmiques dans des conditions stériles. Les lapins receveurs ont été anesthésiés par injection intramusculaire de chlorhydrate de xylazine (250 μL/Kg). Un fragment de tissu haché a été directement délivré par voie percutanée dans le parenchyme sous-capsulaire du lobe hépatique gauche du lapin receveur par une technique de ponction percutanée sous guidage par tomodensitométrie à 16 tranches (Brilliance-16, Phillips, États-Unis). Les lapins ont été logés et examinés par imagerie CT jusqu'à ce que les volumes tumoraux atteignent environ 1 cm3. Les lapins porteurs d'hépatocarcinome avec une taille de tumeur similaire ont été divisés en deux groupes en lançant des dés, y compris le contrôle du véhicule (n = 13), le groupe NIR-PMC (n = 13). Les lapins ont été anesthésiés pour une seule injection intratumorale de suspensions PMC (500 µL, 3,6 × 104/mL) à 14 jours. Des rayonnements NIR à 900 mW/cm2 ont été exposés aux animaux pendant trois intervalles (20 min à chaque intervalle) chaque jour. La taille de la tumeur a été contrôlée par tomodensitométrie (MHCT brilliance 16, Philips, Hollande) toutes les 2 semaines.

Les cellules fLuc-4T1 données par le Dr Zhimou Yang (Université Nankai, Tianjin, Chine) ont été mises en suspension dans 100 μL de PBS à 2 × 108 cellules/mL et injectées dans les coussinets adipeux mammaires de chaque animal. Les volumes tumoraux ont été examinés tous les 2 jours et calculés par Eq. 4 :

Les souris inoculées avec des cellules 4T-1 ont été collectées pour d'autres traitements une fois que la taille des tumeurs a atteint environ 50 mm3. Tous les animaux qualifiés ont été divisés au hasard en quatre groupes en lançant des dés pour les traitements suivants, y compris l'injection intratumorale de 25 μL de solution saline (véhicule Ctrl), l'injection intratumorale de 3,6 × 104/mL de PMC dans 25 μL de solution saline couplée à 300 mW/cm2 NIR -radiation pendant trois intervalles (15 min dans chaque intervalle) par jour (groupe NIR-PMC), injection intraveineuse de 10 mg/Kg anti-PD-1 (100 μL, deux fois par semaine) (groupe anti-PD-1), et cotraitement par NIR-PMC et anti-PD-1 (groupe cotraitement). Notamment, les animaux des groupes PMC, NIR-PMC et cotraitement ont simplement reçu une injection intratumorale de PMC au 7ème jour. Pour le traitement combiné du cancer du sein par des implants PMC et une immunothérapie chez la souris, la procédure détaillée de traitement des animaux a été illustrée à la Fig. 5b. L'indice de combinaison (IC) de l'hyperoxique (300 mW/cm2 NIR pour trois intervalles) et de 10 mg/kg d'anti-PD-1 (100 μL, deux fois par semaine) a été calculé selon une formule rapportée :

Où AB, A et B sont les volumes tumoraux dans NIR-PMC, anti-PD-1 et co-traitements, respectivement. IC > 1 indique un antagonisme, IC = 1 indique une additivité et IC < 1 indique une synergie. Les tumeurs ont été imagées par le système de spectre d'imagerie IVIS (PerkinElmer, ME, USA) et la caméra Canon (Japon). Les souris ont été complètement anesthésiées par une surdose de pentobarbital sodique (400 mg/kg) et sacrifiées pour prélever des tumeurs et des poumons. Les échantillons de tissus ont été stockés dans de l'azote liquide pour les mesures de cytokines et d'adénosine ou fixés pour la coloration H&E ou l'immunocoloration de l'expression A2AR, CD4, CD39, CD206 et CD73.

Des souris porteuses d'un cancer du sein avec des volumes de tumeur à ~ 50 mm3 ont été divisées au hasard en cinq groupes en lançant des dés pour les traitements suivants, y compris l'injection intratumorale de 25 μL de solution saline (véhicule Ctrl), recevant 60 % d'oxygène hyperbare pendant 1 h (groupe O2 hyperbare) , injection intratumorale de 3,6 × 104/mL de PMC dans 25 μL de solution saline (groupe PMC), injection intratumorale de 3,6 × 104/mL de microsphères vides dans 25 μL de solution saline couplée à une exposition NIR de 300 mW/cm2 chaque jour (groupe NIR) et injection intratumorale injection de 3,6 × 104/mL de PMC dans 25 μL de solution saline couplée à une exposition NIR de 300 mW/cm2 chaque jour (groupe NIR-PMC). Trois animaux ont été inclus dans chaque groupe. Les pressions partielles d'oxygène (pO2) dans les tumeurs ont été détectées à différentes profondeurs par un capteur de Clark (0,4 mm de diamètre) sur un moniteur de pO2 (POG-203, Unique Medical, Tokyo, Japon) à 110 V selon le protocole du fabricant.

Pour la préparation des splénocytes, des souris BALB/c (âge : 6 à 8 semaines ; poids : 20 g) ont été sacrifiées par inhalation de CO2 pour prélever les rates. Les rates ont été broyées dans 10 mL de milieu 1640 RPMI (10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine). Le mélange a été filtré par une membrane en nylon de 200 mesh (Cat. 7061011, Dakewe, Chine) pour éliminer les débris tissulaires. Les suspensions ont été centrifugées (Allegra 64 R, Beckman) à 500 × g pendant 5 min pour recueillir les culots cellulaires, puis lavées deux fois dans du PBS. Les culots cellulaires ont été dispersés et incubés dans 5 ml de tampon de lyse des globules rouges 1 × RBC (8,26 g/L NH4Cl, 1 g/L KHCO3 et 0,037 g/L EDTA dans DI H2O) à température ambiante pendant 5 min. Par la suite, du milieu RPMI-1640 (5 ml) a été ajouté pour arrêter la réaction de lyse et centrifugé pour collecter les splénocytes, qui ont été utilisés pour l'expansion des cellules T et des cellules NK comme décrit ci-dessous.

Pour l'expansion des cellules T, les anticorps d'activation anti-CD28 et CD3 de souris ont été dissous dans du PBS à CD3 et ont été ajoutés dans des plaques à 6 puits (1,5 ml/puits) pour traiter les surfaces des puits à 4 ° C pendant 12 h. Ensuite, les solutions d'anticorps dans chaque puits ont été jetées et les plaques revêtues étaient prêtes pour l'expansion des lymphocytes T à partir des splénocytes de souris. Les splénocytes qui ont été préparés comme décrit ci-dessus ont été remis en suspension dans du milieu RPMI-1640 à 2 × 106/mL, ajoutés dans les plaques recouvertes d'anticorps CD28/CD3 (5 mL/puits) et incubés pendant 48 h en présence de 200 UI/ mL IL-2 pour l'expansion des lymphocytes T. Ensuite, les lymphocytes T préactivés ont été collectés et transférés dans des plaques à 24 puits (2 × 106/mL, 2 mL/puits) pour un test supplémentaire de la production d'IFN-γ.

Pour l'expansion des cellules NK, les splénocytes (2 × 106/mL, 5 mL/puits) ont été ajoutés dans des plaques à six puits en présence de 20 ng/ml d'IL-15 de souris et de 1000 UI/ml d'IL-2 de souris. Les milieux cellulaires ont été changés tous les 2 jours. Après 7 jours, les cellules résultantes ont été marquées avec 1 μL/1 × 106 cellules anti-CD3-APC (Cat. 30041, Biolegend) et 1 μL/1 × 106 cellules anti-NK1.1-PE (Cat. 557391, BD Biosciences) pendant 30 min. Les cellules colorées ont été collectées pour trier les cellules NK1.1 + CD3-NK à l'aide d'un trieur de cellules d'écoulement (FACSMelody, BD). Les cellules NK triées ont été transférées dans des plaques à 24 puits pour un test supplémentaire de l'activité cytolytique.

Des tumeurs de lapin (20 à 30 mg) ont été ajoutées dans des tuyaux à lisier avec 1 ml de Trizol pour dissocier les tissus tumoraux avec un homogénéisateur (PRO200, FLUKO, Chine) pendant 2 min, puis placées sur de la glace pendant 15 min pour permettre la lyse cellulaire. Ensuite, les surnageants ont été obtenus par centrifugation à 4 °C, 6000 × g pendant 15 min. Ensuite, 0,5 ml de surnageant a été mélangé avec du chloroforme (0,2 ml) et oscillé pendant 2 min pour extraire l'acide nucléique. Après avoir mijoté pendant 5 min sur de la glace, le mélange a été centrifugé à 4 °C 6000 × g pendant 15 min. La solution aqueuse supérieure (0,2 mL) a été recueillie et transférée dans un nouveau tube Eppendorf sans RNase. De l'isopropanol (0,2 mL) a été ajouté aux surnageants et centrifugé à 4 °C, 6000 × g pendant 15 min. Les culots ont été récupérés et lavés avec de l'éthanol à 75 %. L'ARN résultant a été redissous dans 20 μL d'eau de pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) pour quantifier la concentration par le spectrophotomètre Nanodrop 2000c (Thermo Fisher, USA) à OD 260 nm. L'analyse PCR a été réalisée à Anhui Leaobei Biotechnology Co. LTD (Tongling, Chine) par un kit de test SYBR Green (Thermo Fisher, USA) sous un système PCR en temps réel (ABI-7300, USA). Les données ont été analysées par le logiciel ABI Prism 7300 SDS et les niveaux d'ARNm de chaque gène dans deux groupes (n = 3) ont été normalisés à ceux de GAPDH. Les amorces utilisées sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 2.

Des souris BALB/c en bonne santé (âge : 6 à 8 semaines ; poids : 20 g) ont été randomisées en trois groupes en lançant des dés. Les animaux ont été anesthésiés pour des administrations de suspensions de PMC (25 μL, 3,6 × 104/mL) ou un volume égal de PBS au jour 0 par injection intrapéritonéale ou sous-cutanée. Des rayonnements NIR à 300 mW/cm2 ont été exposés aux animaux chaque jour. Le comportement et l'apparence des animaux ont été inspectés périodiquement après l'injection. Les souris traitées ont été sacrifiées par inhalation de CO2 à 1, 3 et 8 jours pour prélever des organes (cœur, foie, poumon, rein, cerveau, rate et peau) et des sangs. Les tissus d'organes ont été fixés pour la coloration H&E ou TUNEL. Les échantillons de sang (~ 400 μL chaque souris) ont été soumis à la détection d'indicateurs sanguins de routine par l'analyseur d'hématologie Mindray BC-2800Vet (Mindray Global, Chine).

Toutes les expériences ont été répétées au moins trois fois avec trois à dix répétitions. Les données ont été exprimées en moyenne ± écart type (SD) à partir d'au moins trois répétitions. Toute l'imagerie confocale et l'imagerie de coloration immunohistochimique ont été répétées au moins trois répétitions. L'analyse des données a été effectuée par le test t de Student bilatéral ou le test de log-rank via le logiciel SPSS Statistics 17.0. La différence était considérée comme statistiquement significative si p < 0,05.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données sources sont fournies avec ce document. Les autres données sont disponibles dans le fichier Article, Informations supplémentaires ou Données source. Les données d'imagerie sont déposées sur un référentiel public, Zenodo Dataverse, en suivant https://doi.org/10.5281/zenodo.6588765 Les données sources sont fournies avec cet article.

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Ce travail a été soutenu par les subventions de la National Natural Science Foundation of China (21976126 à RL), de la Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20211545 à RL), du National Key R&D Program of China, Ministry of Science and Technology of China (2020YFA0710700 à RL).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Weili Wang, Huizhen Zheng.

State Key Laboratory of Radiation Medicine and Protection, School for Radiological and Interdisciplinary Sciences (RAD-X), Collaborative Innovation Center of Radiation Medicine of Jiangsu Higher Education Institutions, Suzhou Medical College, Soochow University, Suzhou, Jiangsu, 215123, Chine

Weili Wang, Huizhen Zheng, Jun Jiang, Hui Wang, Jie Jiang, Qianqian Xie, Meng Gao et Ruibin Li

Département de radiologie interventionnelle, premier hôpital affilié de l'Université Soochow, Université Soochow, Suzhou, Jiangsu, 215001, Chine

Zhi Li

Institut de transplantation de sang et de moelle osseuse, Centre national de recherche clinique sur les maladies hématologiques, Université Soochow, Suzhou, Chine

Dongpeng Jiang, Xiangru Shi et Jianhong Chu

École de santé publique, Suzhou Medical College, Université Soochow, Suzhou, Jiangsu, 215123, Chine

Xiaoming Cai

Division of NanoMedicine, Department of Medicine, California Nanosystems Institute, University of California, Los Angeles, CA, 90095, États-Unis

Tian Xia

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RL a conçu l'idée et conçu les expériences. WW a effectué la plupart des expériences. HZ et Ju.J. construit les PMC. HZ a effectué une prolifération cellulaire, HIF-1α, qPCR, une nouvelle imagerie des cellules filles et un test de production d'adénosine. ZL a réalisé des expériences d'implantation de tumeurs chez le lapin. Ju.J. effectué des expériences d'implantation de tumeurs chez la souris. DJ, XS et JC ont contribué à l'extraction des cellules T et NK ainsi qu'au test d'activité. HW et Ji.J. niveau d'oxygène testé dans la tumeur. XC, QX ont quantifié le niveau de HIF-1α dans les cellules et les tumeurs. MG a contribué au test de viabilité cellulaire. TX a contribué à l'idée de l'immunothérapie dans le microenvironnement de l'hyperoxie. La rédaction du manuscrit a été dirigée par RL avec la participation de WW

Correspondance à Ruibin Li.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent

Nature Communications remercie les évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Wang, W., Zheng, H., Jiang, J. et al. Concevoir des micro-usines à oxygène pour ralentir la progression tumorale via des micro-environnements hyperoxiques. Nat Commun 13, 4495 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32066-w

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Reçu : 22 mars 2022

Accepté : 18 juillet 2022

Publié: 02 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32066-w

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