Régulation du probiotique viable/inactivé/lysé Lactobacillus plantarum H6 sur le microbiote intestinal et les métabolites chez la souris hypercholestérolémique

npj Science of Food volume 6, Article number: 50 (2022) Citer cet article

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Les preuves suggèrent que les interventions probiotiques réduisent le risque de maladies non transmissibles (MNT). Cependant, son effet thérapeutique et son mécanisme ne sont pas encore clairs. Pour évaluer l'effet hypocholestérolémiant de Lactobacillus plantarum H6 (Lp H6), une nouvelle souche brevetée commerciale capable de prévenir l'hypercholestérolémie, et son mécanisme en profondeur, trois états de la souche ont été préparés, à savoir, viable (vH6), inactivé par la chaleur (iH6 ) et des cellules bactériennes lysées par ultrasons (uH6). Les résultats ont montré que les cellules v/i/uH6 pouvaient abaisser les taux de lipides sanguins sériques et hépatiques, atténuer les dommages au foie et améliorer les indices de test de tolérance au glucose (GTT) et de test de tolérance à l'insuline (ITT). Les cellules v/i/uH6 ont amélioré la composition microbienne de l'intestin et réduit significativement le rapport Firmicutes à Bacteroidetes (rapport F/B) dans les matières fécales. En particulier, Muribaculaceae peut être un biomarqueur potentiel pour une réduction efficace du cholestérol. En outre, la récupération de ces indices biochimiques et du microbiome intestinal a été constatée après une transplantation de microbiote fécal (FMT) à l'aide de selles de souris traitées avec vH6. Les cellules v/i/uH6 ont augmenté le métabolisme de la flore intestinale des vitamines-cofacteurs, ainsi que des acides aminés, tout en diminuant la teneur relative en acides biliaires primaires. L'analyse de corrélation de Pearson a montré que norank_f__Muribaculaceae et Lactobacillus avaient une corrélation négative avec les taux de lipides sanguins. Dans l'ensemble, les cellules v/i/uH6 ont été efficaces pour améliorer l'hypercholestérolémie chez la souris, et cet effet a été attribué en partie à la régulation du microbiote intestinal et des métabolites liés au métabolisme des lipides. Nos découvertes ont fourni une base théorique pour le développement industriel de probiotiques et de postbiotiques et le traitement des maladies liées au cholestérol.

Le taux de cholestérol dans le corps humain joue un rôle vital dans la cellule et le fonctionnement normaux, mais des niveaux excessifs peuvent entraîner des problèmes de métabolisme des lipides et augmenter le risque de maladies non transmissibles (MNT), telles que les maladies cardiovasculaires (MCV), la stéatohépatite non alcoolique (NASH) , l'obésité, et ainsi de suite1. Selon les statistiques sanitaires mondiales en 2021, les maladies cardiovasculaires restent la principale cause de décès par MNT, en particulier dans les pays en développement à faible revenu2. Alors, comment maintenir efficacement un taux de cholestérol normal est un enjeu de santé publique important. Les statines et les fibrates sont les médicaments hypocholestérolémiants les plus couramment utilisés, mais une utilisation à long terme peut entraîner des effets secondaires graves, notamment une augmentation du risque de rhabdomyolyse, de syndrome allergique et de troubles cognitifs3.

Depuis quelques années, l'effet hypocholestérolémiant des probiotiques attire l'attention des chercheurs4. Par rapport à la pharmacothérapie, ses caractéristiques d'efficacité, de sécurité et d'économie élevées ont été privilégiées par les consommateurs. Des études ont montré que Lactobacillus plantarum NCU116 peut également réguler efficacement le métabolisme des lipides chez les rats hyperlipidémiques, suffisamment pour réduire les niveaux de cholestérol total (TC) chez les rats hyperlipidémiques, et a le potentiel de réguler le métabolisme des lipides, la morphologie du foie et du tissu adipeux5. Lacticaseibacillus casei vivant et inactivé par ultrasons a été capable de réduire les niveaux de TC et de contrôler la résistance à l'insuline chez les rats mâles nourris avec un régime riche en graisses6. Les probiotiques peuvent réduire le cholestérol en régulant le microbiote intestinal et ses métabolites7. La modification du microbiote intestinal, connu sous le nom de "second cerveau" du corps humain, peut affecter l'homéostasie énergétique, l'inflammation systémique, le métabolisme des lipides, l'équilibre glycémique et la sensibilité à l'insuline de l'hôte8. De plus, la richesse et la diversité du microbiote intestinal, notamment le ratio Firmicutes/Bacteroidetes (ratio F/B)9, peuvent être significativement améliorées par la prise de probiotiques. L'utilisation de la transplantation de microbiote fécal (FMT) a montré que la régulation du microbiote intestinal peut traiter efficacement le syndrome métabolique10.

À l'heure actuelle, de nombreux produits probiotiques ont été développés pour réguler le cholestérol, mais tous se concentrent sur des bactéries vivantes pour empêcher le cholestérol de monter. De plus, certaines études ont montré que les bactéries mortes et leurs métabolites, appelés "postbiotiques"11,12, peuvent encore avoir une activité physiologique13. Auparavant, notre équipe a identifié une souche probiotique Lactobacillus plantarum H6 (Lp H6, CGMCC 18205, Brevet n° ZL 201910955071. X) avec une bonne tolérance dans le tube digestif. La souche H6 a été transformée en produit de base. La capacité d'élimination du cholestérol in vitro de H6 a atteint 92,07 %, et des tests sur des animaux ont montré qu'il peut améliorer efficacement la dysbiose du microbiote intestinal et les dommages au foie causés par un régime riche en cholestérol14. Dans cette étude, l'effet régulateur de la Lp H6 viable, inactivée et lysée par ultrasons sur le cholestérol et son influence sur le microbiote intestinal ont été évalués, et les effets thérapeutiques de la Lp H6 sur des souris hypercholestérolémiques ont été systématiquement étudiés, ce qui a fourni une base théorique pour l'industrie. le développement de probiotiques et le traitement des maladies liées au cholestérol.

Comparé au groupe ND, le groupe HCD n'avait aucune différence significative dans l'apport alimentaire et le gain de poids (Fig. 1a supplémentaire), tandis que le TC et les triglycérides (TG) dans le sérum et le foie des souris du groupe HCD ont augmenté de manière significative, et le contenu était d'environ 2 à 3 fois celle du groupe ND (Fig. 1a), ce qui indique que le modèle de souris hypercholestérolémique a été établi avec succès.

a Taux sériques de TC et de TG et de foie de TC et de TG chez des souris modèles d'hypercholestérolémie. Les données sont représentées par la moyenne ± SEM (n = 6). ***P < 0,001, ****P < 0,0001 vs contrôle ND. b Taux sériques de TC, TG, LDL-C, cholestérol à lipoprotéines de haute densité (HDL-C), ALT et AST après 12 semaines. c Poids du foie, niveaux de TC et de TG. Les données sont représentées par la moyenne ± SEM (n = 8). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 vs témoin HCD_ND ; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs contrôle FMT1. HCD_ND fait référence au groupe de souris modèles d'hypercholestérolémie ; v/i/uH6 fait référence à des cellules bactériennes viables (vH6), inactivées par la chaleur (iH6) et lysées par ultrasons (uH6); FMT1/2/3 fait référence à l'utilisation des matières fécales des groupes HCD_ND, Sim et vH6, respectivement.

Par rapport au groupe HCD_ND, après 12 semaines de traitement avec v/i/uH6 et FMT3, les index physico-chimiques liés au métabolisme des lipides dans le sérum de souris ont été améliorés (Fig. 1b), le TC a été significativement diminué, en particulier le TC sérique dans le FMT3 groupe, qui a diminué de 43,98 % (P < 0,05). Les taux sériques de TG des souris ayant reçu vH6 et FMT3 ont été significativement diminués de 18,69 % et 17,17 %, respectivement (P < 0,05). Par rapport au groupe HCD, les taux de cholestérol à lipoprotéines de basse densité (LDL-C) étaient significativement plus faibles lorsqu'ils recevaient vH6, uH6 et FMT3 (0,18 à 0,34 mmol/L contre 1,5 mmoL). De plus, v/i/uH6 et FMT3 ont considérablement réduit les taux sériques d'alanine aminotransférase (ALT) des souris, en particulier celles ayant reçu vH6 et iH6 (10,76 U/L et 11,58 U/L, respectivement). vH6 et FMT3 ont significativement diminué les taux sériques d'aspartate aminotransférase (AST) (P < 0,05).

v / i / uH6 et FMT3 ont également amélioré le poids du foie, les teneurs en TC et TG (à l'exception de iH6) des souris (Fig. 1c). Par exemple, lorsqu'on leur a donné vH6 et iH6, le poids du foie a diminué de 21,27 % et 22,10 %, respectivement (P < 0,05). v/i/uH6 a diminué le TC de 30,44 %, 24,49 % et 35,67 %, respectivement (P < 0,05). Dans l'ensemble, v/i/uH6 et FMT3 ont amélioré les propriétés physicochimiques du sérum et du foie, y compris une diminution des TC, TG, LDL-C, ALT, AST dans le sérum et TC, TG dans le foie à différents niveaux.

Les souris nourries avec HCD ont montré une hépatomégalie avec une teinte jaune grisâtre. Cependant, v/i/uH6 et FMT3 ont inhibé l'hépatomégalie, la couleur (brun rougeâtre) et la texture molle du foie étaient proches de la normale. (Fig. 2a). La coloration HE a montré que dans le groupe HCD, la disposition des cellules hépatiques était lâche et désordonnée, un grand nombre de vacuoles graisseuses de tailles et de nombres différents apparaissaient, les cellules hépatiques étaient hypertrophiées, partiellement nécrotiques et les cellules hépatiques étaient gravement endommagées. (Fig. 2b). Lorsque les souris ont été traitées avec v/i/uH6 et FMT3, les dommages aux cellules hépatiques ont évidemment été réduits, les gouttelettes de graisse dans le cytoplasme ont été réduites et les cellules hépatiques ont été bien rangées.

a Images de foies de souris après différents traitements. b, c Images représentatives de la coloration H/E et de la coloration Oil Red O de coupes de foie (400 ×, barre d'échelle = 50 μm). Certaines parties endommagées locales des hépatocytes sont indiquées par des flèches jaunes dans la coloration H/E. d Images représentatives de la coloration immunofluorescente de coupes de foie à l'aide d'anti-UCP1 (400 ×, barre d'échelle = 50 μm). HCD_ND fait référence au groupe de souris modèles d'hypercholestérolémie ; v/i/uH6 fait référence à des cellules bactériennes viables (vH6), inactivées par la chaleur (iH6) et lysées par ultrasons (uH6); FMT1/2/3 fait référence à l'utilisation des matières fécales des groupes HCD_ND, Sim et vH6, respectivement.

La coloration au rouge d'huile O a montré que les gouttelettes de lipides hépatiques dans les hépatocytes de souris HCD présentaient une accumulation de particules et une fusion en flocons (Fig. 2c). Cependant, lorsque les souris ont été traitées avec vH6, iH6 et FMT3, les gouttelettes lipidiques étaient significativement moins nombreuses, la taille était plus petite et la distribution était irrégulière et inégale.

L'expression d'UCP1 dans les tissus hépatiques a été détectée par coloration immunohistochimique (Fig. 2d). Par rapport à HCD_ND et FMT1, l'expression d'UCP1 était significativement améliorée chez les souris ayant reçu vH6, iH6 et FMT3, et il y avait une grande surface de particules brunes positives dans les tissus hépatiques. En conclusion, on peut observer que v/i/u H6 et FMT3 améliorent la dégénérescence du foie à des degrés divers en colorant des coupes de foie.

Dans le groupe HCD, les niveaux de glucose des souris ont été perturbés et les niveaux de glucose sanguin ont fortement augmenté. v/i/uH6 et FMT3 ont diminué les valeurs d'aire sous la courbe (AUC) correspondant à la tolérance au glucose chez les souris, qui ont été significativement diminuées de 23,89 % et 20,50 % dans les groupes uH6 et FMT3, respectivement (P < 0,05, Fig. 3a, b). De même, v/i/uH6 et FMT3 ont amélioré la tolérance à l'insuline des souris, comme en témoignent la réduction du glucose et la baisse des valeurs d'ASC dans le test de tolérance à l'insuline, qui ont été significativement diminuées de 19,53 %, 15,10 % et 8,35 % dans les tests vH6, iH6. , et les groupes FMT3, respectivement (P < 0,05, Fig. 3c, d). Ces résultats indiquent que v/i/uH6 et FMT3 peuvent améliorer la tolérance au glucose et à l'insuline chez les souris hypercholestérolémiques.

a, b GTT : des souris à jeun pendant la nuit ont reçu une injection de glucose (2 mg/kg) par voie intrapéritonéale. La glycémie a été déterminée à 0, 15, 30, 60 et 120 min ensuite. c, d ITT : des souris à jeun depuis 4 h ont reçu une injection d'insuline (0,75 U/kg). La glycémie a été déterminée à 0, 15, 30, 60 et 120 min ensuite. La valeur de l'ASC a été calculée. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM (n = 8). *P < 0,05, **P < 0,01 contre contrôler HCD_ND ; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs contrôle FMT1. HCD_ND fait référence au groupe de souris modèles d'hypercholestérolémie ; v/i/uH6 fait référence à des cellules bactériennes viables (vH6), inactivées par la chaleur (iH6) et lysées par ultrasons (uH6); FMT1/2/3 fait référence à l'utilisation des matières fécales des groupes HCD_ND, Sim et vH6, respectivement.

Un total de 1061 OTU, dont 18 embranchements, 33 classes, 78 ordres, 112 familles, 196 genres et 305 espèces, ont été identifiés dans le microbiote intestinal de souris par la technologie de séquençage de l'ARNr 16S. La diversité α du microbiote intestinal de différentes souris traitées a été évaluée en fonction des niveaux d'OTU. Les indices Ace, Shannon et Shannoneven du microbiote intestinal des souris ayant reçu v/i/uH6 et FMT3 étaient significativement plus élevés que ceux des groupes HCD_ND et FMT1 (Fig. 4a et Supplémentaire fig. 2b). L'analyse des coordonnées principales de la diversité β (PCoA) a montré que le microbiote intestinal des souris ayant reçu les groupes v/i/uH6 et FMT3 était similaire à celui du groupe ND mais significativement différent de celui des groupes HCD, HCD_ND et FMT1 (Fig. 4b). Par rapport à HCD_ND, v / i / uH6 a augmenté l'abondance du microbiote intestinal chez la souris et le nombre d'OTU a augmenté de 31, 16%, 39, 86% et 17, 63%, respectivement (Fig. 4c). Les cartes thermiques basées sur les niveaux d'OTU ont montré que la structure de la microflore intestinale des groupes HCD, HCD_ND et d'autres groupes de traitement était clairement divisée en trois parties, et l'abondance communautaire de v/i/uH6 était plus similaire à celle des groupes ND et Sim (Fig. 4d). Une analyse plus approfondie de la composition du microbiote intestinal au niveau du phylum (Fig. 4e) a montré que dans le groupe HCD, les Firmicutes augmentaient et les Bacteroidota diminuaient dans l'intestin, ce qui entraînait une augmentation du rapport F / B. Alors que v/i/uH6 réduisait l'abondance relative des Firmicutes de 5,94 %, 44,96 % et 44,64 % respectivement, il augmentait l'abondance relative des Bacteroidota de 234,85 %, 377,05 % et 362,53 % respectivement, et réduisait le rapport F/B significativement par rapport au groupe HCD_ND.

a Alpha-diversité évaluée par la richesse (ACE) et la diversité (Shannon). b Diversité bêta calculée à l'aide d'UniFrac pondéré par PCoA. c Diagramme de Venn des OTU chez les souris ayant reçu v/i/uH6. d Carte thermique de l'abondance relative des 100 meilleurs OTU chez les souris ayant reçu v/i/uH6. e Abondance relative du microbiote au niveau du phylum et rapport Firmicutes/Bacteroidetes. f Score LDA (LDA > 2,5) chez les souris ayant reçu v/i/uH6. g Comparaison de deux groupes à l'aide d'un test t de Student. h Diagramme de Venn des OTU, carte thermique de l'abondance relative des 100 premières OTU, score LDA et comparaison de deux groupes à l'aide d'un test t de Student dans des groupes de transplantation de microbiote fécal. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. HCD_ND fait référence au groupe de souris modèles d'hypercholestérolémie ; v/i/uH6 fait référence à des cellules bactériennes viables (vH6), inactivées par la chaleur (iH6) et lysées par ultrasons (uH6); FMT1/2/3 fait référence à l'utilisation des matières fécales des groupes HCD_ND, Sim et vH6, respectivement.

L'analyse LEfSe a montré des différences significatives dans la structure du microbiote intestinal entre les différents groupes de traitement (Fig. 2f supplémentaire), et une analyse discriminante linéaire (LDA) a été utilisée pour évaluer les bactéries prédominantes dans les différents groupes. Les bactéries dominantes des souris ayant reçu vH6 étaient Lactobacillus, Coriobacteriaceae_UCG-002 et norank_f__Oscillospiraceae, Muribaculum, unclassified_o__Bacteroidales et Ruminococcus lorsqu'elles ont reçu iH6, et norank_f__Muribaculaceae lorsqu'elles ont reçu uH6 (Fig. 4f). Le test t de Student a montré que dans le groupe HCD_ND, l'abondance de Faecalibaculum, Allobaculum et Turicibacter augmentait significativement par rapport à celle du groupe traité v/i/uH6 dans lequel l'abondance de norank_f__Muribaculaceae augmentait significativement par rapport à celle du groupe HCD_ND (Fig. 4g). De plus, par rapport au groupe HCD_ND, i/uH6 a augmenté unclassified_o__Oscillospirales et Lachnoclostridium, et vH6 a augmenté Muribaculum de manière significative, de sorte que ces bactéries dominantes pourraient être des biomarqueurs potentiels pour une réduction efficace du cholestérol par Lp

La transplantation de microbiote fécal (FMT) utilisant des matières fécales de souris traitées par vH6 a également amélioré la composition microbienne intestinale induite par HCD (Fig. 4h). Par rapport au traitement FMT1, le nombre d'OTU de microbes intestinaux des souris traitées par FMT3 a augmenté de 15 % et la carte thermique de la distribution communautaire était plus similaire à celle des souris normales et traitées par FMT2. De même, la quantité de Firmicutes a diminué de 15,45 % et celle de Bacteroidota a augmenté de 79,3 % chez les souris traitées par FMT3. Les bactéries dominantes des souris traitées par FMT3 étaient norank_f__Muribaculaceae, unclassified_f__Ruminococcaceae, unclassified_c__Bacilli et Intestinimonas, dont norank_f__Muribaculaceae était également la bactérie dominante la plus abondante des souris traitées par uH6. Par rapport au traitement FMT1, FMT3 a augmenté l'abondance d'Enterorhabdus, Muribaculum, unclassified_c__Bacilli, Coriobacteriaceae_UCG-002 et norank_f__Paracaedibacteraceae. De plus, FMT3 a diminué les niveaux de Faecalibaculum, ce qui était cohérent avec le groupe traité avec v/i/uH6. Ces résultats indiquent que v/i/uH6 et FMT3 peuvent atténuer la dysbiose du microbiote intestinal des souris hypercholestérolémiques en régulant les microbes intestinaux.

La détection non ciblée des métabolites fécaux de souris a été réalisée sur la base de UPLC/Q-TOF-MS/MS. Les informations MS et MS/MS ont été appariées avec les bases de données métaboliques publiques HMDB (http://www.hmdb.ca/) et Metlin (https://metlin.scripps.edu/). Un total de 1114 métabolites fécaux ont été identifiés. L'analyse PLS-DA a montré que les groupes HCD, HCD_ND et FMT3 étaient manifestement séparés des autres groupes de traitement (Fig. 5a), et le modèle de test de substitution a montré que le modèle PLS-DA était fiable (Fig. 3a supplémentaire). Selon la carte thermique, les métabolites fécaux des souris ayant reçu v/i/uH6 et FMT3 étaient plus similaires au groupe ND, mais étaient évidemment séparés des groupes HCD, HCD_ND et FMT1 (Fig. 3b supplémentaire). Tous les métabolites ont été classés en vitamines-cofacteurs, acides aminés, acides biliaires et lipides. Par rapport au groupe HCD_ND, v/i/uH6 a augmenté le contenu relatif de six vitamines-cofacteurs, parmi lesquels le pantothénate et le niacinamide ont été significativement augmentés (Fig. 5b). Cependant, FMT3 n'a pas modifié de manière significative le niveau de vitamines-cofacteurs (Figure supplémentaire 3c). Par rapport au groupe HCD_ND, v/i/uH6 a augmenté de manière significative la teneur en acides aminés (Fig. 5c), tels que le l-tryptophane, la l-proline, la l-phénylalanine et le l-glutamate, et la teneur en acides aminés à chaîne ramifiée. acides (BCAA), comme la l-Isoleucine. En termes d'acides biliaires, par rapport au groupe HCD_ND, v/i/uH6 a réduit la teneur en acides biliaires primaires de 18,10 %, 13,31 % et 21,00 % respectivement, et a réduit la teneur en acides biliaires secondaires, tels que l'acide désoxycholique, Acide 3-déhydrocholique, acide 12-cétolithocholique, acide glycolithocholique. FMT3 avait la même tendance dans la régulation des acides biliaires (Fig. 5d). Les métabolites différentiels entre les différents groupes de traitement ont été criblés par une carte thermique en grappes et un graphique à barres VIP (Fig. 5e). Les souris traitées avec v/i/uH6 et FMT3 ont été identifiées pour 7, 7, 16 et 4 métabolites lipidiques notables, respectivement. Comparé au groupe HCD_ND, vH6 a significativement régulé à la hausse quatre métalolites lipidiques, à savoir 9,12,13-TriHOME, 9-HOTrE, l'acide stéaridonique et l'acide dodécanedioïque. iH6 a significativement régulé à la hausse l'acide stéaridonique, l'acide dodécanedioïque et l'alprostadil. uH6 a significativement régulé à la hausse l'ouabaïne. FMT3 a réduit tous les métabolites différentiels par rapport à FMT1. Dans l'ensemble, il existe des similitudes dans les métabolites différentiels de v/i/uH6 et FMT3, tels que l'acide élaïdique, l'acide trans-vaccénique, l'acide stéaridonique, etc.

a Analyse discriminante des moindres carrés partiels (PLS-DA) basée sur les métabolites microbiens. b–d La teneur relative en vitamines-cofacteurs, acides aminés et acides biliaires détectés par l'approche métabolomique non ciblée basée sur UPLC/Q-TOF-MS/MS. e La carte thermique de regroupement et la carte à barres VIP des lipides différentiels ont été comparées entre les deux groupes. f La teneur en acide caproïque. g Analyse d'enrichissement de la voie KEGG des métabolites différentiels dans HCD_ND vs vH6. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. HCD_ND fait référence au groupe de souris modèles d'hypercholestérolémie ; v/i/uH6 fait référence à des cellules bactériennes viables (vH6), inactivées par la chaleur (iH6) et lysées par ultrasons (uH6); FMT1/2/3 fait référence à l'utilisation des matières fécales des groupes HCD_ND, Sim et vH6, respectivement.

Pour la détection ciblée des AGCC, un chromatographe en phase gazeuse Thermo TRACE1310-ISQ LT équipé d'une colonne capillaire Agilent HP-INNOWAX a été utilisé. Par rapport au groupe HCD_ND (Fig. 5f), vH6 a augmenté la teneur en acide caproïque (P <0, 05), en acide acétique, en acide propionique, en acide isobutyrique, en acide butyrique, en acide valérique et en AGCC totaux; uH6 a augmenté la teneur en acide acétique, en acide propionique et en acide valérique. Par rapport au groupe FMT1, FMT3 a augmenté la teneur en acide acétique et en acide propionique, bien qu'aucune de ces différences n'ait été statistiquement significative (Fig. 3e supplémentaire).

Les processus biologiques des métabolites fécaux ont été prédits à l'aide de l'analyse de la voie KEGG. L'analyse des métabolites différentiels entre les groupes vH6 et HCD_ND a révélé que le vH6 régulait l'hypercholestérolémie chez la souris par de nombreuses voies, notamment la digestion et l'absorption des vitamines, la régulation de la lipolyse, la voie de signalisation de l'AMPc, le métabolisme de l'acide linoléique, la biosynthèse de la phénylalanine, de la tyrosine et du tryptophane, la voie de signalisation mTOR, PI3K- Voie de signalisation Akt et biosynthèse secondaire des acides biliaires. Semblables à vH6, iH6 et uH6 sont impliqués dans la régulation des voies métaboliques, telles que la voie de signalisation de l'AMPc, la sécrétion de bile, la régulation de la lipolyse ou la voie de signalisation mTOR (Fig. 5g et Supplémentaire fig. 3f). Par rapport à FMT1, FMT3 peut réguler le métabolisme via la sécrétion de bile et la biosynthèse secondaire des acides biliaires. En conclusion, v/i/uH6 ont tous amélioré les métabolites intestinaux chez les souris hypercholestérolémiques à des degrés divers. En particulier, les cellules v/i/uH6 ont augmenté le métabolisme de la flore intestinale des vitamines-cofacteurs, ainsi que des acides aminés, tout en diminuant la teneur relative en acides biliaires primaires.

Une analyse plus approfondie des corrélations de Pearson entre le microbiote intestinal (10 principaux genres au niveau du genre) et les indicateurs physicochimiques de l'hypercholestérolémie a montré que norank_f__Muribaculaceae et Lactobacillus avaient des corrélations négatives significatives avec TC, TG, LDL, ALT, AST et le poids du foie. Turicibacter, Romboutsia et Faecalibaculum avaient tous des corrélations positives significatives avec ces indices (Fig. 6a). Allobaculum avait également une relation positive significative avec le LDL, le TC du foie et le poids du foie. La corrélation entre les métabolites fécaux et la structure de la communauté microbienne a été évaluée par analyse de redondance (RDA), comme le montrent les Fig. 6b – d et Fig. 4a, b. Dans le groupe traité par v/i/uH6, Faecalibaculum, Allobaculum et Turicibacter ont montré une relation négative significative avec d'autres bactéries, confirmant les résultats précédents. La D-biotine et l'acide folique avaient une forte corrélation positive avec Lactobacillus, Coriobacteriaceae_UCG-002 et Muribaculum, tandis que les vitamines-cofacteurs avaient une corrélation positive avec les bactéries dominantes des souris traitées v/i/uH6 (Fig. 6b). la l-sérine était fortement corrélée avec Lactobacillus et Coriobacteriaceae_UCG-002, tandis que les acides aminés restants étaient corrélés avec les bactéries dominantes v/i/uH6 (Fig. 6c). Pour les acides biliaires, l'acide glycolithocholique n'a eu aucune corrélation avec les non classés_o__Bacteroidales et Turicibacter. Romboutsia et Faecalibaculum ont montré des corrélations positives significatives avec la plupart des acides biliaires (Fig. 6d). Ces résultats ont indiqué une forte corrélation entre la production et l'abondance des métabolites fécaux et des microbes intestinaux chez les souris hypercholestérolémiques ayant reçu v/i/uH6. De même, dans le groupe FMT3, une corrélation entre les communautés microbiennes et les indicateurs physico-chimiques et les métabolites a été découverte, mais il n'y avait pas de signification statistique (Fig. Supplémentaire 4c – g). En bref, l'analyse de corrélation de Pearson a montré que norank_f__Muribaculaceae et Lactobacillus avaient une corrélation négative avec les taux de lipides sanguins. La RDA a indiqué une forte corrélation positive entre la production et l'abondance de métabolites fécaux et de microbes intestinaux chez des souris hypercholestérolémiques ayant reçu v/i/uH6.

a Analyse de corrélation entre les 10 bactéries les plus riches et les indices physicochimiques de l'hypercholestérolémie par la méthode de Spearman. b–d Analyse de redondance (RDA) de la corrélation entre la communauté microbienne v/i/uH6 et les métabolites fécaux (vitamines-cofacteurs, acides aminés, acides biliaires). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. HCD_ND fait référence au groupe de souris modèles d'hypercholestérolémie ; v/i/uH6 fait référence à des cellules bactériennes viables (vH6), inactivées par la chaleur (iH6) et lysées par ultrasons (uH6).

Lactobacillus plantarum H6 (CGMCC 18205) est une souche probiotique à effet hypocholestérolémiant qui a été isolée de la pâte fermentée dans notre laboratoire et a obtenu un brevet national d'invention (n° ZL 201910955071. X). Auparavant, nous avons mené des expériences in vivo pour évaluer l'effet préventif de la Lp H6 sur l'hypercholestérolémie. La présente étude a également évalué ses effets thérapeutiques sur l'hypercholestérolémie. Les cellules H6 mortes et lysées ont également été évaluées ensemble afin d'acquérir une compréhension plus complète des effets régulateurs de H6 sur le métabolisme des lipides.

Les souris hypercholestérolémiques ayant reçu à la fois du H6 viable et inactivé ont augmenté leur apport alimentaire, mais n'ont eu aucun changement significatif dans le gain de poids. Cette découverte est cohérente avec une étude précédente qui a révélé que Lactobacillus fermentum ZJUIDS06 et Lactobacillus plantarum ZY08 n'avaient aucun effet sur la perte de poids chez les rats hypercholestérolémiques15. Cependant, v/i/uH6 a diminué de manière significative le poids du foie, tout comme les selles de l'intestin des souris traitées avec vH6 (FMT3), ce qui implique que v/i/uH6 pourrait améliorer la fonction microbienne intestinale et ainsi améliorer le métabolisme des lipides et la dépense énergétique.

Dans la pratique clinique, les niveaux de TC, TG, LDL-C, ALT et AST dans le corps sont critiques pour la surveillance de la santé16,17. Dans cette étude, la souche H6, comprenant des cellules vivantes et mortes, avait de bons effets hypolipidémiants, ce qui a été confirmé par des indicateurs biochimiques dans le sérum et le foie, ainsi que par un test histopathologique. En général, la viabilité cellulaire est une exigence importante pour que les probiotiques remplissent leurs fonctions de promotion de la santé16. Cependant, les postbiotiques, qui sont des cellules bactériennes non viables, des fractions bactériennes ou des lysats cellulaires, pourraient également offrir des avantages physiologiques à l'hôte en offrant une bioactivité supplémentaire6. Nos résultats ont montré que les cellules H6 tuées par la chaleur et lysées par ultrasons conservent encore une certaine activité physiologique dans une certaine mesure, ce qui peut être dû à la capacité des composants de la paroi cellulaire à adsorber le cholestérol. Il a été démontré que le cholestérol se fixe au peptidoglycane de la paroi cellulaire, qui contient des acides aminés dotés d'une capacité de liaison, mais les mécanismes exacts restent inconnus6. De plus, il a également été prouvé que l'exopolysaccharide améliore le métabolisme des lipides. Il modifie l'homéostasie du cholestérol par la synthèse et la combinaison du cholestérol et des acides biliaires, et le mécanisme spécifique doit encore être exploré18.

Il a été démontré que la protéine de découplage hépatique 1 (UCP1) régule le succinate extracellulaire et l'inflammation dans le foie en augmentant la dépense énergétique et en réduisant les lipides hépatiques19. Dans cette étude, UCP1 a augmenté dans le foie de souris ayant reçu v/i/uH6 et FMT3, indiquant que la souche H6 inhibe la dégénérescence hépatique chez les souris hypercholestérolémiques en améliorant la thermogenèse et le métabolisme des lipides. En termes de métabolisme des glucolipides, les H6 viables et morts ont amélioré la tolérance à l'insuline, tandis que les H6 lysés ont amélioré la tolérance au glucose chez la souris. Ces découvertes sont cohérentes avec les découvertes précédentes selon lesquelles les bifidobactéries stérilisées pourraient améliorer la tolérance au glucose et la résistance à l'insuline, et donc abaisser la glycémie chez les souris présentant des troubles du métabolisme des glucides et des lipides20. Il convient de noter que FMT3 utilisant des selles de souris ayant reçu du H6 viable présente les mêmes avantages physiologiques que les souches viables, telles que la réduction des lipides et l'amélioration du métabolisme des glucolipides, ce qui implique que le H6 viable induit la production de métabolites bénéfiques par les micro-organismes intestinaux chez la souris21.

Il a été reconnu que les suppléments probiotiques entraînent des changements évidents dans la composition microbienne intestinale et régulent ainsi le métabolisme des graisses alimentaires22. Par conséquent, les micro-organismes intestinaux pertinents pour la santé de l'hôte ont été isolés et identifiés. Le rôle des micro-organismes intestinaux dans la santé ou la maladie est maintenant reconnu23.

Dans cette étude, v/i/uH6 et FMT3 étaient suffisants pour améliorer la composition microbienne dans l'intestin induite par un régime riche en cholestérol. Lactobacillus et Coriobacteriaceae_UCG-002 ont été enrichis chez des souris ayant reçu vH6, ce qui est cohérent avec les découvertes précédentes de notre laboratoire14. Il a été découvert que Lactobacillus était une bactérie bénéfique commune avec la capacité de réguler le métabolisme du cholestérol en raison de son activité élevée d'hydrolase des sels biliaires24,25. Quatre genres dominants ont été trouvés chez les souris ayant reçu v/i/uH6, y compris norank_f__Oscillospiraceae, Muribaculu, unclassified_o__Bacteroidales et Ruminococcus, parmi lesquels, Ruminococcus a été trouvé enrichi dans le tractus intestinal des enfants de poids normal, tandis que moins d'Oscillospiraceae ont été détectés chez les personnes obèses , suggérant que ces deux genres étaient négativement corrélés à la diminution du cholestérol26. uH6 et FMT3 ont tous deux augmenté norank_f__Muribaculaceae, une bactérie anti-inflammatoire bien définie.

Les Muribaculaceae ont été nommées d'après l'analyse et la description des problèmes et des caractéristiques de la famille S24-7 de bactéries en termes de diversité, d'écologie, de potentiel fonctionnel et d'occurrence germinale27. Il est fonctionnellement différent de sa famille voisine et multifonctionnel en ce qui concerne la dégradation des glucides complexes et des calories élevées28. Des études ont montré que la communauté de Muribaculaceae dans la flore intestinale des souris à régime riche en graisses est significativement réduite29. Muribaculacea est la bactérie la plus abondante dans l'intestin au niveau du genre dans notre étude, par rapport aux souris nourries avec un régime riche en cholestérol, Muribaculacea était remarquablement plus élevée chez les souris recevant i/uH6 ou FMT3, indiquant qu'elle pourrait jouer un rôle important dans le métabolisme des lipides. En outre, FMT3 a également augmenté unclassified_f__Ruminococcaceae, unclassified_c__Bacilli et Intestinimonas. Intestinimonas a été rapporté pour contrôler le poids corporel et prévenir le diabète de type II dans une étude de cohorte d'échantillons de santé et de maladies métaboliques30. Allobaculum et Turicibacter étaient des genres qui pouvaient induire de l'inflammation et de l'obésité26,31. Allobaculum et Faecalitalea se sont avérés plus abondants chez les souris traitées avec des protéines de porc et du saindoux, ce qui suggère que ces genres étaient positivement corrélés à l'inflammation32. Semblable à ces résultats, nous avons constaté que l'abondance de Faecalibaculum, Allobaculum et Turicibacter augmentait chez les souris nourries avec des régimes riches en cholestérol, tout en diminuant chez les souris recevant v/i/uH6. Bien que Bifidobacterium soit généralement reconnu comme une bactérie bénéfique33,34, il s'est avéré qu'il était moins abondant chez les souris ayant reçu v/i/uH6 ou FMT3 dans cette étude, et les raisons de cela doivent être étudiées plus avant.

De nombreux nutriments sont connus pour jouer un rôle dans la régulation du métabolisme des lipides35,36. Un régime riche en vitamines peut réduire les risques de maladie coronarienne et d'athérosclérose, car il a été démontré que les vitamines du complexe B abaissent les niveaux de TC et de TG dans le corps. La niacine, une vitamine du complexe B, est utilisée pour traiter la maladie athéroscléreuse en association avec certains médicaments hypolipémiants37. L'α-méthyl-l-tryptophane pourrait améliorer l'hyperglycémie, la résistance à l'insuline et la stéatose hépatique38, tandis que l'acide l-glutamique pourrait inhiber la progression de l'athérosclérose et de la stéatose hépatique39. Dans cette étude, le traitement v/i/uH6 a augmenté les taux de vitamines-cofacteurs et d'acides aminés liés au métabolisme lipidique du microbiote intestinal, expliquant en partie le mécanisme d'action hypocholestérolémiante de la souche Lp H6. Les acides biliaires (BA) sont des molécules de signalisation importantes étroitement liées au métabolisme du cholestérol. De nombreuses études ont montré que la biotransformation des AB primaires par les micro-organismes intestinaux peut réduire l'accumulation de graisse dans le foie et réduire les taux de lipides sanguins40. Notre étude précédente a montré que H6 pouvait exercer efficacement ses effets hypocholestérolémiants via l'hydrolase des sels biliaires ainsi que l'adsorption membranaire, la coprécipitation et l'inhibition des micelles de cholestérol. De plus, en favorisant l'expression du gène CYP7A1 et en inhibant la voie du récepteur farnésoïde X, H6 viable pourrait augmenter la synthèse des BA et l'abondance des bactéries contenant l'activité de l'hydrolase des sels biliaires (BSH)14. Dans cette étude, nous avons également découvert que l'a/i/sH6 et le FMT3 réduisaient les niveaux relatifs de BA primaires, suggérant que H6 pourrait empêcher l'absorption des BA dans l'intestin grêle. Les AGCC sont un autre métabolite important du microbiote intestinal, dont il a été démontré qu'il joue un rôle important dans la prévention et le traitement de nombreuses maladies41. Cependant, les quantités d'AGCC n'ont pas changé après la consommation de v/i/uH6 dans cette étude, ce qui est conforme à un récent essai randomisé en double aveugle montrant que des volontaires consommant une sorte de probiotique L. plantarum Dad-13 amélioraient efficacement le profil lipidique. sans changement significatif de la concentration d'AGCC dans l'intestin42. La raison n'est pas claire.

Il a été démontré que les Muribaculaceae ont une corrélation négative avec le poids corporel de la souris et les paramètres biochimiques43, à partir des observations enregistrées ci-dessus, nous avons étudié la corrélation entre le microbiote intestinal et les paramètres physicochimiques par analyse de corrélation de Pearson et RDA, et nous avons découvert qu'ils étaient fortement corrélés. Cette corrélation doit cependant être validée au niveau de la souche.

Cette étude a étudié l'effet thérapeutique d'une nouvelle souche brevetée Lactobacillus plantarum H6 dans différents états (actif, inactivé par la chaleur et lysé par ultrasons) sur des souris hypercholestérolémiques. Comme le montre la figure 7, les cellules v/i/uH6 et les selles de souris traitées avec vH6 (FMT3) ont amélioré l'hypercholestérolémie chez la souris, et cet effet a été en partie attribué à la régulation du microbiote intestinal et des métabolites liés au métabolisme des lipides. Les muribaculaceae pourraient être utilisées comme biomarqueur potentiel pour une réduction efficace du cholestérol. La Lp H6 inactivée par la chaleur et lysée par ultrasons pourrait être un postbiotique prometteur pour réguler le métabolisme du cholestérol. Bien que la Lp H6 dans les trois états puisse améliorer l'hypercholestérolémie des souris à différents degrés, son mécanisme est encore inconnu, et les molécules effectrices et les voies de signalisation de la Lp H6 dans la réduction du cholestérol méritent toujours d'être étudiées dans de futures études.

Les cellules v/i/uH6 pourraient abaisser TC, TG, LDL-C, ALT, AST dans le sérum et TC, TG dans le foie à différents niveaux, et améliorer les indices GTT et ITT. En outre, la récupération de ces indices biochimiques et du microbiome intestinal a été constatée après FMT en utilisant des selles de souris traitées avec vH6. Les Muribaculaceae se sont avérées les plus abondantes dans l'intestin des souris après les traitements v/i/uH6, ce qui suggère qu'elles pourraient être utilisées comme biomarqueur potentiel pour réduire efficacement le cholestérol. Les cellules v/i/uH6 ont augmenté le métabolisme de la flore intestinale des vitamines-cofacteurs, ainsi que des acides aminés, tout en diminuant la teneur relative en acides biliaires primaires. L'analyse de corrélation de Pearson a montré que norank_f__Muribaculaceae et Lactobacillus avaient une corrélation négative avec les taux de lipides sanguins. La RDA a indiqué une forte corrélation positive entre la production et l'abondance de métabolites fécaux et de microbes intestinaux chez des souris hypercholestérolémiques ayant reçu v/i/uH6. Dans l'ensemble, les cellules v/i/uH6 ont été efficaces pour améliorer l'hypercholestérolémie chez la souris, et cet effet a été attribué en partie à la régulation du microbiote intestinal et des métabolites liés au métabolisme des lipides. v/i/uH6 fait référence à des cellules bactériennes viables (vH6), inactivées par la chaleur (iH6) et lysées par ultrasons (uH6). (La figure a été créée avec Biorender.com.).

La simvastatine a été achetée auprès de Shandong Lu'an Anti-Pharmaceutical Group Saite Co., Ltd, Shandong, Chine. L'injection d'insuline a été achetée auprès de Jiangsu Wanbang Biochemical Pharmaceutical Group Co., Ltd. Le lecteur de glycémie et le papier de test de glycémie (type GA-3) ont été achetés auprès de Sanno Biosensing Co., Ltd, Jiangsu, Chine. Les kits de détection TC, TG, LDL-C, HDL-C, ALT et AST ont été achetés auprès de Jiancheng Bioengineering Research Institute (Nanjing, Chine).

Lactobacillus plantarum H6 (CGMCC 18205) a été sélectionné parmi la pâte collante, un produit à base de farine fermentée traditionnelle chinoise. Avant l'expérience, les cellules bactériennes ont été activées deux fois. Les cellules activées ont été inoculées avec du milieu MRS et cultivées dans des conditions anaérobies à 37 ° C pendant 24 h. Après culture, la suspension bactérienne a été lavée deux fois avec du sérum physiologique et la concentration de la suspension a été ajustée à 1 × 109 cfu/mL (vH6). Des cellules inactivées (iH6) ont été préparées à partir d'une suspension bactérienne dans un bain-marie à 90 ° C pendant 30 min avec des modifications mineures par rapport à l'approche précédente44. La suspension bactérienne a été traitée avec un pulvérisateur de cellules à ultrasons pendant 5 s et 60 min à des intervalles de 9 s pour préparer un lysat bactérien à ultrasons (uH6) avec des modifications mineures par rapport à l'approche précédente45 et la culture sur plaque a montré qu'aucune bactérie viable ne se développait.

Quatre-vingt-huit souris mâles C57BL/6 (âgées de 5 semaines et pesant de 18 à 19 g) ont été achetées auprès de Shenyang Changsheng Biotechnology Co., Ltd. (numéro d'approbation : SCXK (Liao) 2021-0001, Liaoning, Chine). Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux directives pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de l'Université agricole de Jilin et approuvées par le Comité d'éthique animale de l'Université agricole de Jilin. Les souris ont été hébergées à température ambiante (25 ± 1 °C) sous des cycles de 12 h de lumière/12 h d'obscurité. Après une semaine d'adaptation, les souris ont été divisées en 3 groupes, comprenant le groupe régime normal (Beijing Co-operative Feeds Co., Ltd.) (ND), le groupe régime riche en cholestérol (High cholesterol Rat Food, Dietz Biotechnology Co., Ltd. ) groupe (HCD) et le groupe de traitement.

Après 4 semaines d'alimentation, le sérum et le foie des souris ND et HCD ont été prélevés après euthanasie pour mesurer les niveaux de TC et TG. Lorsque les taux de lipides du groupe HCD étaient 2 à 3 fois plus élevés que ceux du groupe ND, le modèle d'hypercholestérolémie a été considéré comme réussi et utilisé dans les expériences suivantes. De la 5e semaine à la 12e semaine, tous les groupes ont été nourris avec le régime alimentaire normal, à l'exception du groupe HCD, tandis que les cellules v/i/uH6 (1 × 109 ufc/mL) et la simvastatine (3,80 mg/kg de poids corporel) ont été respectivement gavées quotidiennement. Les groupes ND et HCD ont été gavés avec du NaCl à 0,9 % en quantité égale chaque jour (le groupe HCD a été nourri avec un régime alimentaire normal et a été nommé groupe HCD_ND).

Le dispositif expérimental du test de transplantation de microbiote fécal (FMT) est le suivant : dans des conditions aseptiques, 300 mg de matières fécales fraîches ont été prélevés des groupes HCD_ND, Sim et vH6 respectivement chaque jour, remis en suspension dans 3 mL de NaCl stérile à 0,9 %, puis centrifugé à 800 g pendant 3 min46. Ensuite, le surnageant a été collecté et les souris modèles d'hypercholestérolémie (groupe HCD_ND) ont été utilisées comme receveurs du test FMT. FMT utilisant les matières fécales des groupes HCD_ND, Sim et vH6 sont nommés FMT1, FMT2 et FMT3, respectivement, comme le montre la Fig. 8. La veille du meurtre des souris, les matières fécales des souris ont été collectées dans des conditions aseptiques, congelées dans de l'azote liquide. et conservé à -80 °C. Après 12 semaines d'expérimentation animale, les souris ont été anesthésiées à l'éther et tuées par séparation du cou. Le sang a été prélevé, centrifugé à 3000 g min à 4 °C pendant 15 °C pour obtenir du sérum, qui a été stocké à -20 °C pour une utilisation ultérieure. Le foie a été prélevé et pesé, une partie a été fixée avec du paraformaldéhyde à 4 % et une partie a été congelée dans de l'azote liquide et conservée à -80 °C.

Au cours des 4 premières semaines, 88 souris mâles C57BL/6 ont été réparties au hasard en un groupe de régime normal (ND) et un groupe de régime riche en cholestérol (HCD). De la 5ème semaine à la 12ème semaine, tous les groupes ont été nourris avec le régime alimentaire normal à l'exception du HCD, tandis que les cellules v/i/uH6 (1 × 109 ufc/mL) et la simvastatine (3,80 mg/kg de poids corporel) ont été gavées quotidiennement. Les groupes ND et HCD ont été gavés avec du NaCl à 0,9 % en quantité égale chaque jour. Les souris modèles d'hypercholestérolémie ont été utilisées comme receveurs du test FMT. La FMT a été réalisée en utilisant des matières fécales de souris traitées avec du NaCl et du vH6, respectivement. (La figure a été créée par l'auteur. Aucun matériel tiers n'a été utilisé).

À la 8e semaine de traitement v/i/uH6 et FMT3, les souris ont été mises à jeun pendant une nuit (pour le test de tolérance au glucose) ou pendant 4 h (pour le test de tolérance à l'insuline) et ont reçu une injection intrapéritonéale de glucose (2 g/kg de poids corporel) ou d'insuline (0,75 U/kg PC), respectivement. Le sang de la queue a été prélevé à 0, 15, 30, 60 et 120 min après l'injection, et la glycémie a été mesurée par un glucomètre sanguin selon les instructions du fabricant. La valeur AUC de chaque groupe a été calculée.

Les teneurs en TC, TG, HDL-C, LDL-C, AST et ALT dans le sérum et en TC, TG dans le foie ont été déterminées avec les kits de réactifs de Nanjing Jiancheng Biomedical Company.

Coloration HE : des coupes de paraffine déparaffinées du foie ont été colorées dans une solution de coloration à l'hématoxyline pendant 3 à 5 min, puis lavées à l'eau courante. Après cela, les coupes de tissus ont été déshydratées dans un gradient d'alcool à 85% et 95% pendant 5 min, colorées dans une solution de coloration à l'éosine pendant 5 min, scellées avec un gel neutre et × 400 images ont été collectées au microscope.

Coloration Oil Red O : des sections de tissus frais congelés ont été fixées, puis colorées avec Oil Red O. Les sections ont été retirées, laissées pendant 3 s, puis plongées séquentiellement dans deux tasses d'isopropanol à 60 % pendant 3 s et 5 s chacune. Ensuite, les coupes ont été recolorées avec de l'hématoxyline pendant 3 à 5 min, et ont été scellées avec un scellant de gélatine glycérol, et × 400 images ont été collectées au microscope.

Analyse immunohistochimique : les coupes de tissus ont été déparaffinées pour la réparation de l'antigène, placées dans une solution de peroxyde d'hydrogène à 3 % pour bloquer la peroxydase endogène, scellées à température ambiante pendant 30 min en laissant couler 3 % de BSA, incubées avec l'anticorps primaire pendant une nuit à 4 °C et incubées avec le secondaire anticorps pendant 50 min à température ambiante. Ensuite, la solution de couleur DAB nouvellement préparée a été goutte à goutte et le temps chromogénique a été contrôlé au microscope. Les noyaux ont été recolorés avec de l'hématoxyline pendant 3 min et scellés avec un gel neutre pour l'imagerie microscopique à un grossissement × 400.

L'ADN génomique de la communauté microbienne a été extrait d'échantillons fécaux à l'aide du kit d'ADN de sol EZNA® (Omega Bio-tek, Norcross, GA, États-Unis). La région hypervariable V3-V4 du gène bactérien de l'ARNr 16S a été amplifiée avec des paires d'amorces 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3') et 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'). Le produit de PCR a été extrait d'un gel d'agarose à 2 %, purifié à l'aide du kit d'extraction de gel d'ADN AxyPrep (Axygen Biosciences, Union City, Californie, États-Unis) et quantifié à l'aide du fluoromètre Quantus™ (Promega, États-Unis). La plateforme Miseq PE300/NovaSeq PE250 d'Illumina a été utilisée pour le séquençage (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd). La qualité des séquences brutes a été contrôlée à l'aide du logiciel fastp47 (https://github.com/OpenGene/fastp, version 0.20.0) et du logiciel FLASH48 (http://www.cbcb.umd.edu/software/flash, version 1.2 .7) pour l'épissure. À l'aide du logiciel UPARSE (http://drive5.com/uparse/, version 7.1), les séquences ont été regroupées en OTU et les chimères ont été supprimées sur la base d'une similarité de 97 %. Les données ont été analysées sur la plateforme de cloud computing Megisense (http://cloud.majorbio.com/).

Analyse métabolomique non ciblée basée sur la chromatographie liquide ultra-performante et la spectrométrie de masse à temps de vol en tandem (UPLC/Q-TOF-MS/MS ; Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd). Des échantillons fécaux de 50 mg ont été placés dans 400 μL de solution d'extraction (acétonitrile : méthanol = 1:1) pour l'extraction, et 10 μL de surnageant ont été amenés à la machine pour analyse. Les phases mobiles consistaient en 0,1 % d'acide formique dans l'eau (solvant A) et 0,1 % d'acide formique dans l'acétonitrile : isopropanol (1:1, v/v) (solvant B). Le gradient de solvant évolue selon les conditions suivantes : de 0 à 3 min, 95 % (A) : 5 % (B) à 80 % (A) : 20 % (B), de 3 à 9 min, 80 % (A ) : 20 % (B) à 5 % (A) : 95 % (B), de 9 à 13 min, 5 % (A) : 95 % (B) à 5 % (A) : 95 % (B), de 13 à 13,1 min, 5 % (A) : 95 % (B) à 95 % (A) : 5 % (B), de 13,1 à 16 min, 95 % (A) : 5 % (B) à 95 % (A) : 5 % (B) pour équilibrer les systèmes. Le volume d'injection de l'échantillon était de 2 μL et le débit était fixé à 0,4 mL/min. La température de la colonne a été maintenue à 40°C. Les données de spectrométrie de masse ont été recueillies à l'aide d'un spectromètre de masse exactif Thermo UHPLC-Q équipé d'une source d'ionisation par électrospray (ESI) fonctionnant en mode ion positif ou négatif. Les spectres de masse de ces caractéristiques métaboliques ont été identifiés en utilisant la masse précise, les spectres de fragments MS/MS et la différence de rapport isotopique en recherchant dans des bases de données biochimiques fiables comme la base de données du métabolome humain (HMDB) (http://www.hmdb.ca/) et base de données Metlin (https://metlin.scripps.edu/). Les données prétraitées ont été analysées sur la plateforme de cloud computing Megisense (http://cloud.majorbio.com/).

Un chromatographe en phase gazeuse Thermo TRACE1310-ISQ LT équipé d'une colonne capillaire Agilent HP-INNOWAX a été utilisé pour cibler les acides gras à chaîne courte, notamment l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide butyrique, l'acide isobutyrique, l'acide valérique, l'acide isovalérique et l'acide caprique ( Suzhou Panomic Biopharmaceutical Technology Co., Ltd.). En bref, mélanger 50 mg d'échantillon fécal avec 50 μL d'acide phosphorique à 15 %, 100 μL 125 μg/mL de solution d'étalon interne (acide isocaproïque) et 400 μL d'éther et centrifuger à 4 °C pendant 10 min à 12 000 × g. Conditions chromatographiques49 : injection fractionnée, volume d'injection 1 μL, rapport de fractionnement 10:1. La température de l'entrée d'échantillon, de la source d'ions et de la ligne de transmission était de 250 °C, 300 °C et 250 °C, respectivement. La montée en température programmée a commencé à 90 °C, puis a augmenté jusqu'à 120 °C à 10 °C/min, puis a augmenté jusqu'à 150 °C à 5 °C/min, et enfin jusqu'à 250 °C à 25 °C. °C/min pendant 2 min. Le gaz porteur était de l'hélium avec un débit de 1,0 mL/min et une énergie électronique de 70 eV50. Les teneurs en AGCC ont été calculées selon les courbes d'étalonnage de chaque standard.

Les données ont été analysées statistiquement et représentées graphiquement à l'aide de Graphpad Prism 8.0, Majorbio Cloud Platform et Genes Cloud. La significativité des différences entre les deux groupes a été analysée par le test t. Pour les comparaisons entre 3 conditions ou plus, une ANOVA unidirectionnelle suivie des tests de comparaison multiple de Dunnett ou de Tukey a été utilisée. Une analyse de corrélation a été effectuée à l'aide de l'analyse de Pearson. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± (ET). P < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif. Toutes les expériences ont été répétées au moins trois fois.

Les ensembles de données présentés dans cette étude peuvent être trouvés dans des référentiels en ligne. Les noms du ou des référentiels et des numéros d'accès peuvent être trouvés ci-dessous : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA882947 pour le séquençage de l'ARNr 16S et http://www.ebi.ac. uk/metabolights/MTBLS5977, MTBLS5977 et http://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS5978, MTBLS5978 pour la métabolomique non ciblée et la métabolomique ciblée. Les autres données de l'étude actuelle sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable.

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Cette étude a été soutenue par la National Natural Science Foundation of China (32172189) et le National College Students Innovation and Entrepreneurship Training Program (202010193104).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Yue Li, Mengling Chen.

Collège des sciences et de l'ingénierie alimentaires, Université agricole de Jilin, 130118, Changchun, Chine

Yue Li, Mengling Chen, Yuxuan Ma, Yue Yang, Ying Cheng, Huijing Ma, Dayong Ren et Ping Chen

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RDY, CP et LY ont conceptualisé et conçu les expériences. LY a traité, analysé et interprété les données de séquence du gène de l'ARNr 16S et les données métabolomiques. LY, CML, MYX, YY, CY et MHJ ont mené des expériences et analysé des données. RDY et LY ont rédigé l'article avec les contributions de tous les auteurs. Tous les auteurs ont discuté des résultats et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Dayong Ren ou Ping Chen.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Li, Y., Chen, M., Ma, Y. et al. Régulation du probiotique viable/inactivé/lysé Lactobacillus plantarum H6 sur le microbiote intestinal et les métabolites chez la souris hypercholestérolémique. npj Sci Food 6, 50 (2022). https://doi.org/10.1038/s41538-022-00167-x

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Reçu : 04 mai 2022

Accepté : 11 octobre 2022

Publié: 31 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41538-022-00167-x

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