Structure et mécanisme de liaison au saccharose du transporteur de saccharose végétal SUC1

Nature Plantes (2023)Citer cet article

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L'importation de saccharose des tissus photosynthétiques dans le phloème est médiée par des transporteurs de la famille des transporteurs de saccharose de faible affinité (famille SUC/SUT). De plus, la redistribution du saccharose vers d'autres tissus est entraînée par le mouvement de la sève du phloème, le produit d'une pression de turgescence élevée créée par cette activité d'importation. De plus, les organes puits tels que les fruits, les céréales et les graines qui accumulent de fortes concentrations de sucre dépendent également de ce transport actif du saccharose. Nous présentons ici la structure du symporteur saccharose-proton, Arabidopsis thaliana SUC1, dans une conformation ouverte vers l'extérieur à une résolution de 2,7 Å, ainsi que des simulations de dynamique moléculaire et une caractérisation biochimique. Nous identifions le résidu acide clé requis pour l'absorption de saccharose induite par les protons et décrivons comment la protonation et la liaison du saccharose sont fortement couplées. La liaison du saccharose est un processus en deux étapes, la reconnaissance initiale étant médiée par le fragment glucosyle se liant directement au résidu acide clé d'une manière stricte dépendant du pH. Nos résultats expliquent comment le transport du saccharose à faible affinité est réalisé dans les plantes et identifient une gamme de liants SUC qui aident à définir la sélectivité. Nos données démontrent un nouveau mode pour le symport piloté par les protons avec des liens vers le symport piloté par les cations et fournissent un modèle large pour le transport général à faible affinité dans des environnements de substrat hautement enrichis.

Le saccharose est essentiel à la croissance et au développement des plantes, servant de métabolite central de la plante, avec des rôles supplémentaires associés en tant que molécule de signalisation1,2,3. Chez la plupart des espèces végétales, le saccharose est la principale forme de carbone assimilé produit lors de la photosynthèse. La distribution de saccharose sur de longues distances depuis les tissus sources verts, généralement les feuilles, jusqu'aux tissus récepteurs exigeants en énergie est médiée par le phloème4. Ici, les transporteurs de sucre de deux familles, la famille des transporteurs de saccharose (appelée famille SUT/SUC) et la famille SWEET, jouent un rôle central5,6,7,8. Alors que les sucres facilitateurs SWEET efflux, la charge active dépend des SUC qui utilisent la force motrice des protons de la membrane plasmique pour entraîner l'absorption du saccharose pour l'accumulation, avec des concentrations atteignant jusqu'à 1,3 molaire dans le phloème9,10,11,12,13,14. Le mouvement de la sève du phloème est le produit de la pression de turgescence élevée créée par cette activité SUC6,15. De plus, les organes puits, tels que les fruits et les graines, qui accumulent de fortes concentrations de sucre aux stades de développement dépendent également du transport actif du saccharose par les SUC15,16.

Les SUC font partie de la famille des symporteurs Glycoside-Pentoside-Hexuronide (GPH):cation qui appartient à la Superfamille des Facilitateurs Majeurs (MFS)17,18. Les membres de la famille GPH sont connus pour transporter une large gamme de substrats, des petites molécules solubles telles que le glucose, le mélibiose ou le saccharose aux grands lysolipides amphiphiles, normalement couplés au transport de cations monovalents19,20,21. Les SUC occupent une position unique dans la famille diversifiée des GPH en étant des transporteurs couplés à des protons et ont une très faible identité de séquence avec d'autres branches connues (<16%).

Malgré leur rôle clé dans les processus fondamentaux de la physiologie végétale, le mécanisme de fonctionnement des SUC reste inconnu. On ne sait pas comment les SUC reconnaissent le saccharose et comment le transport est couplé aux protons. Possédant la capacité de libérer du saccharose dans des environnements avec des concentrations de saccharose extrêmement élevées, le site de liaison du saccharose doit avoir des caractéristiques uniques ; en effet, son couplage au gradient proton moteur doit être étroit et bien coordonné. Arabidopsis thaliana possède neuf transporteurs SUC (SUC1–9), SUC1 étant parmi les premiers symporteurs saccharose–H+ identifiés (Extended Data Fig. 1)22,23,24,25,26,27,28. SUC1 est principalement exprimé dans les organes reproducteurs, les trichomes et les racines, où il se localise dans la membrane plasmique et est nécessaire au bon fonctionnement du pollen24,29,30,31,32,33.

Nous présentons ici la structure de A. thaliana SUC1 ainsi que des simulations complètes de caractérisation biochimique et de dynamique moléculaire (MD). Notre travail met en évidence des éléments clés pour comprendre le transport du saccharose couplé aux protons en expliquant la reconnaissance du substrat et comment les protons sont directement couplés au transport du saccharose dans un mécanisme unique. Ce mécanisme permet la liaison et la libération du saccharose dans des environnements à fortes concentrations molaires de saccharose, ce qui est vital pour le bon fonctionnement du phloème, le transport dans les tissus isolés par apoplastie et la croissance des plantes.

Pour examiner le mécanisme de transport des SUC, nous avons criblé une gamme de transporteurs SUC et identifié qu'A. thaliana SUC1 est stable et bien exprimé dans Saccharomyces cerevisiae (Extended Data Fig. 2a – d). Dans les tests d'absorption des ovocytes, SUC1 montre une absorption robuste du saccharose avec une constante de Michaelis apparente (Kmapp) de 1,28 mM (Fig. 1a et Extended Data Fig. 3a), comparable aux résultats précédents6,34. La protéine SUC1 purifiée a été reconstituée dans des liposomes et le transport a été mesuré à l'aide d'un couplage capacitif par électrophysiologie à membrane supportée solide (SSM). Cela a montré une affinité robuste mais faible similaire pour le saccharose in vitro, avec un Kmapp (essais d'électrophysiologie basés sur SSM dans les méthodes) de 19 mM à pH 5, 5 (Fig. 1b). Nous avons trouvé une forte dépendance au pH, le transport étant stimulé par une concentration accrue de protons in vivo et avec un optimum fonctionnel in vitro à un pH symétrique de 5, 5 (données étendues Fig. 3b, c).

a, test d'absorption des ovocytes pour SUC1 à pH 5, 5 avec ajustement non linéaire de Michaelis – Menten. Les points de données sont la moyenne ± sd ; les points représentent des mesures biologiquement indépendantes (n = 4 pour des concentrations de 0,8, 1,5, 6 et 15 mM ; n = 6 pour une concentration de 20 mM ; n = 9 pour des concentrations de 0,1 et 0,3 mM). b, Courants de crête déterminés par électrophysiologie basée sur SSM sur les protéoliposomes SUC1 à pH symétrique 5,5. Le transport peut être décrit par la cinétique de Michaelis-Menten. Les points de données sont la moyenne ± sd (n = 3 expériences biologiques indépendantes). L'insert montre des traces de courant brutes à une gamme de concentrations de saccharose. c, La carte de densité électronique 2,7 Å de SUC1 (carte 2mFo-DFc contournée à 1σ). Les densités correspondant aux domaines N et C sont respectivement colorées en cyan et orange. Les domaines EHR et IHR sont colorés en jaune pâle. d, Vue latérale de la structure de SUC1 dans le plan de la membrane plasmique, colorée selon les domaines. En bas, une vue de dessus du côté extracellulaire avec M1–M12 étiqueté. Le pont disulfure de connexion EHR – M6 est illustré. e, Topologie de SUC1. Les extrémités désordonnées N-terminale (résidus 1 à 24) et C-terminale (résidus 501 à 513) sont représentées par des tirets.

Données source

Nous avons procédé à la résolution de la structure de SUC1 en utilisant la cristallographie à une résolution de 2, 7 Å (Fig. 1c et Extended Data Fig. 2a – d). Dans l'unité asymétrique, SUC1 forme un dimère inversé non physiologique, avec les deux monomères dans la même conformation (écart quadratique moyen (rmsd) des atomes Cɑ = 0,1 Å). Une excellente densité de carte a permis la construction d'un modèle atomique final contenant les résidus 25 à 500 (sur 513 résidus) avec un facteur R libre (Rfree) de 29, 3% (Fig. 1c, Données étendues Fig. 4 et Tableau supplémentaire 1). Dans l'ensemble, SUC1 adopte le pli canonique du transporteur MFS avec douze hélices transmembranaires disposées en deux moitiés pseudosymétriques constituées de deux domaines à six hélices, le domaine N-terminal (domaine N, M1–M6) et le domaine C-terminal (domaine C, M7– M12) (Fig. 1d,e). Les deux domaines sont reliés par une courte région de liaison cytoplasmique de 26 résidus, qui sont bien définis dans la carte expérimentale. Il convient de noter que le lieur cytoplasmique contient une hélice ɑ amphipathique à 9 résidus (appelée région hélicoïdale intracellulaire (IHR)) (Fig. 1c – e et Extended Data Figs. 4 et 5a, b). Extracellulairement, une courte région hélicoïdale (appelée région hélicoïdale extracellulaire (EHR)), qui a également des propriétés amphipathiques claires, est présente dans la connexion en boucle entre M5 et M6. L'EHR est ancré sur le côté du domaine N par un pont disulfure entre les résidus strictement conservés Cys216 et Cys220 (Fig. 1d et Extended Data Figs. 4, 5a, c et 6). Nous avons exploré les rôles de l'IHR et de l'EHR par mutagenèse et avons constaté que l'activité de transport dans les ovocytes semble indifférente à la mutagenèse des résidus hydrophobes dans l'IHR (Extended Data Fig. 5b, d). Cependant, l'EHR du côté extracellulaire est très sensible aux changements. La perturbation de la courte liaison EHR – M6 en mutant Cys216 du pont disulfure entraîne une perte de transport. La mutation des trois résidus (Leu204, Met207 et Phe208) de l'EHR, qui apparaissent enfouis dans le feuillet membranaire, en résidus polaires de sérine donne une perte de transport similaire, impliquant un rôle important lors du transport pour cette région extracellulaire (Extended Data Fig. 5e).

La structure capture SUC1 dans une conformation ouverte vers l'extérieur avec un réseau électrostatique conservé entre les domaines N et C du côté cytosolique (Extended Data Figs. 6 et 7). Une grande cavité en forme de V clairement définie, qui s'étend sur environ les deux tiers du plan membranaire entre les domaines N et C, est ouverte du côté extracellulaire (Fig. 2a). Dans l'ensemble, la cavité est électronégative, mais elle devient électropositive vers le fond enveloppant. Malgré la présence de saccharose pendant la cristallisation, aucune densité définie pour la liaison du saccharose ne peut être observée dans la cavité.

a, vue en dalle de SUC1 montrant la conformation ouverte vers l'extérieur vue du plan de la membrane (à gauche) ou du côté extracellulaire (à droite). Les cases en pointillés font référence aux régions du site de liaison H+ et de la poche de liaison au saccharose. La surface est colorée par le potentiel électrostatique (kBT e−1). b, vue rapprochée du site de liaison des protons illustré en a. La distance entre la paire de résidus constituant le site du proton (Asp152 (rouge) et Gln50 (bleu)) est indiquée par la flèche en pointillés, 8,2 Å étant la distance la plus courte (de Asp152 ε-oxygène à Gln50 ε-oxygène/azote). c, test d'absorption des ovocytes pour les mutants SUC1 ciblant la poche du site du proton à trois valeurs de pH externes différentes. La boîte s'étend du 25e au 75e centile et la médiane est indiquée. Les moustaches s'étendent jusqu'à la valeur minimale et maximale. Les points représentent des expériences biologiquement indépendantes (n = 4 pour S78A (pH 3,5 et 5,5) et Q456A (pH 3,5); n = 5 pour WT (pH 4,5), eau (pH 3,5, 4,5 et 5,5), C74A (pH 5,5), S78A (pH 4,5) et Q456A (pH 4,5) ; et n = 6 pour WT (pH 3,5 et 5,5), W47A (pH 3,5, 4,5 et 5,5), Q50A (pH 3,5, 4,5 et 5,5), C74A (pH 3,5 et 4,5), D152N (pH 3,5, 4,5 et 5,5) et Q456A (pH 5,5)). Les couleurs correspondent aux résidus dans le panneau b. d, Traces de courant brut de l'électrophysiologie à base de SSM pour les protéoliposomes WT SUC1 (vert pâle à vert foncé), SUC1-D152N (rouge pâle à rouge foncé) ou SUC1-Q50A (bleu pâle à bleu foncé) provoqués par l'ajout de 30 mM de saccharose au pH symétrique indiqué. Les tracés représentent les courants de pointe. La boîte s'étend du 25e au 75e centile et la médiane est indiquée. Les moustaches s'étendent jusqu'à la valeur minimale et maximale (n = 3, les points de données sont des expériences individuelles). WT, type sauvage.

Données source

Le transport actif du saccharose par SUC1 est piloté par les protons et sensible au découpleur de protons carbonyle cyanure m-chlorophényl hydrazone dans les dosages d'ovocytes (données étendues Fig. 8a). Dans les transporteurs, les résidus acides enfouis dans la région transmembranaire sont généralement essentiels au transport des protons35. Dans les domaines transmembranaires de SUC1, le seul résidu acide est Asp152 (M4), qui est strictement conservé dans les SUC et donc le candidat principal en tant que résidu donneur/accepteur de protons pendant le symport (Fig. 2b et Extended Data Figs. 1 et 6) . Asp152 est exposé au solvant de la cavité sans aucun contact étroit avec d'autres résidus (Fig. 2b). La mutation d'Asp152 en une asparagine a entraîné une perte d'activité de transport sans affecter la localisation de la membrane plasmique in vivo (Fig. 2c et Extended Data Fig. 9). Comme prévu, ce mutant perturbe également la réponse actuelle autrement observée pour SUC1 de type sauvage dans les liposomes, soutenant son rôle clé en tant que donneur/accepteur central de protons (Fig. 2d et Extended Data Fig. 8b). Une autre exigence générale pour la translocation transmembranaire des protons est le contrôle du pKa du donneur/accepteur de protons, qui est souvent médié par un résidu chargé positivement35,36,37,38. Cependant, il n'y a pas de candidats évidents pour cette fonction dans l'état ouvert vers l'extérieur de SUC1.

Pour obtenir un état orienté vers l'intérieur, nous avons essayé d'utiliser différents outils de prédiction de la structure des protéines basés sur l'intelligence artificielle (IA), mais nous n'avons obtenu que des conformations orientées vers l'extérieur similaires à notre structure expérimentale (rmsd de Cɑ 1, 6–2, 5 Å). Cependant, dans la structure, nous avons identifié un réseau de ponts salins entre les domaines N et C du côté intracellulaire qui stabilise l'état ouvert vers l'extérieur (Extended Data Figs. 6 et 7a). La perturbation de ces interactions a conduit à une activité de transport inactive ou fortement réduite (Extended Data Fig. 7b). Nous avons déduit que la protéine avait été stabilisée dans l'état orienté vers l'intérieur par ces mutations et avons utilisé ces informations pour guider un outil de prédiction de la structure des protéines basé sur l'IA afin de générer la conformation ouverte vers l'intérieur (Extended Data Fig. 7a)39,40. Sur la base de cette prédiction de conformation ouverte vers l'intérieur, nous suggérons que le Gln50 (M1) strictement conservé est le candidat probable pour contrôler le pKa d'Asp152 (données étendues Fig. 7c). Bien qu'il soit à 8, 2 Å de l'aspartate dans la structure, Gln50 s'est déplacé par les mouvements de M1 pour créer des liaisons hydrogène avec Asp152 dans le modèle ouvert vers l'intérieur prédit (Fig. 2b et Extended Data Fig. 7c). La substitution de Gln50 à l'alanine a entraîné une perte d'activité de transport, comparable en ampleur à D152N dans les ovocytes (Fig. 2c). La mutation d'autres résidus à proximité n'a pas montré d'activité de transport réduite (Cys74) ou a montré une activité de transport quelque peu réduite (Ser78 ou Gln456), à l'exception de la substitution de Trp47, qui a entraîné une perte de transport comparable au mutant Q50A (Fig. .2c). De plus, comme le mutant D152N, le mutant Q50A a également montré la même perte de réponse actuelle et de dépendance au pH par rapport au SUC1 de type sauvage dans les liposomes (Fig. 2d). Sur cette base, nous proposons que Asp152 est l'accepteur/donneur de protons responsable de la translocation des protons pendant le symport qui peut impliquer Gln50 pour contrôler les changements de pKa dans le site du proton.

De là, nous avons concentré notre intérêt sur le site de liaison du saccharose situé dans la cavité en forme de V. Il existe clairement une gamme de résidus des domaines N et C dans la cavité et à proximité du site du proton qui pourraient participer à la liaison du saccharose (Fig. 3a).

a, Vue rapprochée de la poche de liaison du saccharose entourée de bleu, comme illustré à la Fig. 2a. b, Résultats de cinq répétitions de simulation MD indépendantes chacune pour Asp152(H) et Asp152(-), à partir de la pose de liaison stable identifiée pour le saccharose. Les répétitions montrent des résultats cohérents, comme résumé par la fraction de temps pendant laquelle le saccharose était lié dans la pose stable. À droite, la répétition 2 des simulations est représentée avec le saccharose comme épingle, la tête représentant le fragment glucosyle. Ci-dessous, le tracé rmsd du saccharose. L'arrière-plan du tracé rmsd indique la pose liée (bleu foncé) ou non liée (bleu clair) du saccharose. c, Carte de contact entre les atomes de saccharose et les résidus SUC1 dans MD run 2 avec Asp152(H). Seules les interactions se produisant pendant au moins 25 % du temps de simulation sont affichées, y compris les interactions de liaison hydrogène (bleu) et les interactions hydrophobes (rouge). d, instantané représentatif de la pose stable de saccharose dans des simulations avec Asp152(H). Les tirets bleus indiquent les liaisons hydrogène et les tirets rouges indiquent les interactions hydrophobes. e, Représentation schématique de la coordination du saccharose par SUC1 dans l'instantané présenté dans le panneau d. f, test d'absorption des ovocytes pour les mutants SUC1 ciblant les résidus tapissant la poche de liaison au saccharose. Les activités d'absorption sont normalisées à celles du type sauvage. Les barres représentent la moyenne ± écart-type Les points représentent des expériences biologiquement indépendantes (n = 5 pour Q44A et F184A ; n = 6 pour F298A, F427A, N449A et Q456A ; n = 7 pour N155A, N156A, R163A, M188A, F423A, S431A et I452A ; n = 10 pour W294A ; n = 12 pour WT et Q159A ; n = 14 pour T290A ; n = 18 pour Q83A). Les valeurs P pour les différences entre le type sauvage et les variants ont été obtenues à partir d'une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett. Les valeurs P sont indiquées sur la figure. NS, non significatif.

Données source

Pour évaluer le mode de liaison du saccharose et les rôles fonctionnels des résidus dans la poche de liaison centrale, des simulations MD avec une molécule de saccharose ont été réalisées pour identifier une pose de liaison stable du saccharose. À titre indicatif, une pose de départ pour le saccharose était basée sur l'homologue structurel le plus proche connu : le symporteur mélibiose/cation MelB lié à un analogue de mélibiose contenant du galactosyle, qui est proposé pour imiter un état lié au substrat (identité de séquence de 15,7 %) (Extended Données Fig. 10a). Nous avons effectué dix et cinq simulations indépendantes d'environ 1 µs chacune (14,3 µs au total) sur SUC1 avec soit un Asp152 protoné (Asp152(H)) soit un Asp152 déprotoné (Asp152(-)) et un saccharose placé dans le MelB-inspiré pose. Dans toutes les répétitions, la protéine a montré un comportement stable (Extended Data Fig. 10a, b).

La plupart de ces simulations n'ont pas capturé une pose de liaison statique au saccharose et le saccharose se déplacerait librement autour de la cavité. Cependant, dans l'une des répétitions avec Asp152 (H), le fragment glucosyle du saccharose s'est stabilisé dans une pose statique vers le domaine N pendant plus de 1 050 ns (Extended Data Fig. 10c). Pour examiner si cette pose ressemble à un événement de liaison initial stable de la molécule de saccharose, et si cela dépend de la protonation d'Asp152, cinq nouvelles simulations avec Asp152(H) ou Asp152(-) (10,6 µs au total) ont été réalisées avec du saccharose placé dans cette nouvelle position de liaison (Extended Data Fig. 10d). Dans quatre des cinq répétitions avec Asp152(H), le saccharose a maintenu une pose de liaison stable, alors qu'il était facilement et rapidement libéré dans les répétitions Asp152(-) (Fig. 3b et Extended Data Fig. 10e). De plus, dans les répétitions avec Asp152(H), le saccharose reviendrait à la pose de liaison identifiée après un événement de dissociation. La cartographie des contacts à partir des simulations indépendantes montre que, dans cette pose de liaison stable initiale, le saccharose interagit spécifiquement et directement avec son fragment glucosyle au niveau de l'Asp152(H) et des résidus Trp47, Gly75, Asn155 et Asn156 (Fig. 3c – e et Extended Data figure 10d). L'analyse des contacts montre clairement qu'il n'y a pas d'autres sites de liaison dont l'échelle est à distance comparable. La carte de contact montre que des liaisons hydrogène sont formées avec les hydroxyles de glucosyle aux positions O2, O3 et O4, ce qui confère la reconnaissance du substrat. De plus, les interactions hydrophobes contribuent à la liaison avec le glucosyle et, dans une certaine mesure, également avec le fructosyle initialement. Dans l'ensemble, les simulations identifient le groupe glucosyle du saccharose comme déclencheur de l'événement de liaison initial, créant une sélectivité initiale, et suggèrent donc qu'un Asp152(H) est crucial pour stabiliser la liaison du saccharose directement dans le transporteur.

Pour tester les interactions suggérées par MD et sonder leur importance fonctionnelle pour le transport, nous avons ensuite déterminé les caractérisations biochimiques des résidus proposés et des autres résidus tapissant la cavité (Fig. 3a, d – f). Nos résultats confirment que les résidus prédits comme centraux pour la liaison initiale sont essentiels pour le transport. La mutation d'Asn156 a entraîné une perte complète de transport dans les ovocytes, conformément à son rôle de premier plan dans la coordination de la partie glucose du saccharose (Fig. 3f). Pour le fragment glucosyle, la carte de contact a également identifié le squelette de Gly75, ainsi que les chaînes latérales de Trp47 et Asp152 (H), entraînant une perte d'activité de transport en cas de mutation (Fig. 2c). Pour les contacts fructosyle identifiés, la mutagenèse d'Asn155 a eu peu d'effet apparent sur l'activité de transport, indiquant la liaison hydrogène à ce résidu, et toute interaction spécifique avec le fragment fructosyle dans la pose de liaison initiale est de moindre importance pour le transport global. Pour les autres contacts identifiés, la mutation de Gln159 n'a eu aucun effet, alors que la mutation de Asn449 élimine le transport (Fig. 3c, f). Nous avons également ciblé des résidus dans le site de liaison identifié qui étaient proches de la liaison au saccharose, mais pas encore engagés dans celle-ci (Fig. 3a). La mutation des résidus polaires Gln83 et Thr290 n'a eu aucun effet négatif, tandis que la mutation des résidus polaires Gln44, Ser431 et Gln456 a considérablement réduit le transport (Fig. 3f). De plus, la mutagenèse des résidus hydrophobes Phe184, Trp294, Phe298, Phe423, Phe427 ou Ile452 a également réduit le transport (Fig. 3f). Fait intéressant, la mutation de Arg163 ou Met188 a entraîné une perte complète de transport, similaire à Asn449 qui est également située au fond de la cavité, indiquant ensemble un rôle pour ces trois résidus à l'état complètement occlus (Fig. 3f). Ensemble, ces données confirment que la pose de liaison stable au saccharose observée dans les simulations MD de SUC1 protoné représente un événement de liaison initial. La reconnaissance initiale du substrat par SUC1 se concentre sur les liaisons hydrogène avec le fragment glucosyle, tandis que d'autres résidus constituant la poche de liaison centrale jouent un rôle dans les étapes ultérieures du cycle de transport.

Pour étayer davantage ces résultats, nous avons testé la spécificité de substrat de SUC1 avec une large gamme de ligands putatifs différents, en utilisant à la fois des dosages d'ovocytes et une électrophysiologie basée sur SSM (Fig. 4a – c). Nous avons testé des molécules avec et sans glucosyle et avons constaté qu'un fragment glucosyle est un atout nécessaire pour les substrats, alors que le fragment fructosyle peut être remplacé plus facilement par des groupes cycliques ayant des propriétés polaires partielles (Fig. 4). Ces résultats sont cohérents avec le modèle de liaison selon lequel SUC1 interagit avec l'unité glucose du saccharose dans la pose de liaison stable initiale, et que la reconnaissance spécifique de l'unité fructose est moins importante pour l'activité de transport.

a, spécificité de substrat de SUC1 telle que déterminée par un test de compétition dans des ovocytes avec du saccharose 1 mM et 20 fois des substrats concurrents à pH 5, 5. Les valeurs P pour les différences entre le contrôle (absorption de saccharose sans compétition) et l'absorption de saccharose avec divers composés concurrents ont été obtenues à partir d'une ANOVA à une voie suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett. Les valeurs P sont indiquées sur la figure. Les barres sont moyennes ± sd Les points de données sont des expériences individuelles (n = 4 pour l'absorption de saccharose, sucralose, raffinose, sorbitol ; n = 5 pour tous les autres composés ; n = 7 pour aucune protéine). b, Spécificité de substrat de SUC1 mesurée à pH 5,5 par électrophysiologie à base de SSM. Courants de crête suscités par une gamme de substrats putatifs testés à 10 mM. Les courants de crête ont été normalisés par rapport aux courants induits par le saccharose après correction du signal d'artefact. Les valeurs P pour les réponses actuelles ont été obtenues à partir d'une ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett. Les valeurs P sont indiquées sur la figure. Les réponses de courant indiquées par * différaient significativement du saccharose, ce qui indique qu'elles ne sont probablement pas des ligands pour le transporteur, provoquent des courants de pointe plus faibles ou provoquent des réponses de courant de pointe plus élevées que le saccharose. Les barres sont moyennes ± sd ; n = 4. Les points représentent des mesures individuelles et toutes les mesures ont été effectuées sur un seul capteur. c, Structures chimiques des glycosides utilisés pour le criblage des substrats. Le dépistage comprend des monosaccharides (bleu), des disaccharides (vert), des oligosaccharides (jaune), des alcools de sucre (rose) et d'autres glucosides (orange). pNP-α-d-glc, p-nitrophényl alpha-d-glucopyranoside; pNP-β-d-glc, p-nitrophényl bêta-d-glucopyranoside.

Données source

Notre analyse structurelle, nos études fonctionnelles et nos données de simulation MD fournissent un modèle de la façon dont le saccharose est reconnu par SUC1 et identifient les éléments structurels clés, tels que le site de liaison aux protons, qui sont nécessaires à la fonction. L'accepteur/donneur de protons présumé Asp152 est strictement conservé chez les membres de la famille SUT/SUC (Extended Data Figs. 1 et 6) et a été signalé précédemment comme critique pour les courants de transport induits par le saccharose de SUC1 et pour l'orthologue de riz correspondant OsSUT1 ( réf. 31, 41). SUC1 affiche des différences claires par rapport aux autres symporteurs couplés à des protons connus et présente un modèle unique de symport. Premièrement, le couplage direct entre le site du proton et le site de liaison au substrat. Deuxièmement, Gln50 sur l'hélice M1 que nous suggérons contrôle le pKa de Asp152 sur l'hélice M4, rompant avec le schéma générique d'utilisation d'un résidu basique pour cette fonction comme observé dans d'autres transporteurs de protons14,35,42. En raison de ces deux facteurs, la liaison du sucre devient directement liée à la liaison du proton, permettant la libération de sucre dans un environnement à très forte concentration de saccharose, tant que le proton se dissocie. La configuration suggère un rapport de couplage étroit de 1: 1 entre le proton et le saccharose, conformément aux modèles cinétiques précédemment rapportés34,43. Nos données suggèrent que la protonation de Asp152 est nécessaire pour permettre une interaction polaire étroite du domaine N à la fraction glucosyle du substrat.

Ce couplage étroit et direct fournit un pivot central pour expliquer comment les membres de la famille SUT/SUC peuvent fonctionner à des concentrations extrêmes de saccharose au niveau molaire. La faible affinité de SUC1 est une condition préalable au transport de saccharose à haute capacité et ressort clairement des défis liés à la capture d'un état lié au substrat à la fois en cristallographie et en MD. Néanmoins, nos travaux suggèrent que la reconnaissance initiale du saccharose est médiée par les interactions du glucosyle avec le domaine N protoné. Ceci est en accord avec les découvertes précédentes selon lesquelles les groupes hydroxyle glucosyle sont au cœur de la reconnaissance du substrat44,45,46,47. Nous constatons également que les résidus dans les domaines N et C jouent un rôle important dans la poche de liaison centrale pendant le cycle de transport complet. La distribution des résidus contributeurs divise la poche de liaison en deux moitiés : une moitié contribue aux interactions polaires, principalement du domaine N ; tandis que la seconde moitié présente des propriétés hydrophobes, principalement du domaine C (Fig. 3a). Cela contraste avec le mode de liaison des transporteurs de glucose tels que les transporteurs de glucose animal (GLUT) et les protéines de transport de sucre (STP) végétales de la famille Sugar Porter. Ici, le domaine C assure la plupart des contacts par le biais d'interactions polaires avec le monosaccharide36,42,48,49. Dans les STP pilotés par les protons, le domaine N relie indirectement un site de proton distal à la liaison de haute affinité du glucose au site de liaison central36.

Dans la structure SUC1, l'Arg163 parfaitement conservé au fond de la cavité de liaison a un rôle de porte stabilisatrice en formant des liaisons hydrogène avec le squelette de Phe423(M10) et la chaîne latérale d'Asn181(M5). La substitution à une lysine n'a pas réussi à compléter l'activité de transport, indiquant un rôle central de l'arginine dans le transport (Extended Data Figs. 6 et 7). De plus, les hélices amphipathiques de l'EHR, stabilisées par un pont disulfure critique, et l'hélice amphipathique de l'IHR sont des caractéristiques structurelles distinctes. La perturbation de l'IHR dans les dosages d'ovocytes n'a eu aucun effet apparent, alors que la perturbation de l'EHR a éliminé l'activité. Des études antérieures ont montré que les agents oxydants augmentent l'activité de transport, tandis que l'acide p-chloromercuribenzènesulfonique, qui se lie de manière covalente au groupe SH des cystéines, inhibe fortement l'activité de transport5. Il a été proposé que ces observations soient liées à la dimérisation des SUC. Nos résultats ne traitent pas directement d'une éventuelle dimérisation, et les observations précédentes sur l'activité de transport peuvent être pleinement expliquées par le rôle clé que nous observons du pont disulfure à l'EHR. Cependant, le rôle exact de ces régions amphipathiques et toute relation avec une éventuelle dimérisation reste floue (Extended Data Fig. 5). L'architecture de SUC1 suggère également une fonction physiologique de la dépendance linéaire au pH et au potentiel de membrane que l'activité de transport de SUC1 présente6,34,50. Cette dépendance est différente par rapport à SUC2, par exemple, qui a un pH optimal canonique autour de pH 5,5 (réf. 6, 51). Comme SUC1 est lié aux tissus puits, où un transport rapide du saccharose postphloème est nécessaire pour contrôler la force du puits, une dépendance directe de 1: 1 à la liaison des protons pour le transport du substrat est significative. Le couplage étroit de protons observé dans SUC1 signifie que la concentration du substrat moteur, la concentration de protons, est linéairement liée à la translocation du saccharose et permet la libération contre un gradient de concentration élevé52. La modification du pH de l'apoplaste peut être utilisée de manière réactive par la plante pour réguler et optimiser l'activité de transport de SUC1, qui est soutenue par la faible capacité tampon passive de l'apoplaste51. L'acidification de l'apoplaste en concurrence avec les transporteurs de sucre d'agents pathogènes invasifs augmenterait à la fois la capacité de transport et l'affinité apparente de SUC1, tout en facilitant simultanément la réduction de l'activité des transporteurs d'agents pathogènes.

La famille GPH est une famille de symporteurs monovalents pilotés par des cations et notre travail explique comment cette architecture a été modifiée dans les plantes pour s'adapter au transport piloté par les protons. Dans les structures connues du symporteur bactérien mélibiose/Na+ MelB et du symporteur animal lysophosphatidylcholine/Na+ MFSD2A21,53,54, les résidus à la position équivalente à Asp152 font partie du site de liaison au sodium conservé, et MelB affiche même une promiscuité cationique qui, dans partie, détermine la sélectivité du substrat. La famille des transporteurs de solutés humains 45 (SLC45) est également liée à la famille SUT/SUC et pertinente pour la synthèse de mélanine et une gamme de maladies corrélées. Dans SLC45A2, la mutation du résidu équivalent à Asp152 provoque un albinisme oculocutané, soutenant à nouveau le rôle critique de l'aspartate dans les orthologues à travers les règnes55. De plus, le résidu équivalent à Arg163 joue un rôle important dans la liaison au substrat dans la structure MelB liée au ligand, et sa mutation dans le mammifère MFSD2A est mortelle, démontrant une fois de plus le rôle clé de cette position au sein de la famille GPH54,56.

Sur la base de nos données, nous proposons que les SUC fonctionnent selon un mécanisme d'accès alterné avec le modèle mécaniste suivant pour la reconnaissance du substrat dans le transport (Fig. 5). À l'état ouvert vers l'extérieur, une grande cavité est ouverte vers le côté apoplastique qui permet l'entrée du saccharose et des protons. Le saccharose se dépose avec le fragment glucosyle niché contre Asp152 et les résidus environnants (Fig. 3d – e). Cette liaison initiale de faible affinité au fragment glucosyle dépend de la protonation de Asp152. Après la liaison du saccharose et du proton, Arg163 et d'autres résidus de poche de liaison créent d'autres contacts de saccharose dans les étapes ultérieures de la reconnaissance du substrat. Cela forme un schéma de reconnaissance en deux étapes impliquant un site de reconnaissance initial du glucosyle et l'implication ultérieure d'Arg163 dans la translocation du saccharose, conformément aux études précédentes57. Cette configuration de reconnaissance explique également la promiscuité plus large du substrat vers le saccharide secondaire du substrat. Bien que le glucosyle soit relativement invariant, le fructosyle peut être échangé plus facilement (Fig. 4). Lors de la transition des transporteurs, le réseau intracellulaire de ponts salins est rompu, alors que, du côté extracellulaire, des résidus chargés et polaires forment probablement des contacts entre les hélices pour assurer la fermeture de la cavité du côté apoplastique et la stabilisation vers l'état intérieur, comme le prédit modèles et études de mutagenèse des ovocytes (données étendues Fig. 7a, b). Après ouverture vers l'intérieur, les changements de pKa dirigés par Gln50 conduisent à la déprotonation de Asp152 pour favoriser la libération de saccharose.

Les domaines N et C sont colorés selon la structure SUC1, avec M1, M4, M7 et M10 mis en évidence sous forme de dessins animés. Le saccharose est représenté en vert et bleu et le proton est représenté par une sphère bleue.

En conclusion, nos travaux identifient Asp152 comme site de liaison au proton dans la famille SUT/SUC et montrent comment la liaison du saccharose, avec reconnaissance initiale du glucosyle, est obtenue par un couplage direct à la liaison du proton sur ce site. Nous identifions les éléments clés et les propriétés de la fonction de transport et expliquons un mécanisme moléculaire central derrière la signalisation des sucres, les réponses au stress et la force motrice centrale derrière le mouvement vasculaire du saccharose et d'autres solutés dans les plantes vasculaires.

L'ADNc d'A. thaliana SUC1 (UniProt : Q39232) a été introduit dans une construction d'expression basée sur p423-GAL1 avec un site de clivage de thrombine C-terminal et une étiquette de purification de décahistidine. Les S. cerevisiae transformés (souche DSY-5) ont été cultivés dans un récipient de culture à haute densité par culture discontinue et récoltés après une induction de 22 h à l'aide de galactose58. Les cellules récoltées ont été lavées à l'eau froide, centrifugées et remises en suspension dans un tampon (Tris 100 mM pH 7, 5, NaCl 600 mM, fluorure de phénylméthylsulfonyle 1, 2 mM), puis battues avec des billes de verre de 0, 5 mm pour la lyse. L'homogénat a été centrifugé pendant 20 min à 17 568 g, suivi d'une sédimentation des membranes par ultracentrifugation à 200 000 g pendant 2 h. Les membranes cellulaires ont été homogénéisées et remises en suspension dans un tampon (Tris 50 mM pH 7, 5, NaCl 500 mM, 20% de glycérol) avant d'être congelées dans de l'azote liquide et stockées à -80 ° C. La membrane cellulaire décongelée a été solubilisée dans un tampon (NaCl 150 mM, Tris 50 mM pH 7,5, 5 % (v/v) de saccharose) avec 1 % (p/v) de n-dodécyl-β-d-maltoside (DDM) et 0,1 % (p/v) hémisuccinate de cholestérol (CHS) pendant 30 min à 4 oC. La matière insoluble a été éliminée par centrifugation à 5 000 g pendant 10 min et le surnageant a été filtré à l'aide d'un filtre de 1,2 μm (PALL). Le surnageant a été additionné d'imidazole 20 mM (pH 7,5) et chargé sur une colonne Ni-NTA de 5 ml (GE Healthcare) à 3 ml min-1. La colonne a été lavée avec 10 volumes de colonne de tampon (tampon de solubilisation additionné de 0,1 % de DDM, 0,01 % de CHS et 90 mM d'imidazole pH 7,5) et 20 volumes de colonne de tampon (20 mM Tris pH 7,5, 250 mM NaCl, 5 % (v /v) saccharose, 0,02 % (p/v) DDM, 0,002 % (p/v) CHS et 0,5 mM de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP)) additionné de 40 mM d'imidazole (pH 7,5). La protéine a été éluée dans le même tampon contenant 500 mM d'imidazole (pH 7,5) et les échantillons de protéines éluées ont été regroupés, additionnés de thrombine bovine, suivis d'une dialyse pendant une nuit à 4 ° C dans du tampon (20 mM d'acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES ) pH 6,0, NaCl 250 mM, saccharose 5 % (v/v), DDM 0,02 % (p/v), CHS 0,002 % (p/v) et TCEP 0,5 mM) en utilisant un seuil de poids moléculaire de 12 à 14 kDa ( MWCO) tubes (Spectrum). Le lendemain, la protéine a été additionnée de Tris 50 mM (pH 7,5) et chargée sur une colonne Ni-NTA de 5 ml (GE Healthcare) pour éliminer l'étiquette de purification et les contaminants. La protéine a été recueillie avec un tampon (20 mM Tris pH 7,5, 250 mM NaCl, 5 % (v/v) saccharose, 0,02 % (p/v) DDM, 0,002 % (p/v) CHS et 0,5 mM TCEP) additionné de 40 imidazole mM (pH 7,5), concentré à l'aide d'une colonne de centrifugation MWCO de 50 kDa (Vivaspin) et soumis à une colonne Superdex 200 Augmentation 10/300 GL (GE Healthcare) dans un tampon (MES 20 mM pH 6,0, NaCl 250 mM, 5 % (v /v) saccharose, 0,02 % (p/v) DDM, 0,002 % (p/v) CHS et 0,5 mM TCEP). La composition du tampon d'exclusion de taille a été optimisée pour la stabilité de l'échantillon59. Les fractions de pic ont été regroupées et la protéine a été concentrée à 14 mg ml-1 à l'aide d'une colonne de centrifugation MWCO de 50 kDa (Vivaspin).

SUC1 a été cristallisé dans la phase cubique lipidique. La protéine purifiée a été mélangée avec de la monooléine (Sigma) dans un rapport protéine/lipide de 1:1,5 à l'aide d'un mélangeur à seringue. Pour la cristallisation, 50 nl de la phase méso ont été mélangés avec 1000 nl de tampon de cristallisation contenant 43,5 % de polyéthylène glycol 400 (v/v), 0,25 M de dihydrogénophosphate d'ammonium et 0,15 M de bis-tris propane (pH 6,3) sur des plaques sandwich en verre en utilisant un robot Gryphon (Art Robbins Instruments). Les cristaux de la phase cubique lipidique sont apparus après 1 à 2 jours et ont atteint leur taille maximale de 100 × 10 × 30 µm à 19 ° C en 1 semaine. Les cristaux ont été recueillis à l'aide de Dual Thickness MicroMounts LD (MiTeGen) et congelés instantanément dans de l'azote liquide.

Après un examen approfondi, l'ensemble de données final a été collecté sur la ligne de faisceau microfocus Diamond Light Source I24 à l'aide d'un faisceau de 20 × 20 µm. Un monocristal a été diffracté sur 360° avec un angle d'oscillation de 0,10° avec des rayons X de longueur d'onde de 1,0 Å. L'ensemble de données a été traité et mis à l'échelle à l'aide de DIALS60 et AIMLESS61 via le pipeline XIA262 dans le groupe d'espace triclinique P1 (groupe ponctuel 1), ce qui a suggéré la présence de deux molécules SUC1 dans l'unité asymétrique avec une teneur en solvant d'environ 56 %. Pour tenter de résoudre le problème de phase, 65 modèles de recherche générés à partir de structures connues de membres MFS ont été utilisés pour le remplacement moléculaire. Cependant, aucune solution adaptée à la solution de structure n'a pu être obtenue. Le problème de phase a été résolu par remplacement moléculaire à l'aide de PHASER63 avec un modèle SUC1 prédit par RoseTTAFold64 ; Les estimations rmsd du modèle ont été converties en facteurs B avant les modifications finales du modèle de recherche à l'aide de SCULPTOR65. Cette recherche a donné une solution avec un score Z de fonction de traduction de 9 et un score de gain log-vraisemblance de 259 à un seuil de résolution de 3,5 Å, avec deux molécules dans l'unité asymétrique formant un dimère non physiologique avec un calcul Rfree initial de 52% dans Refmac66. Un raffinement initial avec Refmac et une modification de la densité avec correspondance d'histogramme, aplatissement du solvant et correction d'anisotropie ont été effectués pour réduire le biais du modèle de recherche avec Parrot67 dans la suite CCP468. La carte de densité électronique a permis la construction de modèles itératifs dans Coot69 et le raffinement à l'aide de phenix.refine à l'aide de cartes 2mFO-DFc et a généré des cartes améliorées de fonctionnalités70 à l'aide de phases de modèle. Nous avons effectué le raffinement final dans phenix.refine avec une stratégie de raffinement des sites individuels, des paramètres de déplacement atomique individuels (ADP) et des contraintes de translation-libration-vis de groupe (neuf groupes) et des contraintes de symétrie non cristallographiques par rapport à une cible de vraisemblance maximale avec des réflexions dans les 35 Plage de résolution –2,68 Å. Le modèle final a donné un facteur R libre (Rfree) de 29,30 % et un facteur R (Rwork) de 26,96 % (tableau supplémentaire 1). L'évaluation MolProbity71 du graphique de Ramachandran a donné 98,31 % dans les régions favorisées et 0,13 % de valeurs aberrantes. Les figures ont été préparées à l'aide de ChimeraX v.1.4 (réf. 72). Les alignements de séquences ont été construits avec PROMALS3D73. Les alignements ont été visualisés à l'aide d'ALINE v.1.0.025 (réf. 74). La conservation de la séquence évolutive a été analysée à l'aide de ConSurf75. Le potentiel électrostatique coulombique a été calculé dans ChimeraX v.1.4 (réf. 72).

L'extrait lipidique polaire de soja (composition (p/p), 45,7 % de phosphatidylcholine, 22,1 % de phosphatidyléthanolamine, 18,4 % de phosphatidylinositol, 6,9 % d'acide phosphatidique et 6,9 % d'autres lipides de soja) dans du chloroforme (Avanti) a été séché et remis en suspension dans un tampon de reconstitution (30 mM HEPES pH 7,4, NaCl 140 mM et MgCl2 5 mM). Les liposomes ont été homogénéisés par extrusion à travers des membranes en polycarbonate de taille de pores de 0,4 µm (Millipore) et du n-octyl-β-d-glucoside (Anatrace) a été ajouté à une concentration finale de 1 % (v/v). La suspension de liposomes a été soniquée au bain-marie trois fois pendant 1 min, avec une incubation sur de la glace pendant 1 min entre chaque sonication. La protéine purifiée a été ajoutée aux liposomes jusqu'à un rapport lipide/protéine calculé de cinq. Le détergent n-octyl-β-d-glucoside a été éliminé par incubation avec 400 mg ml-1 Bio Beads (Bio-Rad) pendant une nuit à 4 ° C à l'aide d'un agitateur rotatif. Les protéoliposomes (5 mg ml-1) ont été congelés rapidement dans de l'azote liquide et stockés à -80 ° C.

L'électrophysiologie basée sur SSM a été réalisée sur un SURFE2R N1 (Nanion Technologies). Pour toutes les expériences, la préparation des capteurs a été effectuée comme décrit76. Les protéoliposomes ont été dilués au 1: 5 dans un tampon non activateur, soniqués trois fois pendant 10 s dans un bain-marie et appliqués à des capteurs de 3 mm, suivis d'une centrifugation à 2 100 g pendant 30 min à 4 ° C. Pour les dosages de titrage du sucre, les tampons non activant et activant ont été préparés à partir du même tampon principal (tampon MgCl2 5 mM et phosphate de potassium 100 mM à une valeur de pH donnée). Le tampon non activateur a été additionné de 810 mM de mannitol, une molécule structurellement apparentée qui n'est pas transportée par SUC1. Le tampon d'activation a été préparé de manière équimolaire en ajoutant du saccharose 810 mM, suivi d'une dilution dans un tampon non activant pour maintenir l'osmolarité constante pour toutes les solutions utilisées au cours d'une expérience. Un seul workflow d'échange de solutions a été utilisé. Les points de données représentent la moyenne de trois mesures indépendantes. Pour les mesures de spécificité de substrat, des tampons non activant et activant ont été préparés à partir du tampon principal pH 5,5, le tampon d'activation contenant 10 mM du substrat d'intérêt. Le test a été effectué sur des membranes d'échantillon et de contrôle négatif pour distinguer les courants provenant de SUC1 et les courants d'artefact induits par les différents composants interagissant avec le SSM. Pour déterminer les courants de transport SUC1 pour chaque substrat individuel, les courants mesurés pour un substrat donné avaient la valeur moyenne du contrôle négatif correspondant soustrait de celui-ci. Les données représentent la moyenne de trois mesures indépendantes effectuées sur un seul capteur et ont été normalisées en fonction des mesures de saccharose. Pour la mesure dans des conditions de pH symétriques, une seule configuration d'échange de solution a été utilisée. L'échantillon a été incubé à un pH donné pendant 6 min entre les mesures à différentes valeurs de pH pour ajuster le pH interne des protéoliposomes au pH externe. Les courants de crête ont été mesurés lors de l'ajout d'un tampon d'activation au pH donné contenant 10 mM de saccharose. Pour chaque capteur, après des mesures à différentes valeurs de pH, le signal du capteur au pH neutre initial a été mesuré à nouveau pour évaluer la perte potentielle de signal pendant le titrage du pH, par exemple, causée par la diminution de la stabilité des protéines à différents pH. Ces amplitudes de signal étaient comparables aux mesures initiales, démontrant que l'activité du transporteur a été conservée tout au long de l'expérience. Les expériences ont été réalisées au moins en triple et les données ont été analysées avec GraphPad Prism v.9. L'ajustement de Michaelis – Menten a été utilisé pour l'analyse de l'ajustement de la courbe et la détermination de Km. Les barres d'erreur représentent le sd Comme le signal de courant de crête peut être un effet combiné d'événements électrogènes de liaison, de transport et de blindage ou de neutralisation des courants, nous utilisons le paramètre Kmapp uniquement pour le transport du saccharose dans tout le manuscrit, qui peut également être décrit comme le concentration efficace demi-maximale. Dans symport, nous avons plus d'un substrat, dans ce cas, le saccharose et H+. Pour tous les cas à deux substrats, la valeur Km pour un substrat est, en principe, déterminée par extrapolation à des concentrations infinies du second substrat. Ainsi, nous utilisons « app » dans Kmapp pour souligner que les valeurs de Km déterminées pour le saccharose s'appliquent spécifiquement au pH défini.

L'ADNc d'A. thaliana SUC1 (UniProt: Q39232) a été cloné dans le vecteur pNB1-U77 et la variante de fusion GFP du vecteur hébergeant un lieur glycine-sérine à dix résidus C-terminal suivi de la séquence de gène codant pour eGFP. Toutes les mutations ont été créées par mutagenèse dirigée avec une polymérase Q5 (New England Biolabs). Pour la préparation de l'ADNc, les gènes ont été amplifiés par PCR à l'aide d'amorces standard avec des régions non traduites en 5 'et 3' (avant, TTAACCCTCACTAAAGGGTTGTAATACGACTCACTATAGGG; inverse, TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATATCAAGCTAGCCTCGAG) suivi d'une purification par PCR (GeneJET PCR Purification, Thermo Fisher) après séparation sur gel d'agarose à 1%. L'ARN a été synthétisé par transcription in vitro à l'aide du kit de transcription mMESSAGE mMACHINE T7 (Thermo Fisher). Des aiguilles capillaires pour l'injection d'ARN ont été fabriquées à l'aide d'un extracteur de micropipette PC-10 (Narishige). Pour l'expression, des ovocytes de Xenopus laevis (EcoCyte Bioscence) ont été injectés chacun avec 25 ng d'ARN à l'aide du Nanoject III (Drummond Scientific), suivi d'une incubation à 16 °C pendant 3 jours dans du tampon ND-96 (96 mM NaCl, 1 mM MgCl2 , KCl 2 mM, CaCl2 1,8 mM, HEPES 5 mM pH 7,4) avec 10 UI ml-1 de gentamycine (Invitrogen). Pour les essais d'absorption dépendant de la concentration, des concentrations de saccharose allant de 0,1 à 20 mM dans un tampon de réaction ND-96 (NaCl 96 mM, MgCl2 1 mM, KCl 2 mM, CaCl2 1,8 mM, MES 5 mM pH 5,5) ont été utilisées et [14C ] du saccharose (PerkinElmer) a été ajouté à chaque solution de sucre à une concentration de 1 μCi ml-1. Avant les tests d'absorption, les ovocytes ont été lavés et pré-incubés pendant 5 min dans un tampon de réaction. Pour le test d'absorption, les ovocytes ont été incubés dans le tampon de réaction à une concentration donnée de saccharose pendant 30 min. Tous les dosages ont été effectués à pH 5,5 sauf indication contraire. La réaction a été arrêtée en ajoutant un tampon de réaction glacé additionné de 100 mM de saccharose suivi immédiatement d'un lavage des ovocytes dans un tampon de réaction glacé. Pour les contrôles, les ovocytes injectés avec de l'eau pure au lieu d'ARN ont été incubés de la même manière. Dans les tests de compétition, le tampon de réaction était composé de 1 μCi ml-1 [14C]saccharose, 0,5 mM de saccharose et une concentration 20 fois plus élevée du sucre concurrent (10 mM). Pour le test d'activité d'absorption des mutants et les tests d'absorption dépendant du pH, le tampon de réaction était composé de 1 μCi ml-1 [14C] saccharose et 1 mM de saccharose. Pour les dosages dépendant du pH, le tampon de réaction a été additionné de phosphate de potassium 50 mM ajusté au pH prévu ou de citrate 25 mM ajusté à pH 3,5, 4,5 ou 5,5 dans les dosages dépendant du pH des mutants. Pour les essais d'absorption en fonction du temps, une concentration de 675 μM de saccharose (Sigma-Aldrich) a été utilisée et du [14C] saccharose a été ajouté à une concentration finale de 1 μCi ml-1. Chaque ovocyte a été traité comme une seule expérience. Les ovocytes ont été transférés individuellement dans un flacon à scintillation et rompus par l'ajout de 100 μl d'une solution de SDS à 10% suivi d'un vortex immédiat. Un volume de 3 ml de fluide de scintillation OptiPhase HiSafe 3 (PerkinElmer) a été ajouté à chaque échantillon, et la radioactivité a été quantifiée à l'aide d'un compteur à scintillation liquide Tri-Carb 4910TR (PerkinElmer). Les expériences ont été réalisées au moins en trois exemplaires et les données ont été analysées à l'aide de GraphPad Prism v.9. L'ajustement de Michaelis – Menten a été utilisé pour l'analyse de l'ajustement de la courbe et la détermination de Km. Les barres d'erreur représentent le sd Pour déterminer si la localisation des protéines a été affectée par la mutagenèse ponctuelle, la localisation cellulaire a été analysée sur des types sauvages et des mutants fusionnés à l'eGFP C-terminal par microscopie confocale à balayage laser. Les images ont été capturées à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser Zeiss LSM 780 Axio Imager 2 avec le logiciel d'exploitation ZEN v.3.5. Nous avons utilisé l'objectif 10 × avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm en utilisant une puissance laser de 2, 55% avec un temps de trame de 7, 75 s, affichant un quart de tranche optique d'un ovocyte post-injection de 3 jours. Parce que nous avons plus d'un substrat dans le symport, les valeurs Kmapp ont été utilisées comme expliqué dans les tests d'électrophysiologie basés sur SSM.

Le modèle prédit de RoseTTAFold, que nous avons utilisé pour la mise en phase de remplacement moléculaire, et le modèle prédit d'AlphaFold v.2, affichent tous deux une conformation ouverte vers l'extérieur avec rmsd des atomes Cɑ à la structure expérimentale entre 1, 6 et 2, 5 Å. Ainsi, les modèles prédits par l'IA sont assez précis, du moins pour les parties centrales de la structure. Pour identifier les résidus qui pourraient être responsables de l'affectation du pKa d'Asp152 à l'état de protonation directe, nous avons utilisé AlphaFold v.2 (réf. 39) pour échantillonner des conformations alternatives de SUC1. Cela a été fait en réduisant la profondeur de l'alignement de séquences multiples d'entrée (MSA)40 et en modifiant la séquence de la protéine d'entrée SUC1 en introduisant des mutations d'alanine dans Arg99, Arg100 et Arg357, qui sont des résidus du réseau intracellulaire du réseau de ponts salins interdomaine qui stabilise SUC1 dans la conformation ouverte vers l'extérieur. Les exécutions de prédiction ont été exécutées à l'aide d'AlphaFold v.2.0.1 via le serveur ColabFold à l'aide du bloc-notes AlphaFold2_advanced78. Tous les MSA ont été obtenus à l'aide du serveur MMSeqs279 et le max_msa_clusters a été réduit à 32 clusters de séquences choisis au hasard et max_extra_msa a été réduit à 64 séquences supplémentaires qui ont été utilisées pour calculer des statistiques récapitulatives supplémentaires. Tous les modèles prédits ont été soumis à Amber-Relax après leur prédiction.

La chaîne A de la structure cristalline de SUC1 a été initialement traitée à l'aide de Maestro v.13.0. Les états de protonation des résidus ionisables ont été déterminés à l'aide de PROPKA80, où le côté apoplastique du transporteur était à pH 5 et le côté cytoplasmique était à pH 7. La liaison hydrogène a été optimisée lors de l'examen du choix des tautomères. Asp304 (pKa 7,47) a été modélisé comme protoné ; His65 (pKa 6,19), His205 (pKa 5,90) et His390 (pKa 6,25) ont été exposés au milieu apoplastique et ont donc été protonés à la fois sur Nδ et Nε du cycle imidazole. His89 (pKa 6,14) faisait face au cytoplasme et n'était protoné que sur Nε. Asp152 (pKa 6,50), situé dans la cavité centrale, a été considéré à la fois dans un état protoné (Asp152(H)) et déprotoné (Asp152(-)). Le pont disulfure observé a été modélisé entre Cys216 et Cys220.

SUC1 a été aligné avec l'axe z et placé dans une boîte cubique (90 × 90 × 118 Å3) et entouré de 188 lipides de 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycéro-3-phosphocholine dans un plan x – y. Le système protéine-membrane a été solvaté dans un potentiel intermoléculaire transférable avec de l'eau à 3 points (TIP3P)81 et un NaCl 150 mM neutralisant la charge.

Les coordonnées initiales du saccharose ont été consultées via le Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (identifiant chimique PRD_900003). Pour explorer le paysage conformationnel, une seule molécule de saccharose a été placée dans une boîte de dodécaèdre, solvatée avec de l'eau TIP3P81 et du NaCl 0,15 M et simulée à l'aide du champ de force CHARMM36m82 en trois répétitions et pendant 1 μs chacune.

Les poses conformationnelles du saccharose résultant de ces simulations ont été regroupées à l'aide de l'algorithme gromos83 mis en œuvre dans la suite d'analyse Gromacs84 avec une valeur de coupure de regroupement de 4 Å. La structure médiane du plus grand cluster, composé de la moitié de tous les cadres de simulation, a été prise comme une pose de saccharose représentative. Le placement de cette pose de saccharose dans la cavité centrale de SUC1 a été informé par un homologue bactérien mélibiose perméase MelB (PDB : 7L17 qui a été cocristallisé avec du 4-nitrophényl α-d-galactopyranoside54. Tout d'abord, les structures MelB et SUC1 ont été alignées en fonction des positions de atomes Cα du squelette. Ensuite, les carbones cycliques de la fraction glucosyle du saccharose ont été alignés avec les carbones cycliques du galactose présents dans la structure MelB. SUC1 a été modélisé avec deux états de protonation de Asp152 : Asp152 (-), résultant en une chaîne latérale chargée négativement , et l'état Asp152 (H) (non chargé). Les simulations pour les deux systèmes ont été lancées avec cette pose de saccharose identique inspirée de MelB (Extended Data Fig. 10a). Après environ 14 μs de simulations, la simulation qui présentait la liaison la plus stable du substrat (données étendues Fig. 10c), répétition 2 de Asp152 (H), a été utilisée pour extraire une pose de liaison stable au saccharose dans la cavité centrale de SUC1. La trajectoire de simulation a été alignée sur les atomes Cα initiaux du squelette protéique, l'algorithme de clustering gromos83 a été utilisé sur les valeurs rmsd des atomes lourds de saccharose avec une valeur de coupure de 3,8 Å et la structure médiane du plus gros cluster (représentatif de 78% des trames de la trajectoire) a été utilisée comme conformation de la liaison stable du saccharose poser dans SUC1. Une deuxième série de simulations a maintenant été lancée à partir de la pose de saccharose stable identifiée et dans les deux conditions de protonation d'Asp152 (Extended Data Fig. 10a).

Toutes les simulations ont été réalisées avec le champ de force CHARMM36m82 et dans le logiciel de simulation Gromacs 202084. Initialement, les systèmes ont été minimisés en utilisant l'algorithme de descente la plus raide jusqu'à ce que les forces convergent ou atteignent une valeur maximale de 500 kJ mol−1 nm−1. La température a été fixée à 296 K pour refléter les conditions de croissance d'A. thaliana. La température a été régulée à l'aide du thermostat Berendsen85 pendant l'étape d'équilibrage et d'un thermostat de remise à l'échelle de la vitesse86 pendant le cycle de production, le couplage de température étant appliqué sur trois groupes : la protéine avec le substrat, la membrane et le solvant. Pour les simulations de saccharose uniquement, il n'y avait que deux groupes couplés : saccharose et solvant. La pression de 1 atm a été maintenue à l'aide du barostat Berendsen85 lors des équilibrages, et du barostat Parrinello-Rahman87 lors des cycles de production. Toutes les simulations contenant une membrane avaient un type de couplage de pression semi-isotrope, tandis que les simulations contenant uniquement du saccharose étaient simulées de manière isotrope. Lors des cycles de production, le pas d'intégration de l'algorithme leapfrog a été fixé à 2 fs, tandis que l'algorithme de contrainte LINCS88 a été appliqué à toutes les liaisons associées aux atomes d'hydrogène du système. Le calcul des interactions électrostatiques à longue portée a été effectué à l'aide de la méthode d'Ewald à mailles de particules89,90, avec un seuil de 1,2 nm pour les interactions dans l'espace réel. La valeur de coupure pour les interactions de Van der Waals a été fixée à 1,2 nm, avec un modificateur de commutation de force appliqué à 1,0 nm. Tous les systèmes ont été équilibrés à l'aide du protocole standard CHARMM-GUI et avec des contraintes de position progressivement décroissantes, à partir de 4 000 kJ mol-1 nm-2 pour les atomes du squelette et les atomes du cycle de saccharose ; 2 000 kJ mol-1 nm-2 pour les atomes de la chaîne latérale de la protéine et les atomes lourds de saccharose restants ; et 1 000 kJ mol-1 nm-2 pour l'atome de phosphore de chaque lipide, les angles dièdres sélectionnés de la fraction glycérol et le segment à double liaison de la queue lipidique. Les équilibrages ont été exécutés pendant 250 ps dans un ensemble canonique (NVT), suivis de 1, 75 ns d'équilibrages d'ensemble isotherme-isobare (NPT). Les cycles de production de SUC1 dans la membrane ont été effectués sans aucune contrainte de position, par répétitions de cinq ou dix et jusqu'à une échelle de temps de la microseconde (Extended Data Fig. 10c).

La rmsd pour les atomes de protéine Cα a été calculée dans Gromacs84 par rapport à la structure cristalline de référence SUC1. La valeur rmsd pour le saccharose a été comparée à la pose de saccharose stable comme référence. Si une pose de saccharose avait une valeur rmsd inférieure ou égale à 3 Å, le substrat était considéré comme lié, tandis que des valeurs rmsd plus élevées désignaient la pose comme non liée. Les interactions protéine-saccharose ont été évaluées à l'aide du logiciel ProLIF91, dans lequel les liaisons hydrogène sont définies comme des interactions entre un donneur et un accepteur impliquant un hydrogène, à une distance de 3,5 Å et formant un angle compris entre 130 et 180°. Les interactions hydrophobes sont entre atomes non polaires placés à une distance inférieure ou égale à 4,5 Å. Les cartes de contact moyennées pour les systèmes Asp152(H) et Asp152(-) ont été générées en considérant les cadres de toutes les simulations à partir d'une pose de saccharose stable, en calculant la fréquence de chaque interaction dans tous les cadres et en visualisant uniquement les interactions qui se produisent pendant au moins 25 % du temps total de simulation.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Le modèle atomique et les facteurs de structure ont été déposés dans la Protein Data Bank (PDB : 8BB6). Les coordonnées MelB utilisées pour attribuer la position initiale du saccharose pour MD peuvent être téléchargées à partir de la Protein Data Bank (PDB: 7L17). La séquence de la protéine SUC1 pour A. thaliana utilisée dans cette étude est accessible au public sur UniProt (https://www.uniprot.org/) (UniProt : Q39232). Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions D. Stokes et U. Hammes pour leurs commentaires sur le manuscrit. Nous reconnaissons les lignes de lumière I24 et I04 à la source de lumière Diamond et la ligne de lumière BioMAX au laboratoire MAX IV, où les données de rayons X ont été collectées, et DESY-PETRA III pour le criblage de cristaux. Les calculs MD ont été effectués au cluster Grendel-S du Center for Scientific Computing Aarhus. Nous remercions également M. Nadzieja (Biologie Moléculaire Végétale, Département de Biologie Moléculaire et de Génétique, Université d'Aarhus) pour son enseignement en microscopie laser confocale. Les calculs MD ont été rendus possibles grâce à des subventions de la Fondation Novo Nordisk (NNF18OC0032608 et NF20OC0065431) et de la Fondation Lundbeck (R346-2020-1944) à BS Ce projet a reçu un financement du Conseil européen de la recherche dans le cadre du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne ( convention de subvention n° 101000936) à BPP

Département de biologie moléculaire et de génétique, Université d'Aarhus, Aarhus, Danemark

Laust Bavnhøj, Jan Heiner Driller et Bjørn Panyella Pedersen

Département de chimie, Université d'Aarhus, Aarhus, Danemark

Lorena Zuzic, Amanda Dyrholm Stange et Birgit Schiott

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LB a contribué à la préparation des échantillons. LB et BPP ont contribué à la collecte et à l'analyse des données structurelles. LB et JHD ont contribué aux tests d'activité. LZ, ADS et BS ont contribué aux simulations MD.

Correspondance avec Bjørn Panyella Pedersen.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Plants remercie John Ward et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Alignement entre A. thaliana SUC1 (numéro d'accès Q39232), SUC2 (numéro d'accès Q39231), SUC3 (numéro d'accès O80605), SUC4 (numéro d'accès Q9FE59), SUC5 (numéro d'accès Q9C8X2), SUC6 (numéro d'accès Q6A329), SUC7 (numéro d'accès numéro Q67YF8), SUC8 (numéro d'accès Q9ZVK6), SUC9 (numéro d'accès Q9FG00). Les résidus conservés sont mis en évidence avec une échelle de gris, où le noir est parfaitement conservé. Les tubes colorés représentent les hélices α trouvées dans le domaine N (cyan), EHR et IHR (gris) et le domaine C (orange). Les résidus clés sont numérotés au-dessus des marques d'hélice a. Les résidus clés sont surlignés en vert, à l'exception de la paire donneur/accepteur de protons en rouge (Asp152) et bleu (Gln50). Les cystéines formant le pont disulfure entre EHR et M6 sont surlignées en jaune. Les motifs A qui désignent la superfamille MFS sont surlignés en bleu clair. Le site de phosphorylation post-traductionnelle au N-terminal92 est coloré en magenta clair. La mutation de ce résidu de site (Ser20) en alanine dans SUC1 n'a pas affecté l'absorption dans les ovocytes par rapport au type sauvage (données étendues Fig. 7b).

a, profil de chromatographie d'exclusion de taille de SUC1 et gel SDS-PAGE représentatif de la protéine SUC1 purifiée. Des expériences indépendantes ont été répétées trois fois avec des résultats similaires. b, Photo en lumière polarisée et photo en champ clair de cristaux SUC1 dans une configuration en phase cubique lipidique. Des expériences indépendantes ont été répétées trois fois avec des résultats similaires. c, Unité asymétrique et garniture cristalline de SUC1. d, L'épine dorsale de SUC1 colorée par le facteur de déplacement atomique (facteur B) avec un gradient arc-en-ciel de bas/bleu (29,91 Å2) à haut/rouge (103,48 Å2) avec une moyenne de 47,10 Å2.

a, Absorption de saccharose dans les ovocytes exprimant SUC1 (cercles noirs) et les ovocytes injectés d'eau (cercles vides) à une concentration extérieure initiale de 1 mM de saccharose à pH 5,5. Les points de données sont la moyenne ± sd ; n = 4 ovocytes et chaque ovocyte représente des mesures individuelles. b, le test d'absorption des ovocytes affiche une dépendance au pH classique qui évolue linéairement avec la concentration de protons externes sur la plage viable de la configuration expérimentale. Le transport a été mesuré à pH 3,5–9,5 dans un tampon phosphate. Toutes les mesures ont été effectuées en présence de 1 mM de saccharose. Les barres sont moyennes ± sd ; Les points de données sont des expériences individuelles (n = 4 (pH 3,5, 4,5, 5,5), n = 5 (pH 8,5, 9,5), n = 6 (pH 6,5, 7,5). c, Courants de crête utilisant l'électrophysiologie SSM pour le SUC1 WT protéoliposomes suscités par l'addition de 10 mM de saccharose au pH symétrique indiqué (pHin = pHout) Les barres représentent la moyenne ± sd et n = 4. Les points sont des mesures individuelles.

Données source

Densité pondérée de 2mFo-DFc à 1σ de la structure ouverte vers l'extérieur de SUC1 (monomère, chaîne A) avec les éléments du modèle final superposés, y compris M1 à M12, l'hélice EHR, le pont disulfure C216-C220, l'hélice IHR et le modèle complet représenté sous forme de réglisse avec de l'eau ( points rouges) inclus.

a, Vues latérales de la structure SUC1 avec potentiel de lipophilie moléculaire (MLP) représentée sous forme de surface moléculaire et colorée du cyan foncé (le plus hydrophile) à la verge d'or foncée (le plus lipophile). Les encarts mettent en évidence les régions hélicoïdales au niveau des folioles de la membrane plasmique. Les limites membranaires (feuillet externe ; bleu, feuillet intérieur ; rouge) ont été calculées à l'aide du serveur Web PPM93. b, Région hélicoïdale intracellulaire amphipathique (IHR) représentée sous forme de bande dessinée avec des résidus marqués sous forme de bâtonnets (à gauche) colorés en fonction de la lipophilicité comme dans le panneau A et diagramme de projection de la roue d'Edmundson des résidus de la région hélicoïdale avec des résidus hydrophobes faisant face au feuillet interne de la membrane plasmique et les résidus polaires faisant face au cytoplasme (à droite). c, région hélicoïdale extracellulaire amphipathique (EHR) représentée sous forme de bande dessinée et de résidus étiquetés sous forme de bâtonnets (à gauche) colorés en fonction de la lipophilie comme dans le panneau A et diagramme de projection de la roue d'Edmundson des résidus de la région hélicoïdale avec des résidus hydrophobes faisant face au feuillet externe de la membrane plasmique et les résidus polaires faisant face à l'apoplaste. d, test d'absorption des ovocytes pour les mutants SUC1 ciblant l'IHR. Les activités d'absorption sont normalisées à celles du type sauvage. Le contrôle est constitué d'ovocytes injectés d'eau. Les barres représentent la moyenne ± écart-type Les points de données sont des expériences individuelles (n = 6 (I272S/F273S,E271A,F276S), n = 7 (L268S/F269S), n = 11 (L268S/F269S/I272S/F273S/F276S), n = 16(WT)). Les valeurs P pour les différences entre le type sauvage et les variants provenaient d'une analyse ANOVA à un facteur suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett (p = 0,9145 (L268S/F269S/I272S/F273S/F278S), p = 0,2915 (I272S/F273S), p = 0,8544 (F276S), p = 0,6264 (E271A)). e, test d'absorption des ovocytes pour les mutants SUC1 ciblant l'EHR. Les activités d'absorption sont normalisées à celles du type sauvage. Le contrôle est constitué d'ovocytes injectés d'eau. Les barres sont moyennes ± sd Les points de données sont des expériences individuelles (n = 3 (L204S/M207S, F208S), n = 6 (L204A/M207A/F208A), n = 7 (C216A), n = 16 (WT)). Les valeurs P pour les différences entre le type sauvage et les variants provenaient d'une analyse ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett (p = 0,4290 (L204A/M207A/F208A)).

Données source

Conservation des résidus dans SUC1 (représentés sous forme de dessin animé) entre les séquences SUC (avec 35 à 95 % de séq. ID à SUC1) à travers les espèces végétales telles qu'obtenues par ConSurf. Les résidus (représentés sous forme de bâtonnets) sont colorés de variable (cyan) à entièrement conservé (magenta).

a, Résidus chargés extracellulaires et intracellulaires avec des résidus marqués impliqués dans la formation de ponts salins (police noire) ou des liaisons hydrogène (police grise) dans la structure cristalline ouverte vers l'extérieur SUC1 et dans l'état ouvert vers l'intérieur prédit par AlphaFold2 SUC1. Les tirets jaunes indiquent les liaisons hydrogène (seuils de distance et d'angle pour la liaison H tels que définis par les paramètres par défaut dans chimeraX v1.4). b, Test d'absorption des ovocytes pour les mutants SUC1 ciblant les liaisons hydrogène et les réseaux de ponts salins observés dans la structure (réseau intracellulaire) ou prédits (réseau extracellulaire prédit), ainsi que le site de phosphorylation de SUC1 sur Ser20 (site P). Les activités d'absorption sont normalisées à celles du type sauvage. Les barres sont des moyennes ± sd Les points de données sont des expériences individuelles (n = 5 (D304N), n = 6 (D123N, R139A), n = 7 (H65K, D91N, R163K, D306N, E353Q), n = 10 (S20A), n = 13 (WT)). Les valeurs P pour les différences entre le type sauvage et les variants provenaient d'une analyse ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett (p = 0,1624 (S20A), p = 0,9729 (H65K)). Les couleurs correspondent à la position des résidus sur la figure 1e. c, prédiction AlphaFold2 du modèle ouvert vers l'intérieur SUC1 (gris) superposée à la structure cristalline ouverte vers l'extérieur SUC1 déterminée expérimentalement (cyan). Les tirets jaunes indiquent des liaisons hydrogène et la flèche grise indique un mouvement majeur de l'hélice M1 avec Gln50 (seuils de distance et d'angle pour la liaison H tels que définis par les paramètres par défaut dans chimeraX v1.4).

Données source

a, test d'absorption des ovocytes sans ou avec addition de CCCP 20x (20 mM) (gris clair) à pH 5,5. Des ovocytes injectés d'eau (sans protéine) ont servi de témoin pour l'absorption. Les valeurs P pour les différences entre le contrôle (absorption de saccharose) et l'absence de protéine et de CCP provenaient d'une analyse ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett. Les valeurs P sont indiquées sur la figure. Les barres sont moyennes ± sd ; Les points de données sont des expériences individuelles (n = 4 (absorption de saccharose), n = 5 (CCCP), n = 7 (pas de protéine)). b, courants de crête déterminés par SSM-électrophysiologie sur les protéoliposomes SUC1 à des valeurs de pH symétriques comme indiqué. Le transport a été décrit par la cinétique de Michaelis-Menten en effectuant une analyse d'ajustement non linéaire. Les cercles gris montrent les courants de pointe d'un capteur préparé avec des liposomes vides de protéines. Les points de données sont la moyenne ± sd (n = 3 expériences biologiquement indépendantes).

Données source

SUC1 et les mutants correspondants hébergeant une GFP C-terminale montrent une localisation similaire à la membrane plasmique des ovocytes de Xenopus laevis. Des expériences indépendantes ont été répétées deux fois avec des résultats similaires.

a, Organigramme de l'analyse MD. b, rmsd Cα trace dorsale au cours de toutes les simulations MD. Toutes les pistes par rapport à la structure cristalline. c, Comparaison de l'évolution temporelle de la rmsd du saccharose à partir des simulations initiales réalisées avec du saccharose dans la pose de départ "inspirée de MelB", avec Asp152 protoné (Asp152(H)) ou déprotoné (Asp152(-)). La liaison stable du saccharose à SUC1 est indiquée par un fond bleu foncé. d, cartes de contact entre les atomes de saccharose et les résidus SUC1 dans les cinq répétitions exécutées avec du saccharose commençant dans la pose stable identifiée. Les contacts calculés entre atomes sont définis par les critères d'interaction fournis par le logiciel ProLIF91. Seules les interactions se produisant dans au moins 25 % des cadres sont prises en compte et incluent les interactions de liaison hydrogène (bleu) et les interactions hydrophobes (rouge). e, Comparaison de l'évolution temporelle de la rmsd du saccharose à partir de simulations effectuées avec du saccharose dans la pose de départ stable identifiée, également représentée sous la forme d'une aiguille/épingle avec une tête représentant la fraction glucosyle, avec deux états de protonation différents d'Asp152 : Asp152(H) et Asp152 (-) en cinq répétitions indépendantes, respectivement. L'arrière-plan du tracé rmsd indique la position liée (bleu foncé) ou non liée (bleu clair) du saccharose.

Tableau supplémentaire 1. Collecte de données et statistiques de raffinement.

Test d'absorption, comptages bruts par minute. Électrophysiologie SSM, courants de pointe.

Test d'absorption, comptages bruts par minute. Électrophysiologie SSM, courants de pointe.

Test d'absorption, comptages bruts par minute.

Test d'absorption, comptages bruts par minute. Électrophysiologie SSM, courants de pointe.

Test d'absorption, comptages bruts par minute. Électrophysiologie SSM, courants de pointe.

Test d'absorption, comptages bruts par minute.

Test d'absorption, comptages bruts par minute.

Test d'absorption, comptages bruts par minute. Électrophysiologie SSM, courants de pointe.

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Réimpressions et autorisations

Bavnhoj, L., Driller, JH, Zuzic, L. et al. Structure et mécanisme de liaison au saccharose du transporteur de saccharose végétal SUC1. Nat. Plantes (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-023-01421-0

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Reçu : 21 novembre 2022

Accepté : 19 avril 2023

Publié: 15 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41477-023-01421-0

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Plantes naturelles (2023)