Les particules d'hydrogel magnétique améliorent le séquençage des nanopores du SRAS

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 2163 (2023) Citer cet article

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Présenté ici est un flux de travail activé par des particules d'hydrogel magnétique pour capturer et concentrer le SRAS-CoV-2 à partir d'échantillons d'écouvillons résiduels de diagnostic qui améliore considérablement les résultats de séquençage à l'aide de la plate-forme de séquençage MinION d'Oxford Nanopore Technologies. Notre approche utilise une nouvelle particule d'hydrogel magnétique basée sur l'affinité, contournant les faibles volumes d'échantillons d'entrée et permettant des flux de travail rapides manuels et automatisés à haut débit compatibles avec le séquençage Nanopore. Cette approche améliore les protocoles d'extraction d'ARN standard, offrant jusqu'à 40 × d'améliorations des lectures cartographiées virales et améliore la couverture de séquençage de 20 à 80 % à partir d'échantillons résiduels de diagnostic à faible titre. En outre, nous démontrons que cette approche fonctionne pour les échantillons artificiels de virus de la grippe et de virus respiratoire syncytial, ce qui suggère qu'elle peut être utilisée pour identifier et améliorer les résultats de séquençage de plusieurs virus dans des échantillons de VTM. Ces méthodes peuvent être effectuées manuellement ou sur une plate-forme d'automatisation KingFisher.

Au 10 avril 2022, il y avait eu plus de 500 millions de cas de COVID-19 et près de 6,2 millions de décès liés au COVID-19 dans le monde1. Les mutations virales ont permis à la pandémie de se répandre dans la vie quotidienne malgré l'utilisation de mesures sanitaires mondiales généralisées pour empêcher la propagation du SRAS-CoV-2. La détection et la surveillance des variantes virales émergentes sont devenues des outils essentiels dans la réponse sanitaire mondiale, soulignant la nécessité de méthodes de séquençage précises et rapidement déployables2,3,4,5. Les progrès récents des technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS) ont rendu plus possible l'utilisation systématique du séquençage pour surveiller et identifier les épidémies virales, mais de nombreux instruments NGS ne sont pas portables et leur coût reste prohibitif, ce qui limite leur adoption globale6,7. La plateforme MinION d'Oxford Nanopore Technologies (ONT) offre une stratégie de détection relativement peu coûteuse et portable, capable d'identifier et de séquencer divers virus respiratoires sur le terrain8,9,10.

Alors que les progrès du séquençage rendent possible la détection et la caractérisation rapides sur site du SRAS-CoV-2 et d'autres génomes viraux, ces séquenceurs portables sont encore limités par certains inconvénients, à savoir qu'à moins que de grandes quantités d'ARN viral ne soient utilisées pour les réactions de séquençage, il peut être des problèmes de précision pendant les appels de base11,12,13,14,15,16. Ces limitations techniques réduisent l'utilité d'un outil qui pourrait améliorer la capacité de répondre rapidement et avec précision aux épidémies virales et de suivre la transmission en temps réel.

L'augmentation de la quantité totale de matériel d'ARN pour l'analyse grâce à l'enrichissement des échantillons est une stratégie disponible pour améliorer les performances des plates-formes de séquençage. À cette fin, nous avons cherché à résoudre les limites de séquençage viral d'un séquenceur de nanopores en appliquant la technologie d'enrichissement de particules d'hydrogel magnétique (particule Nanotrap) basée sur l'affinité aux échantillons de milieu de transport viral (VTM) SARS-CoV-2. En bref, les particules d'hydrogel magnétique améliorent les performances du test en facilitant la liaison rapide de l'analyte (par exemple, les virions intacts) à partir de grands volumes d'échantillons et en réduisant la présence de substances interférentes dans les tests en aval. Les particules d'hydrogel capturent et concentrent les analytes d'intérêt à l'aide de petites molécules, comme les colorants d'affinité, qui sont immobilisées sur une structure de chaînes polymères réticulées. Ces petites molécules se lient à leurs cibles (par exemple les protéines de surface du virion), souvent avec une très grande affinité, par une combinaison d'interactions électrostatiques et hydrophiles. Une fois liés à la particule d'hydrogel magnétique, les virions peuvent être concentrés et retirés de la matrice de l'échantillon en utilisant une simple étape de séparation magnétique. Après concentration, les virions sont étroitement liés au colorant d'affinité des particules d'hydrogel et les acides nucléiques viraux ne sont pas disponibles pour l'analyse moléculaire. En tant que tel, un kit d'extraction d'acide nucléique est utilisé pour lyser les virions et purifier les acides nucléiques viraux en vue d'un test moléculaire en aval. La technologie des particules Nanotrap a montré une large application dans les diagnostics cliniques en enrichissant et en stabilisant les biomarqueurs et les analytes dans des échantillons cliniques complexes. Des études récentes ont démontré ce processus de concentration et d'extraction, montrant que les particules d'hydrogel magnétique sont capables de se concentrer et d'améliorer la détection de nombreux types viraux, y compris le SRAS-CoV-2, sur plusieurs dosages moléculaires17,18,19,20,21.

Lors de l'utilisation d'une plate-forme de séquençage portable telle que le séquenceur ONT MinION, l'augmentation de la quantité d'ARN d'entrée devrait permettre un séquençage réussi d'échantillons viraux à titre inférieur, ce qui, à son tour, augmente potentiellement la fraction d'échantillons de patients viables pour le séquençage. Idéalement, cela devrait améliorer l'identification de mutations virales spécifiques, accélérant la réponse aux variantes problématiques émergentes22,23,24.

Ici, nous montrons que les particules d'hydrogel magnétique (particules Nanotrap) peuvent améliorer les flux de travail de séquençage actuels et en activer de nouveaux en améliorant les méthodes d'extraction d'ARN standard actuelles. Nous démontrons que ces flux de travail de particules d'hydrogel magnétique (particules Nanotrap) améliorent les résultats de séquençage en augmentant le nombre total de lectures cartographiées virales, ce qui se traduit par une plus grande profondeur et couverture de séquençage. Des flux de travail de particules Nanotrap ont été développés pour plusieurs kits d'extraction d'ARN, et leur utilité est démontrée dans des échantillons de restes artificiels et diagnostiques.

Les particules virales magnétiques Nanotrap (SKU : 44 202) ont été fournies par Ceres Nanosciences Inc. Manassas, VA.

Les échantillons artificiels étaient composés de virus inactivés par la chaleur enrichis en VTM (Puritan UniTranz-RT Transport Systems, cat # 89,233–458). 5 concentrations ont été générées (106, 105, 104, 103 et 102 TCID50/mL) en commençant par un échantillon de VTM pur dopé à 106 TCID50/mL à partir du stock viral, quatre dilutions en série 1:10 ont été effectuées jusqu'à une concentration de 102 TCID50/mL en utilisant du VTM pur comme tampon de dilution. La concentration initiale du stock viral était basée sur la concentration rapportée par le fabricant. Des virus inactivés par la chaleur ont été achetés auprès de ZeptoMetrix : SARS-CoV-2 (cat# 0810587CFHI), Influenza A-H1N1 (cat# 0810109CFHI) et Respiratory Syncytial Virus Type A(RSV) (cat# 0810040ACFHI).

Des échantillons résiduels de diagnostic positifs pour le SRAS-CoV-2 dans un milieu de transport viral ont été achetés auprès de Discovery Life Sciences, Huntsville, AL. Discovery Life Sciences a précédemment testé ces échantillons par RT-PCR, obtenant des seuils de cycle allant de 24 à 35. Les échantillons acquis auprès de Discovery Life Sciences suivent le "Biospecimen Purchase Agreement" et sont anonymisés avec la génération de données suivante conformément à leurs directives d'identification, permettant l'utilisation de ces échantillons pour la recherche et la publication, y compris la qPCR et le séquençage.

Nanotrap Particle Workflow 1 (méthode manuelle des particules d'hydrogel magnétique avec kit d'extraction d'ARN sur colonne) : 200 microlitres de particules d'hydrogel magnétique (particules de nanotrap) à une concentration de 5 mg/mL ont été ajoutés à 1 000 µL d'échantillons de VTM. La quantité de particules Nanotrap utilisées était basée sur des expériences précédentes d'optimisation de capture de virus17,18,19,20,21. Les échantillons ont été incubés à température ambiante pendant 10 min, puis placés sur un séparateur magnétique pendant 2 min pour permettre aux particules de Nanotrap de se sédimenter. Les surnageants ont été retirés et jetés. Cent microlitres d'eau sans ARNase/DNase avec 350 µL de tampon QIAGEN RLT ont été ajoutés au culot de particules Nanotrap. Les échantillons ont été incubés pendant 10 min sur un agitateur à température ambiante avant d'être placés sur un séparateur magnétique pendant 2 min pour permettre aux particules de Nanotrap de se sédimenter. Les surnageants contenant le matériel d'acide nucléique viral ont été traités pour l'extraction d'ARN à l'aide du kit de nettoyage QIAGEN RNeasy MinElute (cat # 74,204) en suivant les instructions de flux de travail de 100 µL du fabricant. Après l'extraction de l'ARN, les échantillons d'ARN étaient prêts pour la préparation de la bibliothèque de séquençage.

Nanotrap Particle Workflow 2 (Méthode manuelle des particules d'hydrogel magnétique avec kit d'extraction d'ARN à base de billes magnétiques) : Trois cents microlitres de PBS avec 0,05 % de Tween-20 (v/v) ont été ajoutés directement à 500 µL d'échantillons de VTM. Deux cents microlitres de particules d'hydrogel magnétique (particules Nanotrap) ont été ajoutés à chaque échantillon de VTM, qui ont ensuite été incubés à température ambiante pendant 10 min. La quantité de particules Nanotrap utilisées pour ces expériences était basée sur les précédents flux de travail de capture de virus réussis et a été optimisée pour les performances et les coûts17,18,19,20,21. Les échantillons ont été placés sur un séparateur magnétique pendant 2 min pour permettre aux particules de Nanotrap de se sédimenter. Les surnageants ont été retirés et jetés. Les pastilles de particules Nanotrap ont été remises en suspension dans 1 mL d'eau de qualité moléculaire avec 0,05 % de Tween-20 (v/v). Après une brève remise en suspension, les échantillons ont de nouveau été placés sur un séparateur magnétique pendant 2 min pour permettre aux particules de Nanotrap de se sédimenter, et le surnageant a été retiré et jeté. Les particules de Nanotrap ont été remises en suspension dans 200 µL de MagMAX Microbiome Lysis Solution, et les échantillons ont été incubés à 65 °C sur un agitateur pendant 10 min. Les échantillons ont ensuite été placés sur un séparateur magnétique pour permettre aux particules de Nanotrap de se sédimenter pendant 2 min. Les surnageants contenant le matériel d'acide nucléique viral ont subi une extraction d'ARN à l'aide du kit d'isolement d'acide nucléique MagMAX Microbiome Ultra (cat# A42357) en suivant les instructions de flux de travail de 200 µL du fabricant. Après le traitement du kit d'extraction, les échantillons d'ARN étaient prêts pour la préparation de la bibliothèque de séquençage.

Nanotrap Particle Workflow 3 (Méthode automatisée de particules d'hydrogel magnétique avec kit d'extraction d'ARN à base de billes magnétiques) : La méthode suivante utilise la plate-forme d'automatisation KingFisher (KingFisher Apex) et les consommables associés. Trois cents microlitres de PBS avec 0,05 % de Tween-20 (v/v) ont été ajoutés directement à 500 µL d'échantillons de VTM dans une plaque KingFisher à 96 puits profonds. Deux cents microlitres de particules d'hydrogel magnétique (Nanotrap Particles) ont été ajoutés à chaque échantillon de VTM. La quantité de particules Nanotrap utilisées pour ces expériences était basée sur les précédents flux de travail de capture de virus réussis et a été optimisée pour les performances et les coûts17,18,19,20,21. De l'eau de qualité moléculaire avec 0,05 % de Tween-20 (v/v) a été ajoutée à une deuxième plaque 96 DW, et 200 µL de solution de lyse MagMAX Microbiome ont été ajoutés à une troisième plaque 96 DW. Un programme KingFisher personnalisé "NT2MM.kfx" a été créé pour traiter les particules Nanotrap en utilisant les trois plaques 96 DW préparées. L'ensemble du processus s'est déroulé en 30 minutes et l'éluat final contenait de l'ARN viral extrait.

Après le traitement des particules d'hydrogel magnétique (particule Nanotrap), similaire au "Nanotrap Particle Workflow 2", les échantillons d'ARN viral extraits ont été traités à l'aide du kit d'isolement d'acide nucléique MagMAX Microbiome Ultra en suivant les instructions de flux de travail de 200 µL du fabricant. Pour ce flux de travail, l'extraction a été automatisée sur la plate-forme d'automatisation KingFisher. Nanotrap Particle Workflow 2 et 3 sont considérés par les auteurs comme étant fonctionnellement identiques, utilisant les mêmes réactifs et conditions d'extraction, la seule différence notable étant que "Nanotrap Particle Workflow 3" est réalisé sur la plate-forme d'automatisation KingFisher. Après le traitement du kit d'extraction, les échantillons d'ARN étaient prêts pour la préparation de la bibliothèque de séquençage.

Les flux de travail de particules d'hydrogel magnétique (particules Nanotrap) décrits ci-dessus ont été comparés à deux flux de travail de kit d'extraction standard sans aucune particule Nanotrap. Pour la comparaison du flux de travail 1, les échantillons ont été traités à l'aide du kit de nettoyage QIAGEN RNeasy MinElute (cat # 74,204) en suivant les instructions de flux de travail de 100 µl du fabricant. Pour les comparaisons des flux de travail 2 et 3, les échantillons ont été traités à l'aide du kit d'isolement d'acide nucléique ThermoFisher MagMAX Microbiome Ultra (cat# A42357) en suivant les instructions de flux de travail de 200 µL du fabricant.

La méthode des particules d'hydrogel magnétique (particules Nanotrap) permet à un utilisateur d'interroger un volume d'entrée d'échantillon plus important par rapport aux autres méthodes d'extraction. Pour Nanotrap Particle Workflow 1, le facteur d'enrichissement théorique est de 10 × car notre méthode traite 1000 µL de VTM par rapport au volume d'entrée de 100 µL des recommandations du fabricant de la colonne. Notez que, compte tenu des limitations des volumes des collections cliniques de VTM, nous avons limité les volumes utilisés pour Nanotrap Workflow 1 µL à 1000 µL.

Pour Nanotrap Particle Workflow 2 et 3, le facteur d'enrichissement théorique est de 2,5 × car notre méthode traite 500 µL de VTM par rapport au volume d'entrée de 200 µL des recommandations du fabricant de billes de silice. Pour permettre l'automatisation, nous avons limité les volumes utilisés pour les flux de travail 2 et 3, garantissant la compatibilité avec la plate-forme d'automatisation KingFisher.

Pour l'analyse RT-PCR des échantillons de SARS-CoV-2, le kit IDT 2019 nCoV CDC EUA (cat# 1 006 770), qui comprend des amorces/sondes N1, a été utilisé pour la RT-PCR en temps réel. Conformément à la recommandation d'IDT, le mélange maître TaqPath 1-Step RT-qPCR de ThermoFisher (cat# A15300) a été utilisé dans le test IDT 2019 nCoV CDC EUA. Chaque réaction PCR a utilisé 8,5 µL d'eau sans nucléase, 5 µL de la solution TaqPath, 1,5 µL de l'amorce/sonde N1 et 5 µL de matrice d'ARN. Les conditions de PCR ont été réalisées conformément aux instructions d'IDT sur un Roche LightCycler 96. Toutes les expériences de SARS-CoV-2 (à la fois inactivées par la chaleur et restantes de diagnostic) ont utilisé ce test.

Pour l'analyse RT-PCR des échantillons Influenza A et RSV, le kit Primerdesign Influenza A H1 (Path-H1N1-v2.0-Standard) et le kit Primerdesign RSV (Path-RSV-A-Standard) ont été utilisés conformément aux instructions du fabricant. Les conditions de PCR ont été réalisées selon les instructions de Primerdesign sur un Roche LightCycler 96.

Après extraction de l'ARN viral, des échantillons ont été préparés pour le séquençage à l'aide du réseau ARTIC développé ; "Protocole de séquençage nCoV-2019 v3 (Lo Cost)"25. En bref, l'ADNc amplifié a été préparé en utilisant une approche d'amplicon ciblé. Selon le protocole ARTIC nCov-2019, des amorces IDT ARTIC V3 Amplicon Sequencing Panel ont été utilisées. Ces 218 amorces, couvrant l'ensemble du génome du SRAS-CoV-2, ont été utilisées pour générer et amplifier l'ADNc à partir de l'ARN viral extrait. Une fois l'ADNc préparé, les échantillons ont été traités à l'aide du kit de séquençage de ligature Oxford Nanopore Technologies (ONT), codés individuellement à l'aide des codes-barres natifs du kit d'extension de codes-barres ONT Native avec un protocole "One-pot" modifié suivant le "nCov-2019 Sequencing Protocol v3 (Lo Cost) "instructions. Ces échantillons individuels ont été regroupés et concentrés à l'aide de billes magnétiques AMPure XP (cat # A63880). La bibliothèque regroupée a été chargée sur une Flow Cell ONT FLO-MIN106 R.9 utilisée avec la plate-forme de séquençage ONT Mk1C. Sauf indication contraire, l'ONT Mk1C a été exécuté pendant 24 h à l'aide du kit LSK109 avec les codes-barres EXP-ND-196 sélectionnés.

Pour analyser et traiter les données de séquençage générées par la plateforme ONT Mk1C, les outils suivants ont été utilisés : l'appel de base et le démultiplexage en direct ont été effectués à l'aide du logiciel ONT MinKnow intégré au dispositif ONT Mk1C MinION ; la classification générale et les lectures cartographiées virales ont été générées à l'aide du protocole WIMP du 09/03/2020 via l'outil Web Epi2me d'ONT ; une analyse plus approfondie de la couverture a été effectuée à l'aide de Minimap2 et de Samtools via le portail Web UseGalaxy.org. Des tests t appariés ont été effectués et les chiffres ont été générés à l'aide de Graphpad Prism 9. L'analyse Nextclade et Pangolin a été effectuée via le workflow ARTIC SARS-CoV-2 développé par EPI2ME Labs26.

Des études antérieures ont démontré que les particules d'hydrogel magnétique (particules Nanotrap) capturent et concentrent plusieurs agents pathogènes viraux respiratoires, notamment le SRAS-CoV-2, la grippe A, la grippe B et le RSV17,18,19,20,21. Cet enrichissement a conduit à des résultats améliorés par divers tests moléculaires, y compris la RT-PCR en temps réel. Nous avons émis l'hypothèse que si les particules Nanotrap pouvaient améliorer ces tests moléculaires, elles pourraient également améliorer les plateformes de séquençage en augmentant la quantité d'ARN viral disponible pour le séquençage. Pour démontrer la robustesse et la facilité d'utilisation de la technologie de particules Nanotrap dans le séquençage, trois flux de travail ont été développés : une méthode manuelle avec un kit d'extraction d'ARN sur colonne, une méthode manuelle avec un kit d'extraction d'ARN sur billes magnétiques, et une méthode automatisée avec un kit d'extraction d'ARN à base de billes magnétiques.

Nous avons développé une méthode utilisant un hydrogel magnétique (particules Nanotrap) pour capturer et concentrer les virions entiers du SRAS-CoV-2, suivis d'une extraction d'ARN basée sur une colonne, examinant la capacité des particules Nanotrap à améliorer le séquençage des nanopores du SRAS-CoV-2. À cette fin, des échantillons VTM artificiels de SARS-CoV-2 inactivé par la chaleur ont été traités avec Nanotrap Particle Workflow 1 en utilisant le kit de nettoyage QIAGEN RNeasy MinElute pour l'extraction d'ARN viral ([+ NT]) ou sans particules Nanotrap en utilisant le kit Rneasy seul ([− NT]). Les échantillons d'ARN extraits ont été préparés pour le séquençage à l'aide du protocole de séquençage ARTIC nCoV-2019 et exécutés sur le séquenceur ONT Mk1C comme décrit dans la section méthode. L'ARN viral extrait a également été analysé à l'aide du kit IDT 2019 nCoV CDC EUA RT-PCR pour identifier une corrélation potentielle entre les deux tests et confirmer la présence du SRAS-Cov-2. Comme le montre la figure 1A, les particules Nanotrap ont amélioré les résultats de séquençage à plusieurs concentrations par rapport au flux de travail sans particules Nanotrap. Une amélioration de 6,0 × des lectures cartographiées virales du SRAS-CoV-2 a été observée à 106 TCID50/mL et une amélioration de 2,0 × a été observée à 105 TCID50/mL. L'analyse statistique a montré que les améliorations étaient significatives avec des valeurs de p < 0,05 pour les deux concentrations de virus. Aucune amélioration significative n'a été observée entre les échantillons [+ NT] et [− NT] en dessous de 105 TCID50/mL. Lorsque la RT-PCR a été réalisée, les particules Nanotrap ont amélioré la récupération virale de 2 seuils de cycle de PCR (Cts) sur les quatre premières dilutions en série (Fig. 1B). Les tests t appariés ont confirmé une amélioration significative pour les quatre mêmes concentrations.

Les particules d'hydrogel magnétique (Nanotrap Particle Workflow 1) améliorent le séquençage des échantillons artificiels de SARS-CoV-2. Le SARS-CoV-2 inactivé par la chaleur a été enrichi en VTM à 102, 103, 104, 105 et 106 TCID50/mL, et les échantillons ont été traités à l'aide du Nanotrap Particle Workflow 1 [+ NT] ou du kit Rneasy seul [− NT] ; n = 3 pour chaque processus. Les échantillons ont ensuite été séquencés sur une Flow Cell ONT MinION R.9 (a) ou RT-PCR (b). [+ NT] ont été comparés à [− NT] par test t apparié afin d'évaluer l'importance de la détection virale accrue. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Les extractions d'ARN sur colonne sont généralement utilisées dans des environnements de paillasse de laboratoire à faible débit d'échantillons et à complexité élevée. Compte tenu de ces limitations, nous avons évalué la capacité des particules d'hydrogel magnétique (particules Nanotrap) à améliorer une méthode d'extraction d'ARN basée sur des billes magnétiques. Le flux de travail de particules Nanotrap 2 a été testé de la même manière que le flux de travail 1 : des échantillons de VTM artificiels avec le SARS-CoV-2 ont été traités avec ([+ NT]) ou sans ([− NT]) particules Nanotrap. L'échantillon [− NT] a été traité à l'aide du kit d'isolement d'acide nucléique MagMAX Microbiome Ultra seul. Après l'extraction de l'ARN, les échantillons ont ensuite été préparés pour le séquençage à l'aide du protocole de séquençage ARTIC nCoV-2019, exécuté sur la plate-forme de séquençage ONT Mk1C. Les échantillons d'ARN traités ont également été analysés par RT-PCR à l'aide du kit IDT 2019 nCoV CDC EUA RT-PCR pour confirmer la présence du virus.

Les particules Nanotrap ont amélioré les résultats de séquençage à plusieurs concentrations par rapport au flux de travail [− NT] (Fig. 2A). Une amélioration de 1,9 × des lectures cartographiées virales du SRAS-CoV-2 a été observée à 106 TCID50/mL et une amélioration de 1,4 × a été observée à 105 TCID50/mL. L'analyse statistique a confirmé la signification avec des valeurs de p < 0,05 calculées pour les deux résultats. De plus, les particules Nanotrap ont amélioré la détection du SRAS-CoV-2 dans la RT-PCR, offrant une amélioration moyenne de 1,5 Ct à des titres viraux supérieurs à 102 TCID50/mL (Fig. 2B).

Les particules d'hydrogel magnétique (Nanotrap Particle Workflow 2) améliorent le séquençage des échantillons artificiels de SARS-CoV-2. Le SARS-CoV-2 inactivé par la chaleur a été dopé dans du VTM à 102, 103, 104, 105 et 106 TCID50/mL et les échantillons ont été traités à l'aide de Nanotrap Particle Workflow 2 [+ NT] ou du kit MagMAX seul [− NT] ; n = 3 pour chaque processus. Les échantillons ont ensuite été séquencés sur une Flow Cell ONT MinION R.9 (a) ou RT-PCR (b). [+ NT] ont été comparés à [− NT] par test t apparié afin d'évaluer l'importance de la détection virale accrue. *p < 0,05, **p < 0,01.

Les échantillons VTM artificiels sont utiles pour évaluer les méthodes dans un environnement vierge, mais ils ne sont pas nécessairement indicatifs de la façon dont une méthode fonctionnera avec des échantillons cliniques. Ainsi, nous avons évalué les flux de travail des particules d'hydrogel magnétique (particules Nanotrap) à l'aide d'échantillons de VTM d'écouvillons cliniques résiduels de diagnostic. Nous avons utilisé dix échantillons de diagnostic VTM restants avec des seuils de cycle de test RT-PCR rapportés allant de 24 à 35 (tel que rapporté par le fournisseur d'échantillons). Le même flux de travail de traitement et de séquençage établi avec des échantillons artificiels a été utilisé pour ces échantillons résiduels de diagnostic. Pour mieux évaluer l'impact du flux de travail des particules Nanotrap sur les résultats de séquençage, nous avons quantifié à la fois le nombre total de lectures cartographiées virales et le pourcentage de couverture génomique associé à une profondeur de 30 × des échantillons traités. Les résultats de la figure 3A, qui ont été générés à l'aide du flux de travail de particules Nanotrap 1 [+ NT], montrent que les particules Nanotrap ont amélioré les résultats de séquençage de 100 % des échantillons de diagnostic restants (n = 10). Par rapport au flux de travail sans particules Nanotrap [− NT], l'utilisation de Nanotrap Particle Workflow 1 a entraîné une amélioration moyenne de 7 × du nombre total de lectures virales cartographiées dans tous les échantillons de diagnostic restants. Ces améliorations de lecture cartographiées virales ont entraîné une augmentation moyenne de la couverture du génome viral de 52 % par rapport aux échantillons traités sans particules Nanotrap (Fig. 3B). Un test t apparié sur les 10 échantillons montre que les augmentations sont statistiquement significatives pour les lectures cartographiées virales et le pourcentage de couverture (Fig. 3D, Fig. 3E). Sur la figure 3C, la RT-PCR a confirmé la présence du SRAS-CoV-2 pour les 10 échantillons, entraînant également une amélioration moyenne de 4 Ct par rapport aux échantillons [− NT]. Il convient de noter que 3 échantillons étaient en dessous de la limite de détection du test RT-PCR lorsqu'ils étaient traités sans particules Nanotrap, mais les 10 échantillons avaient de l'ARN détectable lorsque les particules Nanotrap étaient utilisées dans le traitement des échantillons.

Les particules d'hydrogel magnétique (Nanotrap Particle Workflow 1) améliorent le séquençage des échantillons de SARS-CoV-2 restants de diagnostic. 10 échantillons résiduels de diagnostic positifs pour le SARS-CoV-2 ont été traités à l'aide du Nanotrap Particle Workflow 1 [+ NT] ou du kit RNEasy seul [− NT]. Les échantillons ont ensuite été séquencés sur une Flow Cell ONT MinION R.9 et ont été analysés par Viral Mapped Reads to SARS-CoV-2 (a), Viral Genome Coverage at 30 × depth (b) ou RT-PCR (c). [+ NT] ont été comparés à [− NT] par test t apparié afin d'évaluer l'importance de la détection virale accrue (d), (e). ***p < 0,001.

L'un des avantages du traitement des échantillons à base de particules magnétiques est que la méthode peut être facilement automatisée. À cette fin, nous avons développé une version automatisée du workflow de particules d'hydrogel magnétique (Nanotrap Particle Workflow 3) à utiliser sur la plate-forme d'automatisation KingFisher. Cette méthode est fonctionnellement la même que Nanotrap Particle Workflow 2, utilisant les mêmes réactifs et étapes d'extraction, bénéficiant des mêmes caractéristiques de performance. Nous avons comparé cette méthode automatisée Nanotrap Particle Workflow 3 ([+ NT]) à une méthode sans particules Nanotrap utilisant dix échantillons restants de diagnostic positifs pour le SARS-CoV-2 supplémentaires ([− NT]), en examinant à nouveau le séquençage et la sortie RT-PCR des deux méthodes. Nous avons observé que le traitement des particules Nanotrap améliorait considérablement les résultats de séquençage pour 7 échantillons sur 10, entraînant une amélioration moyenne de 42 × du nombre total de lectures cartographiées virales (Fig. 4A). Cela correspondait à une augmentation moyenne de 51% de la couverture du génome viral par rapport aux échantillons [− NT] (Fig. 4B). Des tests t appariés ont confirmé que les particules Nanotrap amélioraient de manière significative les lectures cartographiées virales (Fig. 4D) et la couverture du génome (Fig. 4E). Comme pour l'ensemble précédent d'échantillons résiduels de diagnostic, la RT-PCR a confirmé la présence du SRAS-CoV-2 pour les 10 échantillons. Le processus automatisé [+ NT] a également amélioré les résultats de la RT-PCR, entraînant une amélioration moyenne de 3, 7 Ct illustrée à la Fig. 4C.

Les particules d'hydrogel magnétique (Nanotrap Particle Workflow 3) améliorent le séquençage des échantillons de diagnostic SARS-CoV-2 restants. 10 échantillons résiduels de diagnostic positifs pour le SARS-CoV-2 ont été traités à l'aide du Nanotrap Particle Workflow 3 [+ NT] ou du kit MagMAX seul [− NT]. Les échantillons ont ensuite été séquencés sur une Flow Cell ONT MinION R.9 et ont été analysés par Viral Mapped Reads to SARS-CoV-2 (a), Viral Genome Coverage at 30 × depth (b) ou RT-PCR (c). [+ NT] ont été comparés à [− NT] par test t apparié afin d'évaluer la signification de la détection virale accrue (d), (e). *p < 0,05, **p < 0,01.

Après avoir traité et séquencé dix échantillons de restes de diagnostic positifs pour le SRAS-CoV-2 avec Nanotrap Particle Workflow 3, nous avons en outre évalué comment l'amélioration des lectures cartographiées virales et du pourcentage de couverture du génome affecterait l'analyse du SRAS-CoV-2 en aval. Plus précisément, nous avons utilisé l'outil bioinformatique des laboratoires EPI2ME "ARTIC SARS-CoV-2 Workflow" pour effectuer une analyse Pangolin et Nextclade afin de caractériser davantage l'amélioration potentielle obtenue par l'enrichissement en particules d'hydrogel magnétique (particules Nanotrap). Ce sont des outils de lignée bioinformatique SARS-CoV-2 largement utilisés pour suivre et analyser les variantes du SARS-CoV-2 qui produisent des mesures qualitatives faciles à comprendre pour caractériser et comparer les données de séquençage. En bref, Pangolin est un pipeline d'attribution de lignée SARS-CoV-2 qui commence par aligner une séquence d'entrée sur la séquence originale de Wuhan de type sauvage. L'outil compare ensuite tous les changements détectés dans les régions de codage alignées avec une base de données de variantes connues pour générer un rapport de lignage qui produit la variante connue la plus proche. Enfin, un "score d'ambiguïté" est généré qui indique la probabilité que le rapport de lignée soit correct. Allant de 0 à 1, plus le score est bas, plus « l'ambiguïté » est faible, ce qui équivaut à un niveau de confiance plus élevé que l'analyse est correcte. Semblable à Pangolin, Nextclade est un outil d'alignement à plusieurs niveaux qui compare une séquence d'entrée à la séquence de Wuhan identifiant les mutations qui correspondent le mieux aux variantes précédemment détectées, ce qui entraîne : un rapport de lignée, un nombre de mutations, une carte d'alignement indiquant la couverture du génome et un général Métrique QC des données analysées. Nous avons utilisé Pangolin pour générer un rapport de lignée et un score d'ambiguïté pour les échantillons traités [+ NT] et [− NT]. Pour les échantillons [− NT], Pangolin n'a pu générer un rapport de lignée que pour 3 échantillons sur 10 avec un score d'ambiguïté moyen de 0,824. En présence de particules Nanotrap [+ NT], cependant, Pangolin a pu caractériser les 10 échantillons, produisant un score d'ambiguïté moyen de 0,898, indiquant que les particules Nanotrap ont pu améliorer la capacité du logiciel à caractériser les échantillons (Fig. 5A).

Les particules d'hydrogel magnétique (particules nanotrap) améliorent les outils bioinformatiques lors de l'analyse des échantillons de SARS-CoV-2. 10 échantillons résiduels de diagnostic positifs pour le SARS-CoV-2 ont été traités à l'aide du Nanotrap Particle Workflow 3 [+ NT] ou du kit MagMAX seul [− NT]. Les échantillons ont subi un séquençage sur une Flow Cell ONT MinION R.9 et ont été analysés par Pangolin (a) et Nextclade, qui ont évalué : la comparaison des scores de CQ des 10 échantillons (b), les emplacements totaux du génome incapables d'être caractérisés par échantillon (n manquants , moins = mieux) (c), nombre total de mutations détectées par échantillon (d).

L'analyse Nextclade a révélé une tendance similaire avec l'utilisation de particules Nanotrap permettant de caractériser davantage d'échantillons avec une note de qualité supérieure. Nextclade utilise un système de contrôle qualité à trois niveaux : "bon", "médiocre" et "mauvais". Le niveau QC indique la quantité de données fournies qui a pu être caractérisée par Nextclade pour évaluer avec précision le génome viral et déterminer une classification précise. Lorsque l'échantillon fournit des données insuffisantes pour qu'une classification soit attribuée, les échantillons reçoivent "Aucune évaluation". Ici, dix échantillons sur dix traités avec des particules Nanotrap ont été caractérisés, 6 échantillons sur 10 recevant une note QC de "bon" et 4 échantillons sur 10 recevant une note QC de "mauvais". Pour les échantillons [− NT], 2 échantillons sur 10 ont reçu une note CQ de « médiocre » et 6 échantillons sur 10 ont reçu une note CQ de « mauvais ». Les 2 échantillons restants n'ont pas pu être caractérisés et n'ont pas reçu de note, ce qui indique que les particules Nanotrap ont amélioré la capacité du logiciel à caractériser les échantillons, permettant aux échantillons précédemment "mauvais" ou "médiocres" de devenir des échantillons "bons" (Fig. 5B). De plus, le traitement des particules Nanotrap a amélioré l'analyse Nextclade en diminuant la quantité de bases manquantes d'une moyenne de 15 556 "n", ou le nombre d'emplacements du génome viral incapables d'être caractérisés par Nextclade (Fig. 5C). Les "n manquants" sont des angles morts du génome viral qui ne peuvent pas être utilisés pour déterminer si une mutation existe à cet endroit, ces "n manquants" contribuent également à la cote de qualité Nextclade. Moins il y a de "n manquants", plus l'outil Nextclade devient précis et utile, permettant l'analyse d'une plus grande partie du génome du SRAS-CoV-2. Pour les échantillons traités avec des particules Nanotrap, Nextclade a détecté en moyenne 9,2 mutations supplémentaires par échantillon par rapport aux échantillons traités sans particules Nanotrap (Fig. 5D). Dans l'ensemble, ces résultats démontrent en outre que l'enrichissement viral en particules Nanotrap permet une meilleure analyse des échantillons à l'aide d'outils bioinformatiques courants.

Idéalement, les technologies de concentration virale devraient permettre la concentration de plusieurs virus, pas seulement du SARS-CoV-2. Comme des études antérieures l'ont démontré, les particules d'hydrogel magnétique (particules Nanotrap) capturent une variété de virus respiratoires ; nous avons brièvement étudié si les particules Nanotrap pouvaient également être utilisées pour améliorer le séquençage de la grippe A (H1N1) et du virus respiratoire syncytial (VRS)18,19,20. Neat VTM a été dopé séparément à 106 TCID50/mL avec soit la grippe A inactivée, soit le RSV. En utilisant le protocole d'extraction d'ARN basé sur colonne précédemment établi, les échantillons viraux artificiels ont été traités avec Nanotrap Particle Workflow 1 [+ NT] et les résultats ont été comparés aux échantillons traités sans particules Nanotrap [− NT]. Les éluats d'ARN résultants ont ensuite été préparés pour le séquençage à l'aide d'une version modifiée du protocole ARTIC Library Prep utilisant des amorces spécifiques à la grippe A et au RSV. Les échantillons ont été analysés sur l'ONT Mk1C. Les résultats de la Fig. 6A et de la Fig. 6C démontrent que les particules Nanotrap améliorent les résultats de séquençage des nanopores pour les échantillons artificiels de grippe A et de RSV, respectivement. Les particules Nanotrap ont amélioré les lectures cartographiées virales de 4 × pour la grippe A et le VRS par rapport aux échantillons traités sans particules Nanotrap. De plus, l'utilisation de particules Nanotrap dans le traitement des échantillons a amélioré la détection de l'ARN viral telle que mesurée par RT-PCR pour la grippe A et le RSV, respectivement (Fig. 6B, Fig. 6D). Le test t apparié a confirmé que l'amélioration induite par les particules Nanotrap était statistiquement significative avec des valeurs p calculées <0,05. Ces résultats indiquent que les particules Nanotrap peuvent être utilisées pour identifier et améliorer les résultats de séquençage de plusieurs virus dans des échantillons de VTM.

Les particules d'hydrogel magnétique (particules nanotrap) améliorent le séquençage de plusieurs virus respiratoires. La grippe A (H1N1) (a, b) ou RSV (c, d) inactivée par la chaleur a été dopée dans du VTM à 106 TCID50/mL et les échantillons ont été traités à l'aide de Nanotrap Particle Workflow 1 [+ NT] ou du kit Qiagen RNEasy seul [− NT]; n = 3 pour les deux processus. Les échantillons ont ensuite été séquencés sur une Flow Cell ONT MinION R.9 ou RT-PCR. [+ NT] ont été comparés à [− NT] par test t apparié afin d'évaluer l'importance de la détection virale accrue. *p < 0,05, **p < 0,01 , ***p < 0,001.

Les progrès récents dans le séquençage de nouvelle génération et les techniques d'amplification post-traitement ont réduit les titres viraux requis pour des séquences de séquençage réussies et une détection précise des mutations27,28. Bien que ces progrès aient généralement amélioré la sensibilité des applications de séquençage, pour certaines plateformes de séquençage, il existe encore une partie importante d'échantillons viraux cliniquement pertinents qui ne peuvent pas être séquencés en raison de faibles titres viraux, des échantillons dans lesquels il n'y a pas suffisamment de molécules d'acide nucléique pour que les outils bioinformatiques couvrir l'intégralité du génome de référence tout en distinguant en toute confiance la variation biologique de l'erreur. Plus précisément, les plates-formes de séquençage "basecall", ou créent des lectures des fragments de nucléotides à partir des signaux bruts générés par le séquenceur à partir des échantillons d'ARN traités. Ces fragments appelés base sont comparés et cartographiés par rapport à une base de données pour identifier la taxonomie génomique du fragment. Au cours de ce processus de cartographie, les différences se propageront entre l'échantillon analysé et le génome de référence. Ces différences dans les lectures peuvent être dues soit à de véritables mutations génétiques, soit à des appels de base erronés, ces derniers pouvant être causés soit par le séquenceur lui-même, soit par un matériel d'acide nucléique insuffisant. L'augmentation du nombre de fragments appelés base clarifie ce chevauchement problématique avec des profondeurs de lecture plus grandes, augmentant la confiance que les variations détectées sont biologiques et non un artefact11,12,13,14,15.

La plate-forme de séquençage Oxford Nanopore MinION est une technologie de séquençage de troisième génération compacte et peu complexe qui a considérablement réduit le coût initial généralement associé au séquençage. Bien que cette technologie présente de nombreux avantages attrayants, le pool d'échantillons cliniques utilisables est limité aux échantillons à titre plus élevé en raison des limites de sensibilité et de précision29,30,31. Nous avons vu cette limitation comme une opportunité d'examiner les stratégies d'enrichissement potentielles pour améliorer la quantité de matériel d'acide nucléique séquencé, augmentant ainsi le pool disponible d'échantillons cliniques. À cette fin, nous avons appliqué une méthode de capture et de concentration de virus frontal à base de particules d'hydrogel magnétique (particules Nanotrap) à la fois à des VTM artificielles et à des échantillons résiduels de diagnostic.

Les particules d'hydrogel magnétique (particules de nanotrap) ont considérablement amélioré les résultats de séquençage en capturant et en concentrant le SRAS-CoV-2 à partir d'échantillons artificiels, améliorant ainsi le résultat de deux méthodes d'extraction d'ARN standard. De plus, nous avons identifié une plage de concentration de travail générale de SARS-CoV-2 dans laquelle il a été démontré que les particules Nanotrap augmentaient de manière significative les lectures cartographiées virales de la plate-forme de séquençage ONT Mk1C. Des améliorations de séquençage et de RT-PCR ont été observées pour les flux de travail 1 et 2 des particules Nanotrap. Par rapport aux résultats fournis par les kits d'extraction d'ARN sans prétraitement des particules Nanotrap, les deux flux de travail ont considérablement amélioré les lectures cartographiées virales totales du SRAS-Cov-2 à plusieurs reprises. concentrations. Des deux workflows, des améliorations plus importantes ont été observées avec le Nanotrap Particle Workflow 1 basé sur une colonne par rapport à son comparateur. Ce flux de travail utilisait un volume d'échantillon plus important, permettant une quantité d'enrichissement plus importante par rapport au comparateur.

Pour l'approche du kit d'extraction d'ARN à base de billes magnétiques, les lectures cartographiées virales étaient généralement plus élevées à toutes les concentrations pour les échantillons traités avec et sans particules Nanotrap, par rapport aux extractions d'ARN à base de colonne. Cela suggère une plus grande efficacité d'extraction d'ARN du kit d'extraction de billes magnétiques, liant et éluant un pourcentage plus élevé d'ARN. Les résultats de la RT-PCR ont soutenu cette théorie ; nous avons observé que l'approche par billes magnétiques permettait la détection du SRAS-CoV-2 à une concentration dix fois inférieure à l'approche par colonne. Les lectures cartographiées virales étaient plus élevées pour le flux de travail de particules Nanotrap 2 par rapport au flux de travail de particules Nanotrap 1, bien que la plage de concentration pour laquelle les particules Nanotrap aient considérablement amélioré le nombre de lectures était similaire pour les deux flux de travail, améliorant les résultats de séquençage pour les échantillons à concentration plus élevée. Bien que ces concentrations plus élevées soient généralement moins problématiques pour le séquençage traditionnel sans pré-enrichissement, l'amélioration des échantillons à titre élevé peut toujours être utile car la profondeur de séquençage peut être atteinte plus rapidement, réduisant ainsi le temps nécessaire pour réussir le séquençage et l'analyse de ces types d'échantillons. Les résultats de la RT-PCR ont montré que l'enrichissement en particules Nanotrap était efficace pour les échantillons à faible concentration pour les deux flux de travail, ce qui suggère que sur une plate-forme de séquençage alternative avec une plus grande sensibilité globale, les particules Nanotrap pourraient également améliorer le séquençage de ces échantillons de virus à titre inférieur.

De plus, les résultats indiquent que les flux de travail de particules Nanotrap améliorent le séquençage et les résultats de RT-PCR d'échantillons résiduels de diagnostic cliniquement pertinents par rapport aux flux de travail sans particules Nanotrap. Il semble que les particules Nanotrap améliorent les résultats de séquençage des échantillons de diagnostic restants de manière plus significative que les échantillons VTM artificiels. Les échantillons traités dans cette étude ont été choisis pour représenter une cohorte cliniquement pertinente, avec des valeurs de Ct allant de 24 à 35. Il ne semble pas y avoir de corrélation étroite entre les valeurs Ct et l'utilité de l'enrichissement en particules Nanotrap. Fait intéressant, la plupart des échantillons résiduels de diagnostic ont bénéficié de l'enrichissement en particules Nanotrap, quelle que soit la concentration virale. Cette amélioration est encore plus convaincante si l'on considère l'enrichissement théorique résultant de la différence de volume d'entrée d'échantillon. Pour les flux de travail 1 et 3, nous nous attendions à une amélioration de 10 × ou 2,5 × par rapport aux échantillons traités sans particules Nanotrap. Pourtant, cela a été largement dépassé car nous avons observé un enrichissement supérieur à 40 × dans les lectures cartographiées virales des échantillons de diagnostic restants. Nous postulons que le VTM collecté sur les humains contient généralement plus de débris biologiques et, par conséquent, les flux de travail sans particules Nanotrap sont plus susceptibles d'être affectés par l'inhibition tandis que le prétraitement des particules Nanotrap réduit ce matériau nuisible grâce à un nettoyage supplémentaire de l'échantillon. Il est possible que l'architecture des particules Nanotrap permette la capture du matériel viral d'intérêt tout en réduisant les débris de cellules hôtes et autres matériaux contaminants. Le flux de travail de préparation de la bibliothèque de séquençage évalué ici reposait sur une étape d'amplification à base de polymérase qui pourrait être affectée négativement par le matériel cellulaire humain. Le nettoyage du matériel de fond tout en capturant et en concentrant le matériel viral permettrait au flux de travail Nanotrap d'améliorer encore plus cette étape d'amplification, générant ainsi un plus grand nombre total de lectures cartographiées virales pour les échantillons de VTM résiduels de diagnostic. De plus, cet enrichissement a été observé pour les échantillons avec des valeurs de Ct inférieures, des échantillons qui répondraient généralement aux critères de qPCR qui dictent un échantillon "utile" pour le séquençage mais qui ont encore du mal à générer des résultats de séquençage utiles dans la pratique. Cela peut indiquer que le flux de travail d'hydrogel magnétique pourrait être utile non seulement pour les échantillons à faible titre, mais également pour les échantillons cliniques avec des concentrations plus élevées qui échouent au séquençage.

Les particules Nanotrap ont considérablement amélioré les lectures cartographiées virales d'une grande majorité des échantillons résiduels de diagnostic pour les deux flux de travail. En conséquence, la couverture du génome viral a également augmenté pour la majorité des échantillons de diagnostic restants, augmentant de 80 % dans certains échantillons de diagnostic restants. Ces données suggèrent que les particules Nanotrap pourraient augmenter de manière significative la fraction d'échantillons pouvant être utilisés pour le séquençage, bien qu'un ensemble d'échantillons plus important doive être exécuté pour le confirmer. Il convient de noter que certains des échantillons pour lesquels il n'y avait pas d'amélioration statistiquement significative lorsque les particules Nanotrap étaient utilisées, avaient déjà une couverture génomique relativement complète lorsqu'ils étaient traités sans particules Nanotrap.

Pour évaluer plus en détail l'utilité pratique de l'amélioration constatée lors de l'utilisation des particules Nanotrap, nous avons également analysé les données de séquençage à l'aide de Pangolin et Nextclade, deux outils bioinformatiques couramment utilisés dans le monde pour suivre et analyser les variants du SARS-CoV-232,33,34. Ces outils ont été sélectionnés en fonction de leur capacité à détecter et à classer les mutations, leurs besoins en données pour une analyse réussie des variantes et leurs mesures qualitatives respectives dictant la qualité des informations. Cela a fourni un système de classement que nous avons utilisé pour mieux déterminer l'impact de l'enrichissement des particules Nanotrap sur les données de séquençage. Nous avons observé que pour la majorité des échantillons résiduels de diagnostic testés, le processus de particules Nanotrap a permis à ces outils bioinformatiques de fonctionner plus efficacement et, pour certains échantillons à faible titre, a permis à la fois à Pangolin et à Nextclade de mener à bien une analyse qui aurait autrement échoué en raison à des données insuffisantes. Nextclade a également été en mesure de mieux cartographier l'ensemble du génome du SRAS-CoV-2 pour les échantillons Nanotrap, en identifiant davantage de mutations totales par échantillon par rapport au contrôle [− NT]. Cela suggère que les particules Nanotrap permettent potentiellement aux chercheurs de suivre et de détecter plus efficacement les variantes qui ne seraient pas détectées sans la sensibilité accrue fournie par le processus de particules Nanotrap.

Pour que le séquençage devienne plus utile dans les milieux de santé publique, les considérations de débit d'échantillon et de flux de travail doivent être abordées. Les systèmes automatisés, tels que la plate-forme d'automatisation KingFisher, sont facilement évolutifs et déjà utilisés comme outil de traitement dans les laboratoires cliniques35. Les particules Nanotrap ont amélioré les résultats de séquençage de dix échantillons résiduels de diagnostic positifs lors du traitement à l'aide de Nanotrap Workflow 3, démontrant leur utilité dans un système automatisé à haut débit. Il convient de noter que cette méthode automatisée permettrait le traitement de 96 échantillons en 1 h, ce qui est nettement plus rapide et beaucoup plus convivial que la méthode d'extraction manuelle de la colonne, ce qui en fait une proposition attrayante pour les laboratoires à débit moyen à élevé.

En plus du SRAS-CoV-2, les particules Nanotrap ont démontré leur utilité dans la capture d'un large éventail de virus, y compris les agents pathogènes respiratoires17,18,19,20,21. Cependant, à ce jour, aucune donnée de séquençage viral n'a jamais été publiée lors de l'utilisation d'un flux de travail de particules Nanotrap. Ici, nous avons confirmé les rapports précédents montrant que les particules Nanotrap peuvent également capturer et concentrer la grippe A et le VRS, deux virus respiratoires courants. Nous avons en outre démontré que notre flux de travail de particules Nanotrap est compatible avec le séquençage de plusieurs agents pathogènes respiratoires, augmentant ainsi les lectures cartographiées virales des deux virus. Cela suggère que les workflows de particules Nanotrap peuvent être utilisés pour l'amélioration de la détection virale à grande échelle par séquençage.

Cette étude comporte certaines limites, à commencer par le nombre d'échantillons évalués. Un nombre suffisant de répliques ont été testées pour déterminer une amélioration positive apportée par le processus de particules Nanotrap lors du séquençage des échantillons VTM, mais davantage d'échantillons doivent être exécutés pour quantifier mieux et plus précisément l'enrichissement en plis que le flux de travail peut fournir. Nous n'avons pas non plus évalué directement la capacité des particules Nanotrap à améliorer le séquençage de différentes variantes du SRAS-CoV-2. Cependant, étant donné la nature générale de capture virale des particules Nanotrap, nous nous attendons à ce que les améliorations de séquençage observées avec le SARS-CoV-2 de type sauvage correspondent aux améliorations de la plupart des autres variantes du SARS-CoV-2. Des expériences futures pourraient tester cette hypothèse en évaluant l'enrichissement en particules Nanotrap d'échantillons avec des variantes connues sur la base d'une détection accrue. Nous pourrions également créer un pool de tests d'échantillons résiduels de diagnostic avec des variantes connues à des titres inférieurs pour examiner si le flux de travail des particules Nanotrap peut augmenter le nombre d'échantillons cliniques disponibles pour le séquençage en même temps. De plus, étant donné que seuls des échantillons artificiels de grippe A et de VRS ont été examinés, nous ne pouvons pas affirmer définitivement pour le moment que le processus de particules Nanotrap est capable de séquencer ces agents pathogènes respiratoires dans des milieux plus complexes sur le plan biologique. Nous n'avons pas non plus examiné ce qui se passe dans les échantillons co-infectés par plusieurs virus. Cela pourrait potentiellement biaiser les particules Nanotrap vers un virus spécifique si ce virus a une plus grande affinité pour les particules Nanotrap que les autres. Les futures expériences devraient examiner le comportement des particules de Nanotrap dans un échantillon co-infecté, ainsi que l'utilisation d'échantillons résiduels de diagnostic plus pertinents sur le plan clinique contenant la grippe A ou le VRS. Il est également possible d'explorer d'autres applications de cette approche à d'autres types d'échantillons, notamment le liquide oral (qui pourrait être utilisé pour des tests respiratoires viraux moins invasifs) et les eaux usées (qui pourraient être utilisées pour effectuer la surveillance des agents pathogènes respiratoires viraux dans les communautés). À l'avenir, nous prévoyons d'aborder chacun de ces domaines afin de pouvoir continuer à examiner les applications de surveillance virale avec cette technologie d'enrichissement polyvalente.

Dans l'ensemble, cette étude indique que l'enrichissement en particules d'hydrogel magnétique (particules Nanotrap) permet le séquençage d'échantillons cliniques difficiles dans VTM à l'aide du séquenceur ONT MinION, des échantillons qui, autrement, n'auraient peut-être pas été adaptés au séquençage. Parce que notre méthode ne nécessite aucune étape de filtration ou de centrifugation, cette approche est compatible avec les environnements à débit moyen et élevé, y compris la plate-forme d'automatisation KingFisher. De plus, une méthode de concentration de particules d'hydrogel magnétique (particules Nanotrap) associée à une plate-forme de séquençage ONT permet des efforts de séquençage plus accessibles. Compte tenu du coût et de la portabilité relativement faibles des deux technologies, ce système combiné pourrait potentiellement être déployé dans des zones disposant de ressources de laboratoire limitées et d'un accès limité à des équipements de séquençage plus traditionnels.

Les ensembles de données générés et/ou analysés au cours de l'étude en cours sont disponibles dans le référentiel Github, https://github.com/Ceres90/NT-Extraction-Data. Génome de référence : Isolat du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère Wuhan-Hu-1, numéro d'accession du génome complet : NC_045512.

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Cette publication a été soutenue par la subvention SBIR 1 R43IP001142-01 des Centers for Disease Control and Prevention et par l'initiative NIH Rapid Acceleration of Diagnostics (RADxSM) financée en tout ou en partie par des fonds fédéraux du National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering , National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, sous le contrat n° 75N92020C00021. Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des Centers for Disease Control and Prevention ou celles des National Institutes of Health.

P. Andersen

Adresse actuelle : Ceres Nanosciences, Inc., Manassas, VA, 20110, États-Unis

Ceres Nanosciences, Inc., Manassas, Virginie, 20110, États-Unis

Barksdale S, RA Barclay, N Smith, J Fernandes, K Besse, D Goldfarb, R Barbero, R Dunlap, R Jones-Roe, R Kelly, S Miao, C Ruhunsiri, A .Munns, S. Mosavi, L. Sanson, D. Munns, S. Sahoo, O. Swahn, K. Hull, D. White, K. Kolb, F. Noroozi, J. Seelam, A. Patnaik & B. Lepene

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PA, NS, DG, JF et KB ont réalisé les expériences, contribuant à la capture virale, à l'extraction virale et à la détection virale. AP, DM, SM, SS, RK, CR, SM, DW, JS, FN, OS, AM, KK et KH ont contribué à la production et au contrôle qualité des particules Nanotrap®. PA, RB, TJ, BL, SB, RD et RAB ont contribué à la présentation et au formatage des données. PA, SB, RAB et BL ont analysé et interprété les données et ont participé à la conception expérimentale. PA, RB, TJ, BL, SB, RD et RAB ont été impliqués dans la rédaction et l'édition du manuscrit tout en assurant la direction générale et la coordination de cette étude. Tous les auteurs ont approuvé le manuscrit.

Correspondance avec P. Andersen ou B. Lepene.

PA, SB, RAB, NS, JF, KB, DG, RB, RD, TJR, RK, SM, CR, AM, SM, LS, DM, SS, OS, KH, DW, KK, FN, JS, AP, BL sont des employés de Ceres Nanosciences Inc.

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Réimpressions et autorisations

Andersen, P., Barksdale, S., Barclay, R. et al. Les particules d'hydrogel magnétique améliorent le séquençage des nanopores du SRAS-CoV-2 et d'autres virus respiratoires. Sci Rep 13, 2163 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29206-7

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Reçu : 18 avril 2022

Accepté : 31 janvier 2023

Publié: 07 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-29206-7

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