Le densovirus du moustique réduit significativement la sensibilité du vecteur au virus de la dengue de sérotype 2 chez les moustiques Aedes albopictus (Diptera : Culicidae)

Maladies infectieuses de la pauvreté volume 12, numéro d'article : 48 (2023) Citer cet article

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Le virus de la dengue (DENV) est une menace majeure pour la santé publique, Aedes albopictus étant le vecteur confirmé responsable des épidémies de dengue à Guangzhou, en Chine. Les densovirus de moustiques (MDV) sont des virus pathogènes spécifiques aux moustiques, et un nouveau MDV a déjà été isolé à partir d'Ae. albopictus à Canton. Cette étude vise à déterminer la prévalence des MDV chez les Ae sauvages. albopictus et étudier leurs interactions potentielles avec le DENV et leur impact sur la sensibilité des vecteurs au DENV.

La prévalence du MDV chez les moustiques sauvages en Chine a été étudiée à l'aide de données de séquençage en libre accès et de la détection par PCR chez Ae. albopictus à Canton. Le taux d'infection virale et les titres dans les cellules C6/36 persistantes du MDV ont été évalués à 12, 24, 48, 72, 96 et 120 h après l'infection (hpi) par dosage d'immunofluorescence indirecte (IFA) et PCR quantitative en temps réel (RT- qPCR). Le taux d'infection de l'intestin moyen (MIR), le taux de dissémination (DR) et le taux d'infection des glandes salivaires (SGIR) dans divers tissus de moustiques infectés par le MDV ont été détectés et quantifiés à 0, 5, 10 et 15 jours après l'infection (dpi) par RT-PCR et RT-qPCR. Le test du chi carré a évalué les taux d'infection par le virus de la dengue sérotype 2 (DENV-2) et le densovirus Aedes aegypti (AaeDV) et les indices associés chez les moustiques, tandis que le LSD et les tests t de Tukey ont comparé les titres viraux dans les cellules et tissus C6/36 au fil du temps.

Les résultats ont révélé une distribution relativement large des MDV chez les moustiques Aedes, Culex et Anopheles en Chine et un taux positif de plus de 68 %. In vitro, des réductions significatives des titres de DENV-2 dans le surnageant à 120 hpi et une diminution apparente des cellules DENV-2 positives à 96 et 120 hpi ont été observées. In vivo, le DENV-2 dans les ovaires et les glandes salivaires a été détecté pour la première fois à 10 dpi chez les Ae monoinfectés et surinfectés. albopictus femelles, tandis que la surinfection de MDV avec DENV-2 a supprimé le taux d'infection des glandes salivaires à 15 dpi. Titre DENV-2 dans l'ovaire et les glandes salivaires d'Ae. albopictus a été réduit chez les moustiques surinfectés à 15 dpi.

Les MDV sont répandus dans les populations naturelles de moustiques et la réplication de DENV-2 est supprimée chez les Ae infectés par le MDV. albopictus, réduisant ainsi la sensibilité du vecteur au DENV-2. Notre étude soutient l'hypothèse selon laquelle les MDV peuvent contribuer à réduire la transmission du DENV et fournit une stratégie alternative pour le contrôle des maladies transmises par les moustiques.

Les densovirus de moustiques (MDV) sont des virus icosashedraux entomopathogènes, non enveloppés, spécifiques aux moustiques, de 20 à 25 nm de diamètre, avec un génome d'ADN linéaire simple brin allant de 4 à 6 kilobases qui se termine par deux structures en épingle à cheveux [1]. Selon une récente révision de la taxonomie, les MDV appartiennent à la famille des Parvoviridae, à la sous-famille des Hamaparvovirinae et au genre Brevihamaparvovirus [2, 3].

En 1972, le premier MDV, le densovirus Aedes aegypti (AaeDV), a été identifié chez un Ae. souche de laboratoire aegypti en Russie [4]. Les MDV ont été isolés en continu à partir de lignées cellulaires de moustiques conservées dans des laboratoires, de colonies de laboratoire de moustiques établies et de populations sauvages de moustiques [5]. La plupart des MDV présentent des degrés variables de pathogénicité chez leur hôte moustique [6]. Les MDV peuvent envahir et proliférer dans plusieurs organes et tissus des moustiques, et l'infection par les MDV peut provoquer la mort ou la déformation des larves. Les MDV prolongent le stade larvaire et diminuent la durée de vie et la taille corporelle des adultes [1]. De plus, leur pathogénicité peut être considérablement améliorée par des techniques de génie génétique, telles que la modification du vecteur utilisé pour exprimer la toxine spécifique de l'insecte [7], le gène ou l'ARN en épingle à cheveux court spécifique ou le micro ARN artificiel qui cible les gènes essentiels au développement, à la croissance, ou la physiologie des moustiques [8, 9]. Les MDV peuvent être transmis dans les populations de moustiques par transmission horizontale dans les habitats larvaires ou par transmission verticale lorsque les femelles infectées survivantes transmettent le virus à leur progéniture ou par transmission vénérienne lors de l'accouplement [1, 10, 11]. Dans l'ensemble, ces caractéristiques biologiques et pathogènes confèrent aux MDV un potentiel en tant qu'agents de lutte biologique [5].

Quelques enquêtes ont révélé que les MDV sont plus probablement répandus dans les populations naturelles, comme chez Ae. aegypti, Anopheles minimus et Culex pipiens [23, 24]. Par exemple, le taux global de positivité au MDV atteint 18,8 % chez les larves sauvages et 15 % chez les adultes d'An. minimus collectés à Ban Phu Toei, un village de Thaïlande, lors de l'utilisation de méthodes de détection basées sur la PCR [12]. Une autre enquête PCR sur le taux d'infection par le MDV chez les Ae adultes. aegypti et Ae. albopictus également réalisée en Thaïlande a montré que seule l'Ae. aegypti sauvage était infectée par le MDV, avec une prévalence globale de 44 % [13]. Une enquête à plus grande échelle sur la prévalence générale du densovirus Culex pipiens (CpDV) dans les Cx naturels. pipiens (sl) a été récemment signalée; plus de deux mille Cx. pipiens ont été prélevés dans 136 endroits différents dans le monde et 48 % des échantillons étaient positifs pour le CpDV, comme déterminé par les tests de diagnostic PCR [14].

Le virus de la dengue (DENV) appartient à la famille des Flaviviridae, genre Flavivirus, et se transmet principalement à l'homme par la piqûre de moustiques femelles adultes infectées, notamment Ae. aegypti et Ae. albopicus [15, 16]. La province de Guangdong, située dans le sud-est de la Chine, est une région hyperendémique de transmission de la dengue. Depuis la première épidémie de dengue en 1978, plus de 0,72 million de cas cumulés ont été enregistrés au cours des 40 dernières années, représentant environ 90 % des cas en Chine [17]. Depuis 2010, le virus de la dengue de sérotype 1 (DENV-1) et le virus de la dengue de sérotype 2 (DENV-2) sont les sérotypes prédominants dans le Guangdong. Cependant, l'analyse épidémiologique actuelle confirme que la dengue ne s'est pas encore développée en une maladie arbovirale endémique dans le Guangdong, les épidémies locales de dengue étant toujours déclenchées par des cas importés [17, 18]. Aé. albopictus est le seul vecteur de transmission confirmé responsable de ces épidémies de dengue dans le Guangdong [17].

Auparavant, nous avons isolé et caractérisé le nouveau densovirus Aedes albopictus-7 (AalDV-7) à partir d'Ae capturés dans la nature. albopictus dans la zone d'endémie de la dengue de la ville de Guangzhou, province du Guangdong [6], ce qui conduit à se demander si le MDV existe largement dans la population sauvage d'Ae. albopictus et quelle pourrait être leur influence potentielle sur la transmission du DENV par les moustiques. Dans cette étude, nous avons d'abord utilisé DENV-2 pour surinfecter des cellules C6/36 infectées de manière persistante par AaeDV et déterminé l'impact d'une telle surinfection sur DENV-2 en examinant l'infection persistante. Pour explorer plus avant une interférence compétitive in vivo, nous avons également évalué si la présence d'AaeDV chez les moustiques vivants interfère avec la sensibilité du vecteur au DENV-2 et aux modes d'infection séquentiels en fonction de la probabilité que les défis séquentiels soient les plus fréquents dans la nature.

Les données de séquençage métagénomique de nouvelle génération (NGS) pour les moustiques de terrain en Chine ont été recherchées dans la base de données NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) et dans la base de données CNGB Sequence Archive (https://db. cngb.org/cnsa/) en utilisant les mots-clés "moustique OU Anopheles OU Aedes OU Culex". Après avoir supprimé les ensembles de données avec moins d'un million de lectures et conservé ceux dérivés du terrain en Chine, un total de 29 ensembles de données publiés de cinq divisions administratives de niveau provincial (PLAD) ont été récupérés, dont quatre du Guangdong (SRP188743), trois du Yunnan (SRP148705), onze du Ningxia, cinq du Gansu et six du Shanxi (CNP0001261) (détails dans le fichier supplémentaire 1 : tableau S1).

Vingt-six génomes de densovirus de moustique (MDV) ont été téléchargés comme référence à partir de GenBank en utilisant les mots-clés de recherche "densovirus" ET "(moustique OU aAnopheles OU aAedes OU Culex)", avec une longueur de séquence limitée à plus de 3500 bp (voir fichier supplémentaire 2 : Tableau S2 pour le numéro d'accession MDV).

Les adaptateurs et les bases de mauvaise qualité ont été supprimés avec TrimGalore (v0.6.7) [19]. Les lectures propres restantes ont été alignées sur les génomes d'Ae. albopictus (AaloF1.2, GCA_001444175.1), Cx. quinquefasciatus (JHB2020, GCA_015732765.1), et An. sinensis (AsinS2.6, GCA_000472065.2) par bowtie2 (v2.4.4) [20]. Tous ces génomes ont été téléchargés depuis Vectorbase (http://www.vectorbase.org). La cartographie des lectures sur les génomes de l'hôte a été supprimée pour exclure les interférences du génome de l'hôte et l'éventuelle insertion de séquences virales, et les lectures non cartographiées ont été alignées sur la référence MDV à l'aide de blatsn (v2.4.4, NIH, USA) avec le paramètre "evalue < 1e−10 ". Les lectures mappées ont été conservées en tant que lectures liées à MDV. L'abondance de lectures MDV a été divisée par le nombre de bibliothèques et multipliée par un million normalisé au CPM.

Guangzhou est la troisième plus grande ville de Chine et la plus grande du sud du pays. La population de Guangzhou est estimée à plus de 13 900 000 en 2022. La région autour de Guangzhou est connue pour un afflux massif de migrants, avec jusqu'à 30 millions de migrants supplémentaires vivant dans la région pendant au moins six mois par an. La température annuelle moyenne à Guangzhou est de 22,4 °C et les précipitations sont d'environ 2123 mm par an. Par conséquent, les facteurs environnementaux et sociaux à Guangzhou facilitent la transmission du DENV, et des épidémies de DENV sont signalées dans cette région depuis plus de 40 ans [21]. Pour étudier la prévalence générale des MDV chez les Ae naturels de Guangzhou. albopictus, trois sites ont été sélectionnés pour les collectes de moustiques, le quartier résidentiel de la Southern Medical University (SMU) (113°19′E, 23°11′N, 31 m au dessus du niveau de la mer (asl), densité de population > 3000 personnes/ km2), Liangtian (113°23′E, 23°21′N, 25 m d'altitude ; densité de population d'environ 1000 personnes/km2), et Dengcun (113°339′E, 23°309′N, 42 m d'altitude, 100 personnes/km2), représentant trois types d'habitats écologiques différents : urbain, suburbain et rural. Des moustiques ont été collectés entre juin et juillet 2022 sur trois sites à Guangzhou (Fig. 1) : SMU, Dengcun et Liangtian. Les moustiques ont été capturés à l'aide de pièges à double filet (HDN) à appât humain. Après avoir été placé sur un bain de glace, seul Ae. les moustiques femelles albopictus sur la base des caractéristiques morphologiques ont été retenues pour une détection ultérieure de l'infection par le MDV.

Analyse des taux positifs de densovirus de moustiques (MDV) dans les populations naturelles de moustiques. Un graphique à colonnes empilées montrant les taux positifs de densovirus de moustiques (rouge) et les taux négatifs (bleu) de lectures dans les données métagénomiques de moustiques de terrain de cinq divisions administratives de niveau provincial. B Taux positifs de MDV (rouge) et taux négatifs (bleu) dans les populations naturelles de moustiques recueillies sur trois sites à Guangzhou. SMU Le quartier résidentiel de l'université médicale du Sud

L'ADN a été extrait de moustiques femelles individuels collectés dans les populations naturelles des 3 sites (n = 100 par site) et testé pour la présence de MDV par PCR traditionnelle (Fichier supplémentaire 3 : Tableau S3). Des échantillons sans MDV provenant de la colonie de laboratoire ont été utilisés comme contrôle négatif. Un ensemble d'amorces spécifiques aux MDV a été conçu pour amplifier un fragment de 655 pb (de la position 899 à 1554 du génome AaeDV référencé ; numéro d'accès GenBank : M37899.1) situé dans le cadre de lecture ouvert (ORF) NS1 hautement conservé. Cet ensemble d'amorces a pu détecter non seulement l'AaeDV, mais également d'autres densovirus apparentés, tels que le densovirus d'Aedes albopictus (AalDV), le densovirus d'Anopheles gambiae (AgDV), le densovirus de Culex pipiens (CpDV), sur la base du haut niveau de conservation dans cette région. parmi les MDV (Fig. 1, Fichier complémentaire 4 : Fig. S1). La protéine ribosomale S7 (Rps7) a été utilisée comme contrôle interne et a été amplifiée dans le même tube à essai sur la base d'une PCR multiplex (MPCR). Voir Fichier supplémentaire 3 : Tableau S3 pour les amorces et les protocoles de PCR. Toutes les expériences ont été réalisées dans un laboratoire de confinement de niveau de sécurité biologique 2.

Aé. albopictus C6/36 (ATCC, Manassas, USA, Cat# CRL-1660, RRID : CVCL_Z230) ont été cultivées à 28 °C dans le milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Gibco BRL, NY, USA) additionné de 10 % sérum bovin fœtal (FBS; Gibco BRL, NY, USA) et maintenu à 28 ° C.

Aé. des moustiques albopictus de souche Foshan ont été utilisés dans cette étude. Les moustiques ont été élevés dans des conditions d'insectarium standard à une température constante de 28 ± 2 °C, une humidité relative de 70 à 80 % et une photopériode lumière/obscurité de 12 h 12. Les larves ont été élevées dans des casseroles rectangulaires en acier inoxydable de 26,5 cm sur 15,5 cm et nourries avec de la nourriture commerciale finement moulue pour tortues (INCH-GOLD, Shenzhen, Chine). Les colonies adultes ont été maintenues dans des cages en acier inoxydable [20 (longueur) × 20 (largeur) × 30 (hauteur) cm, volume = 12 000 cm3] et fournies avec une mèche de coton imbibée d'une solution de sucre à 10 %. Des femelles adultes ont été nourries avec du sang de mouton défibriné (Solarbio Life Sciences, Pékin, Chine) à l'aide de systèmes d'alimentation à membrane Hemotek (Hemotek Ltd., Blackburn, Royaume-Uni) trois et quatre jours après l'émergence. Chaque lot de moustiques a été examiné par PCR conventionnelle pour s'assurer que les moustiques expérimentaux étaient exempts de MDV.

Pour établir la lignée cellulaire infectée de manière persistante par l'AaeDV, des cellules C6/36 ont été infectées par l'AaeDV à une concentration finale de 1011 copies/ml ; les cellules infectées ont subi des passages en série tous les deux jours après trois jours d'inoculation avec l'AaeDV. Les cellules C6/36 infectées de manière persistante ont subi dix passages en série après inoculation avec AaeDV et ont été utilisées pour une étude plus approfondie.

pUCA est le clone infectieux d'AaeDV contenant l'ADN génomique complet d'AaeDV, qui a été gracieusement fourni par le professeur Erica Suchman et Jonathan Carlson. La construction de plasmides a été précédemment décrite en détail [22]. Le virus de type sauvage AaeDV a été généré en transfectant pUCA dans des lignées cellulaires C6/36 selon une méthode précédemment décrite [22].

La souche C de Nouvelle-Guinée (NGC) du virus de la dengue de sérotype 2 (DENV-2) utilisée tout au long de cette étude a été conservée dans le laboratoire du Guangdong Provincial Key Laboratory of Tropical Disease Research, School of Public Health, Southern Medical University. Les stocks de DENV-2 ont été obtenus en inoculant une monocouche presque confluente de cellules C6/36 dans un flacon de culture tissulaire de 25 cm2, avec le virus dilué à 1:6 dans 3 ml de milieu RPMI-1640 contenant 2 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur ( FBS ; Gibco BRL, NY, États-Unis). Les surnageants des cellules infectées ont été collectés trois jours après l'infection jusqu'à un effet cytopathique apparent, centrifugés à 1500 × g pendant 5 min, séparés en aliquotes de 0, 5 ml et stockés à - 80 ° C. Les titres viraux sont exprimés en dose infectieuse de culture tissulaire à 50 % (TCID50/ml), selon la méthode décrite par Reed et Muench [23].

Le nombre de copies du génome AaeDV a été quantifié par PCR quantitative en temps réel (qPCR). En bref, l'ADN génomique non encapsidé a été éliminé par traitement avec TURBO DNase (Ambion, Austin, TX, USA) à 37 ° C pendant 1 h. L'ADN génomique total encapsidé a été extrait à l'aide d'un kit d'ADN viral (Omega Bio-Tek, GA, USA). Une courbe standard a été construite en utilisant des dilutions en série au 1/10 d'un plasmide linéaire à des concentrations connues. Les détails de ces procédures ont été décrits précédemment [24]. Le nombre de copies du génome viral a été déterminé à l'aide d'un test qPCR à base de vert SYBR avec SuperReal qPCR PreMix (Tiangen Biotech, Pékin, Chine). Les séquences d'amorces et les conditions de réaction utilisées étaient telles que décrites précédemment [24].

L'ARN du DENV-2 a été quantifié par RT-PCR en temps réel (qRT-PCR) en utilisant des amorces spécifiques décrites précédemment selon les conditions de réaction publiées [25]. Un fragment d'ADN de 1995 pb, amplifié à l'aide d'amorces DENV2-F/DENV2-R, a été ligaturé dans le plasmide pMD18-T après linéarisation avec l'enzyme de restriction EcoRI (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) (Fichier supplémentaire 3 : Tableau S3). Une courbe standard pour DENV-2 a été générée en utilisant une dilution en série de dix fois du plasmide linéaire contenant un fragment de DENV-2 couvrant les nucléotides 9937–10 113 selon les procédures publiées [25]. Chaque échantillon a été analysé en triple exemplaire. Une fois la spécificité des produits de PCR vérifiée par la courbe de fusion, le nombre de copies du génome viral a été déterminé par quantification absolue basée sur les valeurs de seuil de cycle (Ct) et les courbes standard.

Des cellules C6/36 infectées ou non infectées par AaeDV (106) ont été préensemencées dans une plaque à 12 puits 1 jour avant l'infection par DENV-2. Les monocouches de cellules C6 / 36 ont été lavées avec du PBS et infectées avec du DENV-2 à un MOI de 1. Les plaques ont été secouées doucement pendant 15 min à température ambiante pour adsorption et incubées à 37 ° C pendant 2 h. Ensuite, des puits individuels de cellules C6/36 ont été lavés trois fois avec du PBS et du milieu frais a été ajouté. L'infection s'est déroulée à 28 ℃ pendant 12, 24, 48, 72, 96 et 120 h et a été confirmée par test d'immunofluorescence et qRT-PCR.

Les détails de la production d'un anticorps polyclonal de lapin contre l'AaeDV NS1 ont été décrits [6]. Les anticorps monoclonaux de souris contre la glycoprotéine d'enveloppe E2 du virus DENV ont été achetés auprès d'Abcam (Cambridge, MA, États-Unis). Les anticorps secondaires utilisés, IgG anti-lapin d'âne-Alexa Fluor-594 et IgG anti-souris de chèvre-Alexa Fluor-488, ont été achetés chez Thermo Fisher Scientific (MA, USA).

Les cellules C6/36 ont été cultivées sur des lamelles de verre, lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), fixées à l'aide d'un mélange acétone/alcool absolu (3:2), bloquées avec une solution 1% BSA + 0,05% PBST pendant 2 h à 37° C, et lavé avec du PBST. Après incubation avec les anticorps primaires, les lamelles ont été lavées avec du PBS et colorées avec Alexa Fluor 594 IgG anti-lapin d'âne conjugué et/ou Alexa Fluor 488 Hoechst anti-tache de souris anti-souris pendant 1 h à température ambiante. Le DAPI a été utilisé pour la coloration nucléaire. Les images ont été visualisées sous un objectif à huile 100 × à l'aide d'un microscope confocal FluoView 1000 (Olympus, Tokyo, Japon). L'analyse des images et le calcul des signaux positifs d'immunofluorescence ont été réalisés à l'aide du logiciel ImageJ (1.49v, NIH, USA) [26].

Ae de deux jours. albopictus femelles adultes ont été infectées par l'AaeDV par injection intrathoracique. En bref, les adultes ont été anesthésiés sur de la glace et environ 69 nl de stock d'AaeDV (1011 GE/ml) ont été injectés dans le thorax sous un microscope, comme décrit précédemment [27, 28]. Après injection, les moustiques adultes ont été immédiatement transférés dans de petits gobelets en plastique (1000 ml, 11 cm de diamètre au sommet), alimentés avec une solution de glucose à 10 % à travers des mèches de coton imbibées et laissés récupérer. Les moustiques ont reçu une injection de milieu RPMI 1640 uniquement en tant que témoins infectés par simulation. Trois répétitions biologiques indépendantes ont été incluses pour chaque traitement (n = 30 par répétition).

Pour examiner l'interférence entre DENV-2 et AaeDV dans les cellules de moustiques Aedes, des cellules C6/36 stables et persistantes infectées par AaeDV ont été surinfectées avec DENV à un MOI de 1. Des copies du génome de DENV-2 et AaeDV ont été mesurées dans les lysats cellulaires et le surnageant La qPCR et le pourcentage de cellules DENV-2 et AaeDV-positives/négatives ont été calculés à 12, 24, 48, 72, 96 et 120 h après la surinfection (hpi). Pour déterminer l'effet de la surinfection sur le pourcentage de cellules C6/36 positives pour le virus, nous avons effectué une microscopie par immunofluorescence dans des cellules C6/36 monoinfectées et surinfectées, et quantifié l'intensité de fluorescence à l'aide du logiciel ImageJ (1.49v, NIH, USA) [26] .

Les moustiques injectés ont pu récupérer dans des conditions d'élevage standard. Quatre jours après l'injection, Ae. des moustiques femelles albopictus ont été exposées pendant 2 h à des repas de sang infectieux en utilisant une technique de compresse imbibée de sang en trois répétitions indépendantes [29]. Chaque repas de sang comprenait du virus frais dilué dans du sang de mouton défibriné disponible dans le commerce et 1 % de saccharose pour fournir un titre viral final d'environ 107 TCID50/ml de DENV-2. Après l'alimentation, les femelles entièrement gorgées ont été sélectionnées et remises en élevage standard. Pour évaluer les influences de l'infection par AaeDV sur la sensibilité d'Ae. albopictus à l'infection par le DENV, des moustiques femelles adultes ont d'abord été infectées par l'AaeDV [106 équivalents génome (geq)/par moustique] par injection thoracique, puis nourries artificiellement avec un mélange de sang contenant environ 109 copies d'ARN/ml de DENV, comme décrit dans le rubrique méthodes. L'IR, le DR et le SGIR ont été évalués et un adulte monoinfecté a été utilisé comme témoin. Le flux de travail est illustré aux Fig. 5A et B.

À 0, 5, 10 et 15 jours après l'infection par le DENV-2 (dpi), les moustiques survivants ont été anesthésiés au CO2 et disséqués sur une lame de verre prérefroidie pour les tests de sensibilité aux vecteurs. Des micro-aiguilles jetables pour insectes ont été utilisées pour séparer l'intestin moyen, les ovaires et les glandes salivaires de chaque moustique sous un microscope à dissection. Les échantillons ont été lavés trois fois dans du PBS, puis homogénéisés à l'aide d'un broyeur de tissus à moteur avant l'ajout de TRIzol, et l'acide nucléique viral a été extrait à l'aide du kit d'extraction d'ARN/ADN viral MiniBEST Ver. 5.0 (TaKaRa, Japon) suivant le protocole du fabricant. La synthèse d'ADNc du premier brin et l'amplification par RT-PCR ont été réalisées selon des méthodes qui ont été décrites en détail précédemment [30]. Les séquences d'amorces et les conditions de PCR utilisées sont répertoriées dans le fichier supplémentaire 3 : tableau S3.

Sensibilité vectorielle d'Ae. albopictus au DENV-2 a été évalué en calculant le taux d'infection de l'intestin moyen (MIR ; le nombre d'intestins infectés/le nombre d'intestins testés), le taux de dissémination (DR ; le nombre d'ovaires infectés/le nombre d'intestins infectés) et la glande salivaire taux d'infection (SGIR ; nombre de glandes salivaires infectées/nombre de moustiques testés) [31, 32]. Les copies du génome d'AaeDV ont été quantifiées dans tous les intestins moyens, les ovaires et les copies des glandes salivaires et du génome ont ensuite été déterminées dans les tissus positifs au DENV2 par qRT-PCR absolue.

Dans cette étude, la régression logistique a été utilisée pour examiner la compétence vectorielle d'Ae. albopictus pour DENV-2. IR, DR et SGIR ont été comparés séparément à différents moments, et la valeur P a été corrigée par les ajustements de Bonferroni. Des tests du chi carré (et de Fisher exact) ont été utilisés pour déterminer la différence de compétence vectorielle entre le groupe infecté par l'AaeDV et le groupe négatif. Les tests de variance LSD de Tukey ont été effectués post hoc sur les niveaux de DENV-2 dans les tissus pour chaque groupe après transformation logarithmique. Le test t de Student a été utilisé à chaque instant pour comparer les copies d'ARN de DENV-2 entre les groupes infectés par AaeDV et négatifs. Une valeur AP < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative (*), une valeur P < 0,01 représentant une forte signification statistique (**). Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de SPSS 20.0 (IBM, Chicago, IL, États-Unis).

Nous avons caractérisé la prévalence du MDV chez 30 034 moustiques dans 29 pools, représentant quatre espèces de moustiques de cinq PLAD (Yunnan, Shaanxi, Gansu, Ningxia et Guangdong). Après le contrôle de la qualité, un total de 309 695 245 lectures appariées propres ont été conservées, avec une moyenne d'environ 5,16 M de lectures pour 500 moustiques (0,85 à 114,43 M de lectures pour 500 moustiques), et utilisées pour le pipeline d'analyse d'identification MDV ultérieur. Parmi eux, 3 014 183 lectures ont été identifiées comme des lectures virales, représentant 0,12 % (355 113/309 695 245) de toutes les lectures propres et suggérant une riche diversité de MDV hébergés par les moustiques. En excluant six bibliothèques du Shanxi (pas de lectures), les taux de lectures positives du MDV étaient de 66,67 % (2/3), 40,00 % (2/5), 18,18 % (2/11) et 25,00 % (1/4). dans le Yunnan, le Gansu, le Ningxia et le Guangdong, respectivement (Fig. 1, Fichier supplémentaire 4 : Fig. S1). Le CPM des MDV variait de 1,39 à 46 862,13 (fichier supplémentaire 1 : tableau S1). Les taux d'infection minimaux respectifs dans le Shanxi, le Yunnan, le Gansu, le Ningxia et le Guangdong étaient de 0 %, 0,03 %, 0,05 %, 0,02 % et 0,10 % (fichier supplémentaire 1 : tableau S1). Les résultats suggèrent que la population naturelle de moustiques porte généralement diverses quantités de MDV.

Des échantillons d'ADN d'un total de 300 moustiques individuels collectés entre mai et juillet 2022 dans 3 endroits différents (SMU pour urbain, Dengcun pour rural et Liangtian pour suburbain) ont été soumis à un test de diagnostic basé sur la PCR et à un ensemble de tests spécifiques au MDV. primers a été conçu pour amplifier 655 bp (de 899 à 1554) (Fichier supplémentaire 3 : Tableau S3 pour les amorces et les protocoles de PCR, Fig. 1, Fichier supplémentaire 4 : Fig. S1) situé dans l'ORF NS1 hautement conservé. En conséquence, 83,00 %, 79,00 % et 68,00 % des échantillons étaient positifs pour le MDV (Fig. 1) dans la SMU, Liangtian et Dengcun, respectivement (Fichier supplémentaire 4 : Fig. S1, Fichier supplémentaire 5 : Fig. S2).

Les cellules C6/36 ont été infectées de manière persistante par l'AaeDV sans provoquer d'effet cytopathique discernable (CPE) et se sont développées normalement par rapport aux cellules C6/36 non infectées. Le nombre de copies du génome d'AaeDV a été quantifié à la fin de chaque passage à l'aide d'un test PCR quantitatif. Comme le montre la figure 2A, les molécules d'ADN AaeDV provenant de cellules infectées ont été maintenues à des niveaux relativement constants tout au long de dix passages. De plus, le pourcentage total de cellules AaeDV-positives à la fin des premier, cinquième et dixième passages a été détecté avec un anticorps anti-NS1 via IFA (Fig. 2B). Les taux de cellules C6/36 infectées ont été maintenus à environ 16 % (figure 2C). Les résultats ci-dessus indiquent qu'une infection stable et persistante par AaeDV dans les cellules C6/36 a été établie.

Détermination de l'infection stable et persistante par AaeDV dans les cellules C6/36. A Quantification de l'ADN génomique AaeDV des cellules infectées à la fin de chaque passage jusqu'au dixième passage. Les cellules B ont été fixées et perméabilisées avec un mélange acétone/alcool absolu et sondées avec un anticorps primaire anti-NS1 et un anticorps secondaire anti-lapin de chèvre conjugué Alexa Fluor 594 (cellules rouges infectées). Les noyaux cellulaires ont été colorés avec du DAPI (bleu) et des images confocales ont été acquises. Les encarts en haut à droite montrent une image agrandie des cellules hébergeant AaeDV, et la protéine AaeDV NS1 est située principalement dans le noyau des cellules C6/36. C Le pourcentage de cellules AaeDV-positives/négatives a été calculé par le logiciel ImageJ selon la figure B. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SD. n = 3

Comme le montre la figure 3A, des lysats de cellules infectées par AaeDV ont été collectés, suivis d'une surinfection par DENV-2 à 12, 24, 48, 72 et 96 hpi, sans différence significative dans les copies de DENV-2 entre les cellules surinfectées et un seul DENV. -2 cellules infectées (12 hpi, P = 0,442 ; 24 hpi, P = 0,768 ; 48 hpi, P = 0,374 ; 72 hpi, P = 0,643 ; 96 hpi, P = 0,065). Cependant, le niveau d'ARN du DENV-2 a légèrement augmenté par rapport aux traitements uniques d'infection par le DENV-2 à 120 hpi. À l'inverse, la réplication intracellulaire de l'AaeDV dans le traitement de superinfection n'a montré aucune différence significative par rapport à celle de la monoinfection de l'AaeDV à tout moment après la surinfection (12 hpi, P = 0,855 ; 24 hpi, P = 0,880 ; 48 hpi, P = 0,460 ; 72 hpi, P = 0,538 ; 96 hpi, P = 0,540 ; 120 hpi, P = 0,371) (Fig. 3B).

Caractéristiques de croissance de DENV-2 et AaeDV dans les traitements de monoinfection et de surinfection. Des échantillons d'ARN et d'ADN ont été préparés à partir de cellules et de surnageant de culture à différents moments après l'infection, et des tests qPCR ont été utilisés pour mesurer les niveaux d'ARN DENV-2 et d'ADN AaeDV. Niveaux intracellulaires de DENV-2 (A) et AaeDV (B) dans les traitements de monoinfection et de surinfection, respectivement. Les niveaux intracellulaires de DENV-2 et d'AaeDV ont été normalisés par rapport à l'ARNm de rps7 dans le même échantillon. Niveaux relatifs de DENV-2 (C) et AaeDV (D) dans le surnageant des traitements de monoinfection et de surinfection. Le niveau relatif à 12 hpi a été fixé à 1. Les données présentées proviennent d'une expérience représentative qui a été répétée trois fois avec des résultats similaires. Les barres d'erreur représentent l'écart-type

En revanche, le nombre de copies d'ARN du virus de la dengue dans le surnageant a été supprimé 120 h après la surinfection par le DENV-2 par rapport à la monoinfection par le DENV-2 (1,02 ± 0,05 et 1,25 ± 0,09). En revanche, le nombre de copies génomiques de l'AaeDV était significativement amélioré 48 h après la surinfection par le DENV-2 par rapport à la monoinfection par l'AaeDV, et l'effet promotionnel du DENV-2 sur la réplication de l'AaeDV augmentait avec le temps (48 hpi, 1,16 ± 0,06 et 1,00 ± 0,03 ; 72 hpi, 1,22 ± 0,05 et 0,97 ± 0,03 ; 96 hpi, 1,39 ± 0,10 et 1,05 ± 0,02 ; 120 hpi, 1,46 ± 0,09 et 1,04 ± 0,04). Dans l'ensemble, le niveau relatif du génome AaeDV a augmenté de près de 0, 42 fois dans le traitement de surinfection par rapport à la monoinfection AaeDV à 120 hpi (Fig. 3C et D).

Le signal fluorescent intracellulaire spécifique pour la glycoprotéine d'enveloppe DENV E2 dans les cellules C6 / 36 a diminué dans les cellules positives pour la glycoprotéine d'enveloppe DENV-2 E2 d'environ 38% et 63% à 96 hpi et 120 hpi, respectivement, par rapport au contrôle monoinfection . Cependant, un taux significativement accru de cellules avec des signaux spécifiques à AaeDV NS1 a été observé dans le traitement de surinfection (72 hpi, P = 0,015 ; 96 hpi, P = 0,007 ; 120 hpi, P = 0,001), ce qui suggère que l'infection par le DENV-2 a en effet favorisé la réplication de l'AaeDV dans les cellules C6/36 (Fig. 4A et C). De plus, l'imagerie confocale a montré la présence des protéines DENV-2 et AaeDV dans la même cellule dans moins de 2 % des cellules à 96 hpi et 120 hpi (Fig. 4B).

Imagerie par immunofluorescence de cellules C6/36 monoinfectées ou surinfectées par AaeDV et DENV-2. Des cellules A C6/36 ont été soumises à une infection par AaeDV puis surinfectées avec du DENV-2 pendant 12, 24, 48, 72, 96 et 120 h. Les traitements de monoinfection AaeDV et DENV-2 ont été utilisés comme témoins. Les cellules ont été fixées et perméabilisées avec un mélange acétone / alcool absolu aux points de temps respectifs après l'infection et immunocolorées pour DENV (vert, AF488) et AaeDV (rouge, AF594). Les images ont été capturées au microscope. Le DAPI a été utilisé pour colorer le noyau (bleu). B Les encarts en haut à droite montrent une image agrandie des cellules hébergeant les deux virus. L'histogramme CA présente le pourcentage de cellules C6/36 infectées par AaeDV et DENV en monoinfection par rapport à la surinfection. Les valeurs données sont la moyenne ± ET de trois répétitions indépendantes. *, P < 0,05 ; **, P < 0,01 ; ***, P < 0,001

Seules les femelles engorgées ont été utilisées pour la dissection de l'intestin moyen, des glandes salivaires et des tissus ovariens à 0, 5, 10 et 15 dpi après exposition au DENV-2. Jusqu'à 15 dpi, les moustiques adultes injectés avec AaeDV n'ont pas montré d'augmentation significative de la mortalité. À 0 dpi, les IR des moustiques étaient de 100 % dans les traitements de surinfection et de monoinfection, ce qui indique que tous les moustiques ont ingéré le repas de sang contenant du DENV-2 (Fig. 5C). Après la digestion du repas de sang infectieux, les IR d'Ae. albopictus ont été significativement réduites à 5 dpi par rapport à 0 dpi (z = 10,329, P = 0,001 ; z = 4,149, P = 0,0042 ; z = 4,565, P = 0,003) puis ont progressivement augmenté à 10 hpi et 15 dpi (Fig. 5C ). Cependant, il n'y avait aucune différence significative dans l'IR entre les moustiques surinfectés et monoinfectés à tout moment (5 dpi, P = 0, 774; 10 dpi, P = 0, 739; 15 dpi, P = 0, 685) (Fig. 5C). Chez les moustiques surinfectés, le DENV-2 a été diffusé dans les ovaires dès le contrôle monoinfecté, à 10 dpi. Les DR avaient tendance à diminuer légèrement à 10 dpi et 15 dpi ; cependant, le changement n'était pas significatif (10 dpi, P = 0,442 ; 15 dpi, P = 0,397) (Fig. 5D).

Sensibilité vectorielle d'Ae. albopictus infecté par voie orale avec DENV-2 chez des femelles adultes monoinfectées ou surinfectées. Un diagramme du flux de travail utilisé pour la détection de DENV-2 dans différents tissus d'Ae. albopictus. Les intestins moyens, les ovaires et les glandes salivaires des moustiques monoinfectés ou surinfectés ont été disséqués à 0, 5, 10 et 15 jours après l'infection et détectés par PCR. B Représentation schématique des événements qui se produisent après l'ingestion de repas de sang infecté par le DENV-2 jusqu'à la transmission ultérieure. Le virus infecte les cellules épithéliales de l'intestin moyen en traversant la barrière d'infection de l'intestin moyen ; le virus se propage ensuite à tous les organes, y compris l'ovaire et les glandes salivaires. L'infection des glandes salivaires est établie en traversant la barrière d'infection des glandes salivaires (SGIB). Taux d'infection de l'intestin moyen (MIR) = le nombre d'intestins infectés/le nombre d'intestins testés. Taux de dissémination (DR) = nombre d'ovaires infectés/nombre d'intestins positifs infectés. Taux d'infection des glandes salivaires (SGIR) = nombre de glandes salivaires infectées/nombre total de moustiques testés. C DENV-2 MIR chez les moustiques monoinfectés ou surinfectés. D DENV-2 DR chez les moustiques monoinfectés ou surinfectés. E DENV-2 SGIR chez les moustiques monoinfectés ou surinfectés. Les résultats proviennent de trois expériences indépendantes (n = 29–30 par groupe), et les barres d'erreur indiquent l'écart type

Le DENV-2 dans les glandes salivaires a été détecté pour la première fois à 10 dpi chez les femelles adultes monoinfectées et surinfectées, et le SGIR a augmenté progressivement au fil du temps (Fig. 5E). À 15 dpi, le SGIR dans le traitement de surinfection était significativement diminué de près de 0, 6 fois par rapport à celui du témoin monoinfecté (P = 0, 045) (Fig. 5E).

Les quantités de DENV-2 dans l'intestin moyen, les ovaires et les glandes salivaires d'Ae. albopictus ont ensuite été mesurés par qRT-PCR. L'AaeDV a également été évalué par qPCR dans l'intestin moyen, les ovaires et les glandes salivaires de tous les échantillons pour confirmer l'infection (Fig. 6 et fichier supplémentaire 6 : Fig. S3).

Nombre de copies du génome DENV-2 dans différents tissus d'Ae monoinfectés ou surinfectés. albopictus femelles adultes. Nombre de copies d'ARN DENV-2 dans les tissus positifs d'Ae. albopictus adultes a été quantifié par qRT‒PCR. Un Midguts ; ovaires B ; C glandes salivaires. Les lignes noires horizontales indiquent la valeur moyenne des nombres de copies d'ARN DENV-2 (log10) et les barres d'erreur indiquent l'écart type

Dans les traitements de monoinfection et de surinfection, les copies de DENV-2 (log10) dans l'intestin moyen ont nettement diminué de 0 (7,28 ± 0,12 et 7,35 ± 0,15) à 5 dpi (6,81 ± 0,34 et 6,93 ± 0,69), puis ont augmenté lentement au fil du temps. Le niveau de DENV-2 a culminé à 15 dpi (7,66 ± 0,77 et 7,62 ± 0,80). Cependant, les copies d'ARN de DENV-2 n'ont montré aucune différence significative entre les femelles adultes monoinfectées ou surinfectées à tous les moments examinés (0 dpi, P = 0,177 ; 5 dpi, P = 0,448 ; 10 dpi, P = 0,743 ; 15 dpi, P = 0,835) (figure 6A).

Dans les ovaires, le titrage viral des traitements de monoinfection et de surinfection est passé de 10 dpi (6,42 ± 0,90 et 6,37 ± 0,86) à 15 dpi (7,16 ± 0,36 et 6,84 ± 0,39), respectivement (Fig. 6B). Notamment, les copies d'ARN de DENV-2 dans les traitements de surinfection étaient significativement réduites par rapport à celles des traitements de monoinfection à 15 dpi (P = 0, 016) (Fig. 6B).

La tendance à la variation des copies d'ARN de DENV-2 dans les glandes salivaires était similaire à celle des ovaires (Fig. 6C). Les copies d'ARN de DENV-2 dans les glandes salivaires étaient plus élevées à 15 dpi qu'à 10 dpi dans les traitements de monoinfection, alors que les copies de DENV-2 dans les traitements de surinfection n'ont montré aucun changement significatif entre les deux points dans le temps (P = 0,708). De plus, les copies d'ARN de DENV-2 dans les traitements de surinfection ont été significativement supprimées par rapport à celles des traitements de monoinfection à 15 dpi (P = 0, 020) (Fig. 6C).

Les virus spécifiques aux insectes (ISV) sont un groupe diversifié qui infecte exclusivement les insectes hôtes et n'infecte pas les vertébrés [33]. La plupart des ISV de moustiques appartiennent aux Flaviviridae, tandis que d'autres sont inclus dans les familles Peribunyaviridae, Reoviridae, Birnaviridae et d'autres taxons [34], et ils jouent un rôle crucial dans le microbiome des moustiques en raison de leur large distribution et de leur gamme d'hôtes de moustiques [35,36 ,37,38]. Les virus transmis par les moustiques (MBV) sont des arbovirus qui peuvent être transmis entre les moustiques et les vertébrés, provoquant des maladies humaines telles que le virus Zika (ZIKV), le virus de la dengue (DENV), le virus du chikungunya (CHIKV) et les virus Mayaro (MAYV), conduisant à des problèmes de santé publique et des charges économiques importants dans le monde entier [39]. Étant donné que les ISV et les MBV infectent et se répliquent dans les moustiques vecteurs, l'interaction de la communauté microbienne entre les ISV et les MBV chez les moustiques est inévitable. L'influence des ISV sur les MBV, voire sur la compétence vectorielle des moustiques, devient sans aucun doute un sujet de recherche majeur dans les interactions hôte-pathogène-vecteur [40, 41].

Les schémas prévalents d'infections multiples d'ISV et de MBV se répartissent en deux grandes catégories : la co-infection et la surinfection. Cependant, si une co-infection ou une surinfection se produit, et quel mode d'infection séquentielle de surinfection est le plus fréquent dans les populations naturelles de moustiques reste incertain. En fait, il peut être basé sur la distribution géographique du flacon, le taux d'infection de la population de vecteurs, des facteurs écologiques et d'autres caractéristiques épidémiologiques connexes de l'hôte MBV.

Guangdong est une zone à haut risque pour la dengue en Chine. Des épidémies de dengue étaient signalées presque chaque année dans le Guangdong avant la pandémie mondiale de COVID-19, en particulier à Guangzhou, représentant plus de la moitié des cas de DENV en Chine continentale. Certaines études ont démontré qu'Ae. les moustiques albopictus sont des vecteurs compétents pour le DENV [42,43,44], maintenant théoriquement les épidémies de dengue autochtones dans la province du Guangdong. Peu d'études ont rapporté des Ae DENV-positifs. détection d'albopictus par RT-PCR lors de l'épidémie de dengue à Guangzhou [45]. De plus, aucun DENV n'a été isolé chez les moustiques dans la zone épidémique de Guangzhou. Les preuves à ce jour soutiennent également la théorie selon laquelle la dengue ne s'est pas encore développée en une maladie arbovirale endémique dans le Guangdong.

Pour les ISV et les MBV, de plus en plus de preuves émergent que les interactions entre les ISV et les MBV et les communautés virales complexes ont un impact significatif sur la biologie des vecteurs et même sur la compétence potentielle des vecteurs dans le maintien et la transmission des MBV. La coinfection et la surinfection des ISV et MBV sont étudiées in vitro et in vivo depuis de nombreuses années, et des relations d'interaction ont également été observées entre certains ISV et MBV. Bien que les ISV soient largement distribués et persistent dans les populations naturelles de moustiques, les MBV n'ont pas encore été détectés comme persistant de manière significative dans les populations de moustiques sauvages dans certaines régions, comme dans le Guangdong. Par conséquent, la recherche actuelle se concentre davantage sur la surinfection par le MBV dans les cellules persistantes ISV et les moustiques. Par exemple, le densovirus Anopheles gambiae (AgDV) a un impact négatif sur l'infection par le virus Mayaro à la fois chez An. gambiae et les moustiques [27]. Le virus de l'agent de fusion cellulaire (CFAV) réduit la dissémination du DENV-1 et du ZIKV chez Ae. aegypti [46]. Le flavivirus Culex persistant (CxFV) peut inhiber la réplication du VNO chez Cx. pipiens [47] et suppriment également le titre de DENV-1 et de ZIKV dans les tissus de la tête d'Ae. aegypti [46], entraînant une diminution de la dissémination du MBV chez les moustiques. La surinfection du virus Espirito Santo (ESV) par le DENV supprime la réplication du DENV-2 et entrave la compétence vectorielle d'Ae. aegypti pour DENV-2 [48]. La présence du virus de type Phasi Charoen (PCLV) entraîne une interférence avec la croissance du ZIKV chez Ae. aegypti cellules Aag2 [49]. Il a été démontré que l'infection par un flavivirus spécifique à un insecte, le virus Nhumirim (NHUV), limite l'infection et la transmission du ZIKV chez Ae. aegypti [50]. Un alphavirus spécifique aux insectes, le virus Eilat (EILV), présente des interférences homologues et hétérologues contre le virus Sindbis (SINV), le virus de l'encéphalite équine vénézuélienne (VEEV), le virus de l'encéphalite équine orientale (EEEV), le virus de l'encéphalite équine occidentale (WEEV) et le CHIKV dans Ae. albopictus C7/10 et retarde la dissémination du CHIKV chez Ae. aegypti [51].

Les MDV sont des parvovirus spécifiques aux moustiques. En tant que type d'ISV avec une gamme d'hôtes très étroite, la prévalence des MDV dans les populations naturelles doit encore être largement explorée, en particulier dans les régions d'endémie MBV, ce qui jettera les bases d'une analyse plus approfondie des interférences hétérologues plus proche des situations environnementales réelles. . Notre étude donne un bref aperçu des MDV chez les moustiques de terrain en Chine par l'analyse des données NGS, et les résultats ont montré que les MDV sont relativement largement distribués dans les populations de moustiques sauvages de cinq PLAD, y compris Ae. albopictus, Cx. pipiens, Cx. tritaeniorhyncus et An. siniens. Nous nous sommes ensuite concentrés sur la détection plus poussée du MDV chez Ae. albopictus à Guangzhou par la méthode PCR traditionnelle, et les résultats ont indiqué un taux étonnamment élevé de positivité du MDV dans la population sauvage de Guangzhou. En effet, le taux de positivité du MDV dans les populations des trois habitats différents dépassait 65 %, un taux supérieur à celui rapporté précédemment [52]. Par conséquent, nos recherches se sont concentrées sur la surinfection par le DENV chez Ae. cellules albopictus et adultes avec des MDV persistants. In vitro, des cellules C6/36 persistantes AaeDV ont été surinfectées avec DENV-2, et le nombre de copies de gènes a été quantifié à la fois dans les culots cellulaires et les surnageants à différents moments. Pour DENV-2, bien qu'aucune différence significative n'ait été observée à la plupart des moments, une diminution du niveau d'ARN de DENV-2 dans les cellules de monoinfection DENV-2 a été observée à 120 hpi. Dans le traitement de surinfection, les copies d'ARN de DENV-2 ont été augmentées dans les cellules mais diminuées dans le surnageant. Par conséquent, nous avons en outre déterminé le pourcentage de cellules positives pour le virus par IFA, et les cellules positives pour la glycoprotéine d'enveloppe DENV-2 E2 ont été relativement diminuées d'environ 38 % et 63 % à 96 hpi et 120 hpi, respectivement. Les mécanismes de ce phénomène restent inconnus. Nous ne pouvons pas exclure que les cellules négatives pour la glycoprotéine d'enveloppe DENV-2 E2 n'aient pas été infectées, compte tenu de la possibilité qu'elles ne contenaient que du matériel génomique viral, mais les résultats ont indiqué que l'infection par AaeDV n'a peut-être pas affecté de manière significative la réplication de DENV-2 dans les cellules mais a plutôt influencé la traduction. de DENV-2, entraînant une diminution des copies de DENV dans le surnageant et du pourcentage de cellules positives pour la glycoprotéine d'enveloppe DENV-2 E2. Compte tenu des études in vivo qui récapitulent étroitement les paramètres de transmission naturels du MBV, nous avons en outre déterminé l'impact de l'infection par AaeDV sur la compétence vectorielle d'Ae. albopictus adultes pour DENV-2. Le SIE a évidemment été observé in vivo, et le taux d'infection des glandes salivaires a été significativement diminué chez les moustiques surinfectés. Cependant, le taux d'infection des glandes salivaires ne reflète pas nécessairement les changements de transmission puisque le virus dans les glandes salivaires n'est pas directement corrélé à celui de la salive [53]. De plus, la réduction du nombre de copies du génome SIG et DENV-2 dans les ovaires et les glandes salivaires indique une sensibilité et une compétence vectorielle altérées au DENV-2 chez Ae. albopictus. Des preuves supplémentaires sont nécessaires pour déterminer si cette réduction de la réplication de DENV-2 chez le moustique entraîne une diminution de sa transmission.

Nos résultats fournissent la preuve que l'interférence hétérologue du MDV affecte la compétence du moustique vecteur pour le DENV. Des investigations supplémentaires sont nécessaires pour déterminer si la réduction de la réplication du DENV-2 et le taux positif dans les glandes salivaires conduiront finalement à une diminution de la transmission du DENV-2. De plus, il est crucial de clarifier le mécanisme sous-jacent et de concilier les observations cohérentes et contradictoires fournies par différentes équipes de recherche [54,55,56,57], qui peuvent refléter la grande variété de lignées cellulaires, d'espèces de moustiques, de souches géographiques, de fonds génétiques. , les souches virales et les méthodes expérimentales. En fin de compte, ces données démontrent les interactions complexes qui se produisent lorsque le MDV et le DENV partagent le même hôte vecteur, améliorent les stratégies proposées pour le développement des MDV en tant qu'agents de lutte biologique contre les MBV et indiquent un nouvel outil potentiel pour le contrôle des maladies transmises par les moustiques.

Bien que la présente étude fournisse des preuves que l'infection par l'AaeDV peut avoir un impact sur la sensibilité des moustiques vecteurs au DENV-2 à la fois in vitro et in vivo. Cependant, il est important de reconnaître que les résultats obtenus peuvent être limités par la population particulière de moustiques et l'isolat de virus utilisé dans les expériences.

Le MDV est largement présent dans les populations naturelles de moustiques et la réplication de DENV-2 est supprimée chez les Ae infectés par le MDV. albopictus, réduisant ainsi la sensibilité du vecteur au DENV-2. Notre étude soutient l'hypothèse selon laquelle le MDV peut contribuer à réduire la transmission du DENV et fournit une stratégie alternative pour le contrôle des maladies transmises par les moustiques.

Les données utilisées dans cette étude sont disponibles, si nécessaire ; veuillez contacter le premier auteur (LK) ou l'auteur correspondant (JBG).

Virus de la dengue

Densovirus du moustique

Densovirus Aedes aegypti

Dose infectieuse médiane en culture tissulaire

Au dessus du niveau de la mer

Solution saline tamponnée au phosphate

Test d'immunofluorescence indirecte

Sérum bovin fœtal

Réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse

Réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse quantitative

Acide ribonucléique

Acide désoxyribonucléique complémentaire

Protéine non structurale 1

Institut commémoratif du parc Roswell

Virus spécifiques aux insectes

Carlson J, Suchman E, Buchatsky L. Densovirus pour le contrôle et la manipulation génétique des moustiques. Adv Virus Res. 2006;68:361–92.

Article CAS PubMed Google Scholar

Morais P, Trovão NS, Abecasis AB, Parreira R. Virus spécifiques aux insectes de la famille des Parvoviridae : caractérisation de la lignée génétique et dynamique spatio-temporelle du genre Brevihamaparvovirus récemment établi. Virus Rés. 2022;313 : 198728.

Article CAS PubMed Google Scholar

Lefkowitz EJ, Dempsey DM, Hendrickson RC, Orton RJ, Siddell SG, Smith DB. Taxonomie des virus : la base de données du Comité international de taxonomie des virus (ICTV). Nucleic Acids Res. 2018;46:D708–17.

Article CAS PubMed Google Scholar

Lebedeva O, Zelenko A, Kuznetsova M. La détection de l'infection virale chez les larves d'Aedes aegypti. Mikrobiol Zh. 1972;34:70–3.

CAS PubMed Google Scholar

Johnson RM, Rasgon JL. Virus de la densonucléose («densovirus») pour le contrôle des moustiques et des agents pathogènes. Curr Opin Insect Sci. 2018;28:90–7.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Li J, Dong Y, Sun Y, Lai Z, Zhao Y, Liu P, et al. Un nouveau densovirus isolé du moustique tigre asiatique présente une pathogénicité variée selon son espèce hôte. Microbiol avant. 2019;10:1549.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Gu JB, Dong YQ, Peng HJ, Chen XG. Un AeDNA recombinant contenant la toxine spécifique de l'insecte, BmK IT1, a montré une pathogénicité croissante sur Aedes albopictus. Am J Trop Med Hyg. 2010;83:614.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gu J, Liu M, Deng Y, Peng H, Chen X. Développement d'un système efficace d'interférence ARN médiée par un densovirus de moustique recombinant et son application préliminaire dans la lutte contre les moustiques. PLoS ONE. 2011;6 : e21329.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu P, Li X, Gu J, Dong Y, Liu Y, Santhosh P, et al. Développement de vecteurs de densovirus recombinants non défectueux pour la délivrance de microARN chez le moustique vecteur invasif, Aedes albopictus. Sci Rep. 2016;6:1–13.

Google Scholar

Altinli M, Soms J, Ravallec M, Justy F, Bonneau M, Weill M, et al. Partage de cellules avec Wolbachia : la transmission verticale transovarienne du densovirus Culex pipiens. Environ Microbiol. 2019;21:3284–98.

Article CAS Google Scholar

Barik TK, Suzuki Y, Rasgon JL. Facteurs influençant l'infection et la transmission du densovirus d'Anopheles gambiae (AgDNV) chez les moustiques. Peer J. 2016;4 : e2691.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Rwegoshora RT, Baisley KJ, Kittayapong P. Variation saisonnière et spatiale de l'infection naturelle à densovirus chez Anohheles minimus sl en Thaïlande. Santé publique J Trop Med en Asie du Sud-Est. 2000 ;31 : 3–9.

CAS PubMed Google Scholar

Kittayapong P, Baisley KJ, O'Neill SL. Un densovirus de moustique infectant Aedes aegypti et Aedes albopictus de Thaïlande. Am J Trop Med Hyg. 2001;61:612–7.

Article Google Scholar

Altinli M, Lequime S, Courcelle M, François S, Justy F, Gosselin-Grenet AS, et al. Évolution et phylogéographie du densovirus Culex pipiens. Virus Évol. 2019;5:vez053.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Simmons CP, Farrar JJ, van Vinh CN, Wills B. Dengue. N Engl J Méd. 2012;366:1423–32.

Article CAS PubMed Google Scholar

[ PubMed ] Bhatt S, Gething PW, Brady OJ, Messina JP, Farlow AW, Moyes CL, et al. La distribution mondiale et le fardeau de la dengue. Nature. 2013;496:504–7.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cui F, Huang X, Tian L, Li S, Liang C, Zeng L, et al. Dengue et virus de la dengue dans le Guangdong, Chine, 1978-2017 : épidémiologie, séroprévalence, évolution et politiques. Front Med (Lausanne). 2022;9 : 797674.

Article PubMed Google Scholar

Zhang L, Zhao L, Zhang Z, Hong W, Wang J, Qiu S, et al. Diversité génétique et pathogénicité des souches du virus de la dengue de type 2 circulant dans le Guangdong, en Chine. Biosaf Santé. 2021;3:333–42.

Article Google Scholar

Krueger F : Garniture à gogo. Un outil wrapper autour de Cutadapt et FastQC pour appliquer de manière cohérente la qualité et le découpage de l'adaptateur aux fichiers FastQ. Babraham Bioinformer. 2015. https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/. Consulté le 7 mai 2022.

Langmead B, Salzberg SL. Alignement à lecture rapide avec Bowtie 2. Méthodes Nat. 2012;9:357–9.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jiang L, Wu X, Wu Y, Bai Z, Jing Q, Luo L, et al. Étude épidémiologique et virologique moléculaire des infections par le virus de la dengue à Guangzhou, en Chine, de 2001 à 2010. Virol J. 2013;10:1–9.

Article CAS Google Scholar

Afanasiev BN, Kozlov YV, Carlson JO, Beaty BJ. Densovirus d'Aedes aegypti comme vecteur d'expression dans les cellules de moustique. Exp Parasitol. 1994;79:322–39.

Article CAS PubMed Google Scholar

Reed LJ, Muench H. Une méthode simple d'estimation des paramètres à cinquante pour cent. Suis J Epidemiol. 1938;27:493–7.

Article Google Scholar

Liu PW, Xu JB, Dong YQ, Chen XG, Gu JB. Utilisation d'un densovirus de moustique recombinant comme vecteur de délivrance de gènes pour l'analyse fonctionnelle de gènes dans des larves de moustiques. J Vis Exp. 2017;128 : e56121.

Google Scholar

Moreira LA, Iturbe-Ormaetxe I, Jeffery JA, Lu G, Pyke AT, Hedges LM, et al. Un symbiote Wolbachia chez Aedes aegypti limite l'infection par la dengue, le chikungunya et Plasmodium. Cellule. 2009;139:1268–78.

Article PubMed Google Scholar

Pujhari S, Brustolin M, Macias VM, Nissly RH, Nomura M, Kuchipudi SV, et al. La protéine de choc thermique 70 (Hsp70) médie l'entrée, la réplication et la sortie du virus Zika des cellules hôtes. Les microbes émergents infectent. 2019;8:8–16.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Urakova N, Brustolin M, Joseph RE, Johnson RM, Pujhari S, Rasgon JL. Le densovirus Anopheles gambiae (AgDNV) affecte négativement l'infection par le virus Mayaro dans les cellules et les moustiques d'Anopheles gambiae. Vecteurs parasites. 2020;13:1–6.

Article Google Scholar

Li X, Jin B, Dong Y, Chen X, Tu Z, Gu J. Deux des trois gènes transformateur-2 sont nécessaires au développement ovarien chez Aedes albopictus. Insect Biochem Mol Biol. 2019;109:92–105.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wells P, Vale T, Russell R, Cloonan M. Comparaison d'une technique de gage avec d'autres méthodes d'alimentation sanguine des moustiques (Diptera : Culicidae) pour les études virales. Aust J. Entomol. 1994;33:211–2.

Article Google Scholar

Liu Z, Zhang Z, Lai Z, Zhou T, Jia Z, Gu J, et al. L'augmentation de la température améliore la capacité d'Aedes albopictus à transmettre le virus de la dengue. Microbiol avant. 2017;8:2337.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Deng J, Guo Y, Su X, Liu S, Yang W, Wu Y, et al. Impact de la résistance à la deltaméthrine chez Aedes albopictus sur son coût de fitness et sa compétence vectorielle. PLoS Negl Trop Dis. 2021;15 : e0009391.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang W, Zhao S, Xie Y, Liu T, Kong L, Guo Y, et al. Armigeres subalbatus est un vecteur potentiel du virus Zika mais pas du virus de la dengue. Infect Dis Pauvreté. 2022;11:1–9.

Article Google Scholar

Agboli E, Leggewie M, Altinli M, Schnettler E. Virus spécifiques aux moustiques - transmission et interaction. Virus. 2019;11:873.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bolling BG, Weaver SC, Tesh RB, Vasilakis N. Découverte de virus spécifiques aux insectes : importance pour la communauté des arbovirus. Virus. 2015;7:4911–28.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Carvalho VL, Long MT. Virus spécifiques aux insectes : un aperçu et leur relation avec les arbovirus préoccupants pour les humains et les animaux. Virologie. 2021;557:34–43.

Article CAS PubMed Google Scholar

Altinli M, Schnettler E, Sicard M. Interactions symbiotiques entre les moustiques et les virus des moustiques. Front Cell Infect Microbiol. 2021;11 : 694020.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Altinli M, Lequime S, Atyame C, Justy F, Weill M, Sicard M. Wolbachia module la prévalence et la charge virale des densovirus Culex pipiens dans les populations naturelles. Mol Écol. 2020;29:4000–13.

Article PubMed Google Scholar

Parry R, Bishop C, De Hayr L, Asgari S. La réplication améliorée dépendante de la densité d'un densovirus dans les cellules Aedes infectées par Wolbachia est associée à la production de piARN et de siARN dérivés de virus supérieurs. Virologie. 2019;528:89–100.

Article CAS PubMed Google Scholar

Schneider CA, Calvo E, Peterson KE. Arbovirus : comment la salive affecte le voyage du vecteur à l'hôte. Int J Mol Sci. 2021;22:9173.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Carvalho VL, Long MT. Perspectives sur de nouveaux vaccins contre les arbovirus utilisant des virus spécifiques d'insectes comme plateformes. Vaccins (Bâle). 2021;9:263.

Article CAS PubMed Google Scholar

Öhlund P, Lundén H, Blomström AL. Évolution du virus spécifique aux insectes et effets potentiels sur la compétence vectorielle. Gènes viraux. 2019 ; 55 : 127–37.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu S, He Y, Wei Y, Fan P, Ni W, Zhong D, et al. Effets du changement climatique saisonnier de Guangzhou sur le développement d'Aedes albopictus et sa sensibilité au DENV-2. PLoS ONE. 2022;17 : e0266128.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen Y, Gao J, Yang L, Li C, Chen R, Xie Z, et al. Une souche endémique prédominante du virus de la dengue-1 et la compétence vectorielle d'Aedes albopictus de la ville de Guangzhou, en Chine. Acta Trop. 2019;199 : 104975.

Article CAS PubMed Google Scholar

Wei Y, Wang J, Wei YH, Song Z, Hu K, Chen Y, et al. Compétence vectorielle pour DENV-2 parmi les populations d'Aedes albopictus (Diptera : Culicidae) en Chine. Front Cell Infect Microbiol. 2021;11 : 649975.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li C, Jiang Y, Hu Z. Détection du virus de la dengue chez Aedes albopictus à Guangzhou. J Trop Méd. 2008;8:1128–9.

Google Scholar

Baidaliuk A, Miot EF, Lequime S, Moltini-Conclois I, Delaigue F, Dabo S, et al. Le virus de l'agent de fusion cellulaire réduit la dissémination des arbovirus chez les moustiques Aedes aegypti in vivo. J Virol. 2019;93:e00705-e719.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bolling BG, Olea-Popelka FJ, Eisen L, Moore CG, Blair CD. Dynamique de transmission d'un flavivirus spécifique d'un insecte dans une colonie de laboratoire de Culex pipiens naturellement infectée et effets de la co-infection sur la compétence vectorielle pour le virus du Nil occidental. Virologie. 2012 ;427 : 90–7.

Article CAS PubMed Google Scholar

Blanc AV, Fan M, Mazzara JM, Roper RL, Richards SL. Virus infectant les moustiques Le virus Espirito Santo inhibe la réplication et la propagation du virus de la dengue. J Med Virol. 2021;93:3362–73.

Article CAS PubMed Google Scholar

Schultz MJ, Frydman HM, Connor JH. L'infection virale spécifique à l'insecte double limite la réplication de l'arbovirus dans les cellules du moustique Aedes. Virologie. 2018 ;518 : 406–13.

Article CAS PubMed Google Scholar

Romo H, Kenney JL, Blitvich BJ, Brault AC. Restriction de l'infection et de la transmission du virus Zika chez Aedes aegypti par l'intermédiaire d'un flavivirus spécifique à un insecte. Les microbes émergents infectent. 2018;7:1–13.

Article Google Scholar

Nasar F, Erasmus JH, Haddow AD, Tesh RB, Weaver SC. Le virus d'Eilat induit à la fois des interférences homologues et hétérologues. Virologie. 2015 ;484 : 51–8.

Article CAS PubMed Google Scholar

Du J, Li F, Han Y, Fu S, Liu B, Shao N, et al. Caractérisation des viromes au sein des espèces de moustiques en Chine. Sci Chine Vie Sci. 2020;63:1089–92.

Article PubMed Google Scholar

Sanchez-Vargas I, Olson KE, Black WC IV. La base génétique des barrières des glandes salivaires à la transmission des arbovirus. Insectes. 2021;12:73.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Kanthong N, Khemnu N, Sriurairatana S, Pattanakitsakul SN, Malasit P, Flegel TW. Les cellules de moustique accueillent des co-infections équilibrées et persistantes avec un densovirus et le virus de la dengue. Dev Comp Immunol. 2008;32:1063–75.

Article CAS PubMed Google Scholar

Wei W, Shao D, Huang X, Li J, Chen H, Zhang Q, et al. La pathogénicité du densovirus du moustique (C6/36DNV) et son interaction avec le virus de la dengue de type II chez Aedes albopictus. Am J Trop Med Hyg. 2006;75:1118–26.

Article PubMed Google Scholar

Sivaram A, Barde PV, Gokhale MD, Singh DK, Mourya DT. Preuve de co-infection par les virus du chikungunya et de la densonucléose dans les lignées cellulaires C6/36 et les moustiques Aedes aegypti (L.) infectés en laboratoire. Vecteurs parasites. 2010;3:1–8.

Article Google Scholar

Burivong P, Pattanakitsakul SN, Thongrungkiat S, Malasit P, Flegel TW. Sévérité nettement réduite de l'infection par le virus de la dengue dans les cultures de cellules de moustiques infectées de manière persistante par le densovirus d'Aedes albopictus (AalDNV). Virologie. 2004;329:261–9.

Article CAS PubMed Google Scholar

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Les auteurs tiennent à remercier leurs collègues de la Southern Medical University qui ont fourni des conseils, des expériences et un soutien précieux.

Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (81871688) à JB.G., le National Key Research and Development Program of China (2020YFC1200100) à XGC., la National Natural Science Foundation of China (82002167 ) à PW.L.

Guangdong Provincial Key Laboratory of Tropical Disease Research, Department of Pathogen Biology, School of Public Health, Southern Medical University, Guangzhou, 510515, Guangdong, Chine

Ling Kong, Jie Xiao, Lu Yang, Peiwen Liu, Xiao-Guang Chen et Jinbao Gu

Brown School, Université de Washington, St. Louis, MO, 63130, États-Unis

Yuan Sui

Institut national des maladies parasitaires, Centre chinois de contrôle et de prévention des maladies, Shanghai, 200025, Chine

Duoquan Wang

Shenzhen Aiming Pest Control Operation Service Company Limited, Shenzhen, Guangdong, Chine

Shaoqiang Chen

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Tous les auteurs ont contribué de manière significative à cette étude. JG, XC, PL, LK, JX, DW et SC ont conçu l'étude et coordonné sa mise en œuvre. LK et JX ont réalisé les expériences. PL a analysé les données. JG, PL, LK et LY ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Peiwen Liu, Xiao-Guang Chen ou Jinbao Gu.

N'est pas applicable.

Les auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent.

: Tableau S1. Ensembles de données de séquençage Illumina de moustiques capturés sur le terrain utilisés dans l'analyse de la prévalence du densovirus des moustiques.

: Tableau S2. Numéro d'accession de la référence du densovirus du moustique.

: Tableau S3. Amorces utilisées dans l'étude.

: Figure S1. Infection à densovirus par les moustiques dans les populations naturelles de moustiques. Les taux positifs de densovirus de moustiques de lectures de données métagénomiques de moustiques sur le terrain provenant de cinq divisions administratives de niveau provincial. NX, Région autonome du Ningxia Hui ; SX, province du Shanxi ; GS, province du Gansu ; YN, province du Yunnan ; GD, province du Guangdong. Taux positif de MDV dans les populations naturelles de moustiques à Guangzhou. La région de Guangzhou est indiquée en jaune clair sur la carte de la Chine. L'encart zoomé montre un grossissement de la région de Guangzhou, et différentes couleurs indiquent les différents quartiers de Guangzhou. Les points indiquent les emplacements des sites de collecte de moustiques. Les diagrammes circulaires de la figure montrent le taux de positivité du MDV dans les populations naturelles de moustiques à chaque site de collecte. La couche de base de cette carte modifiée provient du National Earth System Science Data Center, National Science & Technology Infrastructure of China.

: Figure S2. Détection des taux positifs de MDV dans les populations naturelles de moustiques à Guangzhou.

: Figure S3. Copies d'ADN de l'AaeDV dans l'intestin moyen, les ovaires et la glande salivaire d'Aedes albopictus infecté par l'AaeDV à différents jours après l'infection.

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Réimpressions et autorisations

Kong, L., Xiao, J., Yang, L. et al. Le densovirus du moustique réduit significativement la sensibilité du vecteur au virus de la dengue de sérotype 2 chez les moustiques Aedes albopictus (Diptera : Culicidae). Infect Dis Poverty 12, 48 (2023). https://doi.org/10.1186/s40249-023-01099-8

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Reçu : 11 novembre 2022

Accepté : 28 avril 2023

Publié: 09 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1186/s40249-023-01099-8

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