Destin moléculaire

Nature volume 615, pages 482–489 (2023)Citer cet article

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L'efficacité protectrice des anticorps sériques résulte de l'interaction de clones de cellules B spécifiques d'un antigène d'affinités et de spécificités différentes. Ces dynamiques cellulaires sous-tendent des phénomènes sériques tels que le péché antigénique originel (OEA) - une propension proposée du système immunitaire à s'appuyer de manière répétée sur la première cohorte de cellules B engagées par un stimulus antigénique lors de la rencontre d'antigènes apparentés, au détriment de l'induction de réponses de novo1,2,3,4,5. La suppression de type OAS des nouveaux anticorps spécifiques aux variants peut constituer un obstacle à la vaccination contre des virus à évolution rapide tels que la grippe et le SRAS-CoV-26,7. La mesure précise de la suppression de type OAS est difficile car les origines cellulaires et temporelles ne peuvent pas être facilement attribuées aux anticorps en circulation ; son effet sur les réponses anticorps ultérieures reste donc incertain5,8. Ici, nous introduisons une approche de cartographie du destin moléculaire avec laquelle les anticorps sériques dérivés de cohortes spécifiques de cellules B peuvent être détectés de manière différentielle. Nous montrons que les réponses sériques au rappel séquentiel homologue dérivent en très grande majorité des cellules B de la cohorte primaire, tandis que l'induction ultérieure de nouvelles réponses d'anticorps à partir de cellules B naïves est fortement supprimée. Une telle « dépendance primaire » diminue fortement en fonction de la distance antigénique, permettant la réimmunisation avec des glycoprotéines virales divergentes pour produire des réponses anticorps de novo ciblant les épitopes qui sont absents de la variante d'amorçage. Nos découvertes ont des implications pour la compréhension de l'OAS et pour la conception et les tests de vaccins contre les agents pathogènes en évolution.

La capacité des anticorps sériques à protéger contre l'infection est une propriété émergente du mélange complexe d'immunoglobulines sécrétées au fil du temps par des clones de cellules B de diverses spécificités et d'une gamme d'affinités. Les plasmocytes qui produisent ces anticorps passent par de multiples voies parallèles, allant de la différenciation directe à partir de précurseurs de lymphocytes B naïfs après une primo-infection ou une immunisation à des voies élaborées impliquant un ou plusieurs cycles de maturation d'affinité dans les centres germinatifs (GC) et l'intercalation des phases de cellules B mémoire. . La complexité de ces voies cellulaires se combine nettement avec l'exposition antigénique répétée9,10,11,12, et leur contribution ultime au pool d'anticorps sériques a été difficile à déconvoluer. D'une part, les analyses moléculaires des gènes d'immunoglobuline obtenus à partir de cellules mémoire ou GC B n'évaluent pas directement la composition des anticorps dans le sérum13,14,15,16 ; d'autre part, les études directes de la composition clonale des anticorps sériques ne permettent pas d'attribuer facilement une origine cellulaire ou temporelle à des anticorps de spécificités différentes17,18. La dynamique clonale des phénomènes immunitaires qui se déroulent au niveau sérique reste donc mal connue.

Un phénomène au niveau sérique qui a été particulièrement difficile à démêler est l'OAS, décrit dans les années 1950 comme une tendance des individus exposés à une souche donnée de grippe à répondre avec des anticorps qui réagissent plus fortement à la première souche de grippe qu'ils ont rencontrée au début. l'enfance qu'à la souche d'exposition elle-même1,19. L'OAS a été initialement attribuée à une propension du système immunitaire à réutiliser à plusieurs reprises la première cohorte de cellules B qui répondent à un antigène, dont la réactivité sera nécessairement biaisée en faveur de la souche qui l'a initialement provoquée. Cependant, contrairement aux concepts apparentés tels que l'ancienneté antigénique4,20, l'OAS (tel que défini ici) nécessite la suppression active du recrutement de novo de nouveaux clones de lymphocytes B à partir du répertoire naïf après rappel2,3,4, limitant ainsi la capacité du système immunitaire pour monter des réponses d'anticorps spécifiques pour échapper aux épitopes. La mesure dans laquelle cette suppression active existe et influence les réponses ultérieures est débattue depuis des décennies5,8. Plus récemment, des expériences de cartographie du destin des cellules B chez la souris ont montré que, contrairement aux prédictions de l'OAS, les GC qui se forment en réponse au rappel sont presque exclusivement constitués de cellules B naïves plutôt que dérivées de la mémoire21,22,23. Ce dernier ajout implique soit que les effets de l'OAS chez la souris sont négligeables, soit que l'OAS est un phénomène observé exclusivement au niveau sérique.

La résolution de ce problème, ainsi que la compréhension générale de l'effet de l'OAS sur la réponse à une exposition répétée à l'antigène, nécessiterait la capacité de transposer ces expériences de cartographie du destin cellulaire à l'anticorps sérique lui-même. Pour y parvenir, nous avons adapté la stratégie classique de cartographie du destin pour permettre la détection de l'origine cellulaire et temporelle des anticorps dans le sérum, une approche que nous appelons la cartographie du destin moléculaire. Nous avons conçu des souris dans lesquelles l'extrémité C-terminale du gène de la chaîne légère de l'immunoglobuline kappa (Igκ) (Igk) est étendue pour coder une étiquette Flag flanquée de LoxP, suivie d'une étiquette Strep en aval (Fig. 1a et Extended Data Fig. 1). Les cellules B portant cet allèle «Κ-tag» produisent des immunoglobulines qui sont marquées Flag à moins qu'elles ne soient exposées à la recombinase Cre, après quoi elles changent définitivement la balise Flag pour une balise Strep. La recombinaison médiée par Cre cartographie donc le destin des anticorps que ces lymphocytes B et leurs descendants de plasmocytes expriment à leur surface et/ou sécrètent dans le sérum. Cela permet une détection différentielle des anticorps Igκ+ avant et après la cartographie du destin à l'aide de réactifs secondaires spécifiques à chaque étiquette.

a, Schéma de l'allèle IgkTag (K-tag) avant et après la recombinaison médiée par Cre. UTR, région non traduite. b, Analyse par cytométrie en flux des lymphocytes B sanguins montrant l'expression des récepteurs des lymphocytes B marqués Flag et Strep sur des souris du génotype indiqué. c, analyse Western blot de sérum obtenu à partir de souris du génotype indiqué, colorées pour la chaîne légère d'Igκ ou les étiquettes Flag/Strep. Représentant de deux expériences. d, Schéma de la stratégie d'immunisation utilisée pour cartographier le destin des cellules GC B et leur production d'anticorps. e, Analyse par cytométrie en flux du ganglion lymphatique poplité 12 jours après l'immunisation du coussinet plantaire avec du TNP-KLH dans un adjuvant à l'alun. Les cellules B (B220 + CD4 - CD8 - CD138 -) ont été colorées pour les marqueurs GC (Fas + CD38 -) et folliculaires (Fo) B (Fas - CD38 +). f, Quantification des données en e. Chaque point représente un ganglion lymphatique individuel et les barres représentent les valeurs médianes. g, IgG totales anti-TNP et titres au point final spécifiques à l'étiquette tels que déterminés par ELISA TNP4-BSA chez des souris immunisées ip avec TNP-KLH dans un adjuvant alhydrogel. Les lignes fines représentent les souris individuelles et les lignes épaisses relient les médianes des valeurs de titre transformées en log à chaque instant. Les résultats proviennent de neuf souris issues de deux expériences indépendantes. Tmx., tamoxifène. h, L'affinité relative des anticorps anti-TNP Flag+ et Strep+ des mêmes échantillons montrés en g telle qu'estimée par ELISA en utilisant TNP1-BSA ou TNP13-BSA comme réactifs de capture. Les données sont la moyenne ± sem des valeurs de titre transformées en log. Le rapport entre les titres anti-TNP1-BSA et anti-TNP13-BSA a été calculé par échantillon, indiqué à droite.

Pour vérifier la fonctionnalité de l'allèle Κ-tag, nous avons d'abord déterminé que les cellules B chez les souris IgkTag exprimaient des récepteurs de cellules B marqués à leur surface. Suivant les règles d'exclusion allélique24, environ 50 % et 95 % des lymphocytes B des souris exprimant des Igk hétérozygotes (type sauvage (WT)/tag) ou des souris homozygotes IgkTag/Tag étaient Flag+ (comme prévu, environ 5 % des lymphocytes B chez les souris homozygotes les souris portaient une chaîne légère d'Igλ24 ; Données étendues Fig. 2a). Les souris Κ-tag dans lesquelles toutes les cellules B exprimaient de manière constitutive la recombinase Cre (IgkTag / TagCd79aCre / +) ont remplacé Flag par une étiquette Strep dans presque toutes les cellules B Igκ + (Fig. 1b). Il est important de noter que les souris Κ-tag ont sécrété de manière appropriée des anticorps marqués Flag ou Strep dans le sérum en l'absence ou en présence de recombinase Cre, respectivement (Fig. 1c), sans affecter les taux d'anticorps sériques à l'état d'équilibre (Extended Data Fig. 2b). La génération et la maturation des cellules B Κ-tag n'ont pas été altérées, comme l'indique la proportion égale de cellules B circulantes marquées et non marquées chez les souris IgkWT / Tag (Fig. 1b). Il en était de même pour les cellules B circulantes et les plasmocytes de la moelle osseuse exprimant les étiquettes Flag et Strep dans IgkFlag / Strepmice, dans lesquelles l'un des deux allèles Κ-tag était prérecombiné par l'expression de Cre dans la lignée germinale (Fig. 1b et Extended Data Fig. 2c).

Pour s'assurer que les lymphocytes B Flag+ et Strep+ étaient également compétitifs tout au long de l'activation des lymphocytes B, de la maturation par affinité et de la différenciation des plasmocytes, nous avons amorcé et boosté les souris IgkFlag/Strep avec l'antigène modèle 2,4,6-trinitrophényl-hémocyanine de patelle ( TNP-KLH) dans un adjuvant à l'alun et suivi les titres sériques d'anticorps portant chaque étiquette au fil du temps. Pour permettre une comparaison directe des titres d'anticorps anti-TNP portant chaque étiquette, nous avons dilué des anticorps secondaires (anti-Flag ou anti-Strep) pour obtenir une détection similaire des courbes standard générées à l'aide d'anticorps monoclonaux recombinants marqués Flag ou Strep (Extended Data figure 2d). Les titres ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) au point final normalisés à l'aide de ces courbes ont montré une plage similaire de réactivité anti-TNP entre les fractions Flag + et Strep + (Extended Data Fig. 2e), ce qui indique une compétitivité égale des cellules B étiquetées différemment.

Le suivi de l'anticorps sérique produit par les lymphocytes B engagés à différents stades de la réponse immunitaire nécessite une cartographie du destin limitée dans le temps des clones de lymphocytes B activés. Pour ce faire, nous avons croisé des souris IgkTag avec l'allèle transgénique S1pr2-creERT2 BAC spécifique au GC et inductible par le tamoxifène (pour générer des souris S1pr2-IgkTag). Le traitement au tamoxifène des souris les jours 4 et 8 après l'immunisation au TNP-KLH a conduit à une recombinaison efficace (96,1 ± 0,50 % (moyenne ± sem) ((Strep+/Tag+) × 100)) de l'allèle Κ-tag dans les cellules GC B mais pas dans les cellules B non GC du même ganglion lymphatique 12 jours après l'immunisation (dpi) (Fig. 1d – f). Encore une fois, des cellules B étiquetées ont été trouvées dans des proportions similaires à celles des cellules B non étiquetées chez des souris S1pr2-IgkWT/Tag hétérozygotes (en moyenne 41 ± 9,0 % (moyenne ± écart-type) Tag+), ce qui indique que l'expression de l'étiquette n'altère pas la compétitivité des cellules B dans le GC (données étendues Fig. 2f, g). Les cellules GC B chez les animaux Cre– (Fig. 1f) ou les souris S1pr2-IgkWT/Tag non traitées au tamoxifène sont restées Flag+, avec seulement une recombinaison spontanée minimale (1,3 ± 1,0 % (moyenne ± sd) Strep+ au jour 12 dpi) chez ces dernières (Données étendues Fig. 2g).

Les anticorps IgG anti-TNP totaux chez les souris S1pr2-IgkTag immunisées par voie intrapéritonéale (ip) avec du TNP-KLH dans de l'alhydrogel et traitées avec du tamoxifène aux jours 4, 8 et 12 ont d'abord été détectés dans le sérum à 8 dpi et ont augmenté progressivement jusqu'à 60 dpi (Fig. .1g). La déconvolution des anticorps dérivés de GC (Strep+) et non dérivés de GC (Flag+) a montré qu'une vague initiale d'anticorps Flag+ extrafolliculaires culminant à 8 dpi était progressivement remplacée par des anticorps Strep+ dérivés de GC qui ont d'abord été détectés dans le sérum à 14 dpi (Fig. 1g). Les anticorps anti-TNP Flag + ont régressé à des niveaux proches de la ligne de base entre 47 et 60 dpi, comme prévu de leur origine extrafolliculaire. Un ELISA anti-TNP dépendant de l'affinité a montré une maturation d'affinité détectable uniquement dans la fraction d'anticorps Strep + dérivée de GC (Fig. 1h), confirmant la cartographie efficace du devenir de l'anticorps dérivé de GC. Le signal de fond chez les animaux témoins qui n'ont pas reçu de tamoxifène est resté inférieur à la limite de détection (LOD) tout au long de la réponse primaire (Extended Data Fig. 2h). Ainsi, le modèle de souris S1pr2-IgkTag nous permet de discerner les anticorps dérivés de la première vague de lymphocytes B qui sont entrés dans une réaction GC en réponse à l'immunisation. Nos données montrent également que les réponses extrafolliculaires sont de durée relativement courte dans ces contextes et que presque tous les anticorps détectables après les premières semaines d'immunisation, et en particulier les anticorps à haute affinité, étaient dérivés de plasmocytes d'origine GC.

Avec ce système en main, nous avons cherché à mesurer dans quelle mesure la suppression de type OAS affecte le développement de réponses anticorps de novo au rappel homologue (nous appelons cette suppression de manière générique comme dépendance primaire, pour englober le régime homologue). À cette fin, nous avons profité de la capacité de déclencher la recombinaison médiée par Cre de l'allèle Κ-tag d'une manière résolue dans le temps par l'administration de tamoxifène pour marquer les anticorps sériques produits par les cellules B qui ont formé des GC en réponse à l'immunisation primaire (le cohorte primaire). En plus d'étiqueter les cellules B de la cohorte primaire, cette approche "inverse les cartes du destin" avec une étiquette Flag tous les anticorps issus de clones engagés de novo par des doses de rappel ultérieures. Cette propriété nous permet de distinguer deux modèles de réponse anticorps de rappel : (1) un modèle de contribution séquentielle simple, dans lequel les réponses de novo, bien que plus petites que celles dérivées de la mémoire, sont néanmoins autorisées à progresser avec une cinétique similaire vers une nouvelle réponse primaire , s'additionnant au fur et à mesure que des doses d'antigène sont administrées (liées à l'ancienneté antigénique) ; et (2) un modèle de dépendance primaire (lié à l'OAS), dans lequel la réponse primaire supprime activement l'émergence de réponses anticorps de novo ultérieures même après plusieurs rappels (Fig. 2a).

a, Schéma de la contribution séquentielle et des modèles de dépendance primaire de l'empreinte antigénique. b, La stratégie d'immunisation générale utilisée pour mesurer la dépendance primaire. Des souris S1pr2-IgkTag/Tag ont été immunisées les jours indiqués par des flèches noires avec du TNP-KLH dans de l'alun (c,d) ou de l'ARNm WH1–LNP (e–g) et traitées avec du tamoxifène à 4, 8 et 12 dpi comme indiqué par les flèches rouges. c, IgG sérique anti-TNP (à gauche), Igκ (au milieu) et titres spécifiques à l'étiquette (à droite) mesurés à l'aide de TNP4-BSA par ELISA. Les résultats proviennent de quatre souris issues de deux expériences indépendantes. Les lignes fines représentent des souris individuelles et les lignes épaisses relient les médianes des valeurs de titre transformées en log à chaque instant. d, Le pourcentage du titre TNP dérivé de la cohorte primaire de lymphocytes B (l'indice primaire d'addiction) a été calculé en divisant le titre Strep+ de chaque échantillon individuel par son titre total (Strep+ + Flag+), multiplié par 100 (S/( S + F) × 100). e, IgG anti-WH1 RBD (à gauche), Igκ (au milieu) et titres spécifiques à l'étiquette (à droite) mesurés par ELISA. Les résultats proviennent de 12 souris issues de 3 expériences indépendantes. f, L'indice de dépendance primaire a été calculé comme décrit en d. g, Comparaison des réponses d'anticorps Flag+ de novo en présence ou en l'absence d'immunisation primaire. WWW, trois doses d'ARNm WH1S; ØWW, première dose et cartographie du devenir omis. Les données WWW concernent les mêmes échantillons qu'en e, remesurés dans le même dosage que ØWW. h, La réponse quaternaire anti-WH1 RBD (à gauche) et l'indice de dépendance primaire (à droite) chez les souris ayant reçu une quatrième dose d'ARNm – LNP 133 jours après la dose précédente, pour l'une des cohortes présentées dans e. Deux des cinq souris n'ont pas été échantillonnées au jour 0.

Nous avons amorcé des souris S1pr2-IgkTag ip avec du TNP-KLH additionné d'alun et administré du tamoxifène à 4, 8 et 12 dpi pour cartographier le destin des cellules GC B de la cohorte primaire et de leur mémoire et de leur progéniture plasmocytaire (Fig. 2b). Dans ce contexte, tous les anticorps dérivés de la cohorte primaire sont Strep+, tandis que tout anticorps produit par des clones de lymphocytes B développés de novo par un rappel secondaire ou d'ordre supérieur (y compris par leur mémoire ou leur progéniture plasmocytaire) sera cartographié en tant que Flag+ . Surtout, comme nous ne nous appuyons pas sur les différences entre les variantes d'antigène pour distinguer les anticorps primaires des secondaires ou ultérieurs, cette approche nous permet de mesurer la dépendance primaire à une distance antigénique nulle, c'est-à-dire lors de l'amorçage et de la stimulation avec exactement le même antigène. Comme la suppression des réponses anticorps de novo est susceptible de diminuer à mesure que la distance antigénique augmente26,27, cette approche nous permet d'estimer la force de la dépendance primaire lorsqu'elle est la plus forte.

Le rappel homologue 1 et 2 mois après la primo-immunisation a entraîné les augmentations attendues des titres de TNP de rappel (Fig. 2c) et la formation de GC de rappel qui étaient dominés par des cellules B dérivées naïves (Données étendues Fig. 3a). La déconvolution de ces réponses à l'aide d'ELISA spécifique à l'étiquette a révélé que les titres secondaires et tertiaires étaient fortement dominés par les anticorps à cartographie du destin (Strep+) dérivés des cellules B primaires de la cohorte. Alors que les anticorps spécifiques de Flag + TNP sont également apparus après chaque rappel, leurs titres ont culminé à des niveaux beaucoup plus bas et ont nettement diminué avec le temps (Fig. 2c). Fait important, contrairement aux attentes du modèle de contribution séquentielle (Fig. 2a), les titres Flag + n'ont pas augmenté progressivement entre les deuxième et troisième doses d'antigène, lorsque toutes les cellules B mémoire Flag + auraient été réactivées. Pour synthétiser les deux mesures, nous avons créé un « indice primaire de dépendance », calculé en divisant Strep+ par le total des titres Strep+ + Flag+ (S/(S + F) × 100). Cela a montré que presque tous les anticorps de rappel détectables (moyenne de 95 % et 97 % de la réactivité sérique 14 jours après les premier et deuxième rappels, respectivement) étaient dérivés de la cohorte de lymphocytes B engagée dans la réponse GC primaire (Fig. 2d). L'appauvrissement en IgM des échantillons de sérum après le rappel a entraîné une forte réduction des titres de TNP de rappel de Flag + mais pas de Strep +, ce qui appuie l'idée que les cellules B dérivées naïves engagées par rappel génèrent principalement une réponse des cellules B de type extrafolliculaire (dominée par les IgM) (Extended Données Fig. 3b, c).

Pour étendre ces résultats à un contexte cliniquement pertinent, nous avons immunisé et stimulé des souris comme dans la figure 2b, mais en utilisant un vaccin à ARNm modifié par nucléoside formulé avec des nanoparticules lipidiques (LNP) codant pour la forme stabilisée par préfusion (2P) du SARS-CoV- 2 Protéine de pointe (S) Wuhan-Hu-1 (WH1), similaire aux vaccins à ARNm SARS-CoV-2 disponibles28. Les anticorps secondaires et tertiaires anti-domaine de liaison au récepteur de la protéine S (RBD) étaient à nouveau presque entièrement dérivés de cellules B de la cohorte primaire (Strep +) (Fig. 2e, f). Comme pour les cellules GC B (Extended Data Fig. 2g), une recombinaison spontanée de bas niveau avec les anticorps Strep + a été détectée dans les réponses de rappel chez les souris témoins n'ayant pas reçu de tamoxifène. Cela a entraîné une légère sous-estimation des titres d'anticorps Flag+ (médiane de 2,1 % et 2,8 % 2 semaines après les deuxième et troisième immunisations, respectivement ; Données étendues Fig. 3d). Bien que la dépendance primaire ait été plus prononcée pour le SARS-CoV-2 RBD que pour le TNP-KLH après le premier rappel (aucun nouvel anticorps (Flag+) n'a été détecté à ce moment), 5 souris sur 12 ont développé des titres faibles mais stables de Flag+ anticorps anti-RBD après la troisième dose. Cette bimodalité était indépendante de la cohorte expérimentale et du fait que le rappel ait été effectué ipsilatéralement ou contralatéralement au site de la dose primaire (Extended Data Fig. 3e) et est donc probablement attribuable à la variabilité stochastique inhérente aux réponses de rappel hautement oligoclonales21. Pour quantifier la mesure dans laquelle les réponses d'anticorps de novo au rappel ont été supprimées par l'amorçage précédent (c'est-à-dire l'ampleur de l'effet primaire de suppression de la dépendance), nous avons comparé les anticorps Flag+ chez des souris ayant reçu trois doses d'ARNm-LNP WH1 (WWW ) à un groupe supplémentaire dans lequel les étapes d'amorçage et de cartographie du devenir ont été omises (ØWW). Les réponses Flag + étaient 55 fois plus faibles chez les souris WWW que chez les souris ØWW 4 semaines après la dose finale (Fig. 2g), indiquant une forte suppression des nouvelles réponses des cellules B chez les animaux sensibilisés par rapport à ce qu'elles auraient été en l'absence de amorçage. Enfin, la dépendance primaire a duré longtemps, car même une quatrième immunisation d'un sous-ensemble de souris (> 133 jours après le rappel précédent) a été dominée par des anticorps marqués par Strep (Fig. 2h et Extended Data Fig. 3f), à nouveau à défaut de démontrer l'augmentation progressive des titres d'anticorps Flag+ prédit par un modèle de contribution séquentielle simple (Fig. 2a). Nous concluons que la dépendance primaire peut être très forte lorsqu'elle est mesurée à une distance antigénique nulle, preuve d'une suppression de type OAS des réponses des lymphocytes B de novo par une immunité préexistante.

Pour mesurer comment la dépendance primaire réagit à l'augmentation de la distance antigénique entre les antigènes d'amorçage et de rappel, nous avons utilisé des séries historiques de variantes dérivées de l'hémagglutinine (HA) du virus de la grippe comme modèles. Nous avons d'abord utilisé un modèle d'infection/immunisation grippale (Fig. 3a) basé sur deux des souches pour lesquelles l'OAS a été initialement décrite : A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) et A/Fort Monmouth/1/1947 (FM1) 1,19 - dont les HA (HAPR8 et HAFM1) partagent 90 % d'identité au niveau des acides aminés (Fig. 3b). Comme pour l'immunisation par haptène et ARNm, la réponse primaire à HAPR8 était caractérisée par des titres extrafolliculaires élevés (Flag +) qui culminaient entre 8 et 16 jours après l'infection et étaient ensuite remplacés par des titres dérivés de GC (Strep +) (Fig. 3c). Un rappel homologue avec la protéine HAPR8 recombinante par voie sous-cutanée à 3 et 4 mois après l'infection a entraîné une augmentation de 1 log des titres de liaison Strep+ HAPR8 après le premier rappel et une augmentation moins prononcée après le deuxième rappel. Comme pour l'immunisation protéique, la contribution des anticorps non primaires (Flag+) aux titres totaux était faible - même si elle augmentait progressivement entre le premier et le deuxième rappel, sa valeur médiane maximale était d'environ 10 % de la réactivité HA (Fig. 3c). Le rappel hétérologue avec HAFM1 n'a entraîné qu'un léger rappel des titres primaires de Strep + HAPR8 et n'a eu presque aucun effet sur la réactivité de Flag + HAPR8 (Fig. 3d), ce qui indique une distance antigénique substantielle entre ces variants. En conséquence, les titres primaires de réaction croisée envers HAFM1 étaient complètement absents de la réponse extrafolliculaire primaire à l'infection PR8 et n'ont commencé à apparaître qu'à environ 4 semaines dans la fraction d'anticorps Strep + (Fig. 3d), probablement comme effet secondaire de la maturation d'affinité envers HAPR8 . Le rappel hétérologue a non seulement augmenté ces titres de réaction croisée (Strep +) de près de 1 log, mais, ce qui est important, a également induit des réponses substantielles des clones de novo suscités par le rappel, dans la mesure où environ la moitié de toute la réactivité sérique à HAFM1 était dérivée du Flag + fraction après le deuxième rappel (Fig. 3d). La comparaison de ces niveaux à ceux obtenus par deux doses de HAFM1 en l'absence d'infection précédente a montré que la dépendance primaire supprimait les nouvelles réponses de 3,8 fois (données étendues Fig. 4a), bien moins que la suppression de 55 fois obtenue dans la vaccination par ARNm homologue. (Fig. 2g). Ainsi, le rappel hétérologue contourne en partie la dépendance primaire, permettant une expansion et une contribution sérique améliorées des clones de lymphocytes B spécifiques de la variante qui ne sont pas impliqués dans la réponse primaire.

a, Schéma de l'infection grippale et de la stratégie de renforcement de l'HA. Des souris S1pr2-IgkTag/Tag ont été infectées par voie intranasale avec la grippe PR8 et ont reçu un rappel sous-cutané (sc) avec HAPR8 ou HAFM1 dans de l'alhydrogel aux moments indiqués. b, Rendu de la structure du trimère HAPR8 (Protein Data Bank (PDB): 1RU7) avec un monomère surligné en bleu sarcelle et les acides aminés qui divergent entre HAPR8 et HAFM1 en rouge. Le pourcentage d'identité d'acides aminés est indiqué entre parenthèses. c, Titres anti-HAPR8 Flag+ et Strep+ chez des souris S1pr2-IgkTag/Tag qui ont été boostées de manière homologue avec HAPR8 (à gauche) et quantification du score de l'indice d'addiction primaire (à droite). d, Réactivité ELISA anti-HAPR8 (en haut) et anti-HAFM1 (en bas) chez des souris qui ont reçu un rappel hétérologue avec HAFM1. Les titres spécifiques aux balises (à gauche) et la quantification de l'indice de dépendance primaire (à droite) sont présentés. e, La divergence entre HANC95 et HANC99 ou HACA09, colorée comme en b. Modélisé sur la structure de HACA09 (PDB : 3LZG). f, titres spécifiques de l'étiquette anti-HA chez les souris amorcées avec la protéine HANY95, indiqués après le premier rappel avec HANY95 (homologue) ou avec les variantes HANC99 ou HACA09 (hétérologue), comme indiqué dans les données étendues Fig. 4b. La réactivité de l'anticorps à l'antigène de rappel est montrée. L'évolution dans le temps et les réactivités contre les trois HA telles que mesurées par ELISA pour la dilution de sérum supérieure sont indiquées dans les données étendues de la Fig. 4c. g, Indice d'addiction primaire pour le rappel HA, 6 jours (à gauche) et 1 mois (à droite) après le deuxième rappel (troisième dose). Les valeurs P ont été calculées à l'aide de tests t de Student bilatéraux, comparant l'indice de dépendance primaire de l'homologue à chaque boost hétérologue. Les lignes fines représentent des souris individuelles et les lignes épaisses relient les médianes des valeurs de titre transformées en log à chaque instant. Tous les résultats proviennent de deux expériences indépendantes, le nombre de souris dans chaque groupe étant indiqué dans les graphiques.

Pour vérifier cette notion sur une plus large gamme de distances antigéniques, nous avons immunisé des souris ip avec le H1 recombinant de la souche A/New York/614/1995 (HANY95) en adjuvant alhydrogel, puis avons relancé ces souris deux fois, soit de manière homologue avec HANY95, soit de manière hétérologue avec H1s à partir des souches A/New Caledonia/20/1999 (HANC99 ; une souche légèrement dérivée avec 96 % d'identité d'acides aminés avec HANY95) ou pandémique A/California/07/2009 (HACA09 ; une souche de "déplacement antigénique", avec 80 % d'acides aminés identité ; Fig. 3e et Données étendues Fig. 4b). En général, la dépendance primaire était plus faible et plus variable dans ce contexte, même avec un rappel homologue, peut-être en raison de la faible réponse primaire globale provoquée par la protéine recombinante HAPR8 (Extended Data Fig. 4c). Néanmoins, nous avons observé une diminution progressive de la dépendance primaire à mesure que la distance antigénique entre les antigènes primaire et boost augmentait, de sorte que jusqu'à 80 % des réponses sériques totales à HACA09 étaient marquées par Flag (correspondant à 20 % de dépendance primaire) après un rappel avec ce variante (Fig. 3f, g). Le regroupement des données pour les expériences d'infection et d'immunisation en fonction de la similitude entre l'amorçage et le rappel des HA a montré une diminution linéaire hautement significative de la dépendance primaire à mesure que la distance antigénique augmentait (données étendues, Fig. 4d). Nous concluons qu'une distance antigénique accrue entre les antigènes d'amorçage et de rappel neutralise la dépendance primaire, permettant ainsi la génération de nouvelles réponses d'anticorps spécifiques à la variante.

Un cadre dans lequel la subversion de la dépendance primaire par la distance antigénique est cliniquement important est la réponse aux souches Omicron de SARS-CoV-2 chez les individus qui ont été précédemment exposés à des antigènes de la souche WH1. Nous avons utilisé le système K-tag pour estimer dans quelle mesure le rappel avec l'ARNm-LNP codant pour la protéine S de la souche Omicron BA.1 était capable de surmonter la dépendance primaire générée par l'amorçage avec l'ARNm-LNP codant pour WH1-S (le WH1 et les souches BA.1 ont une identité d'acides aminés de 98 % et 92 % dans les domaines de la protéine S complète et de la RBD, respectivement). Nous avons amorcé des souris S1pr2-IgkTag avec de l'ARNm – LNP WH1 dans la jambe droite, puis avons stimulé ces souris 1 et 2 mois plus tard avec de l'ARNm – LNP BA.1 ou WH1 distalement dans la jambe gauche (Fig. 4a). Le rappel a induit des réponses IgG totales similaires aux RBD WH1 et BA.1 dans les deux groupes (Fig. 4b). En revanche, alors que les sérums des deux groupes neutralisaient un pseudovirus WH1 de la même manière, le sérum boosté par BA.1 était en moyenne 15 fois plus puissant contre le pseudovirus BA.1, indiquant une forte différence qualitative entre les schémas de rappel hétérologue et homologue. La déconvolution de ces effets par ELISA spécifique à l'étiquette a révélé des réponses au WH1 RBD qui étaient impossibles à distinguer entre les animaux boostés de manière homologue et hétérologue, en ce que les anticorps primaires (Strep +) étaient fortement dominants dans les deux contextes, sans réponse Flag + substantielle après la réponse extrafolliculaire initiale ( Figures 4c,d). Alors que peu ou pas d'anticorps Strep+ contre le BA.1 RBD ont été observés après la primo-immunisation, la réactivité rappel de Strep+ contre le BA.1 RBD était tout aussi forte, quelle que soit la variante utilisée pour le rappel (Fig. 4c, d). Cette observation est en accord avec les rapports précédents documentant l'évolution de la réactivité croisée avec d'autres souches en conséquence de la maturation de l'affinité envers la vaccination WH1 chez l'homme30. Cependant, il est important de noter que le rappel hétérologue a entraîné une augmentation prononcée des titres BA.1 RBD générés par les clones nouvellement recrutés (Flag +) qui n'étaient pas réactifs de manière croisée avec la souche WH1, une réactivité autrement absente chez les souris boostées de manière homologue (Fig. 4c, d ). À leur apogée (2 semaines après le deuxième rappel), les anticorps Strep + représentaient en moyenne 73% (± 19% sd) de la réactivité totale anti-BA.1 chez les souris boostées de manière hétérologue (Fig. 4d). L'induction de nouveaux anticorps (Flag +) après un double rappel de BA.1 était encore plus prononcée lors du dosage de la réactivité contre les protéines WH1 et BA.1 S pleine longueur (Fig. 4e). Deux doses de BA.1 en l'absence d'immunisation WH1 précédente (ØBB) ont généré des réponses qui n'étaient que 3,6 fois plus élevées que le groupe WBB (WH1-BA.1-BA.1) (une différence qui n'a pas atteint la signification statistique ; Fig. 4f), montrant à nouveau que l'effet de la dépendance primaire dans ce contexte est fortement réduit par rapport à celui observé pour le rappel homologue (Fig. 2g). Nous concluons que BA.1 est suffisamment différent de WH1 pour induire des réponses anticorps de novo substantielles, même s'il n'est pas capable de surmonter entièrement la dépendance primaire. De plus, la principale différence entre le renforcement de manière homologue et hétérologue est que seul ce dernier peut provoquer une réponse de novo robuste à la souche dérivée.

a, Schéma des stratégies de vaccination. b, titres anti-WH1 (à gauche) et BA.1 RBD IgG (au milieu) et NT50 du pseudovirus BA.1 (à droite) 2 semaines après la dose indiquée dans le S1pr2-IgkTag/Tag immunisé de manière homologue (WWW) ou hétérologue (WBB) souris. Les valeurs P ont été calculées à l'aide de tests t bilatéraux. FC, changement de pli. c, Évolution des titres spécifiques aux étiquettes anti-WH1 et BA.1 RBD. Les lignes fines représentent les souris individuelles et les lignes épaisses relient les médianes des valeurs de titre transformées en log. d, Comparaison des titres anti-RBD Flag et Strep indiqués en c à 2 semaines après la troisième immunisation (à gauche) avec l'indice de dépendance primaire (à droite). Les valeurs P ont été calculées à l'aide de tests t bilatéraux. e, Titres spécifiques anti-full-S tag et indice primaire d'addiction pour les mêmes échantillons qu'en d, 2 semaines après la troisième dose. Les résultats en b–d proviennent de deux expériences indépendantes ; le nombre de souris dans chaque groupe est indiqué. f, Comparaison des réponses d'anticorps Flag+ de novo chez les souris WBB par rapport aux souris chez lesquelles la première dose et la cartographie du devenir ont été omises (ØBB). Les données ØBB concernent dix souris issues de deux expériences indépendantes. Les données WBB proviennent de c, remesurées dans le même dosage que ØBB. g, Schéma du fractionnement des anticorps pour le test de neutralisation. h, titres BA.1 NT50 pour les souris WBB au même moment qu'en d. Les valeurs de NT50 post-épuisement ont été normalisées comme décrit dans les Méthodes. Les valeurs P ont été calculées à l'aide de tests t appariés unilatéraux. i, La puissance des fractions anti-RBD BA.1 Strep+ (Flag-depleted) et Flag+ (Strep-depleted). Les valeurs brutes de NT50 pour chaque fraction ont été divisées par leurs titres ELISA RBD respectifs. Les valeurs P ont été calculées à l'aide de tests t appariés bilatéraux. j, structure WH1 RBD (PDB: 6M0J) avec des changements d'acides aminés dans BA.1 surlignés en rouge. k, analyse par balayage mutationnel profond d'échantillons de sérum obtenus à partir de trois souris WBB 2 semaines après la troisième immunisation comme dans d. Les sites de liaison aux anticorps sur RBD sont ombrés en fonction de la fraction d'échappement. Les positions les plus ciblées par chaque fraction sérique sont indiquées (les résidus spécifiques de BA.1 sont indiqués entre parenthèses).

Pour déterminer si la neutralisation accrue de BA.1 observée après un rappel hétérologue (Fig. 4b) était due à l'induction de nouveaux anticorps spécifiques de BA.1 dans ce contexte, nous avons fractionné des échantillons de sérum WBB prélevés 2 semaines après la troisième immunisation dans Flag -depleted (Strep+, primary) et Strep-depleted (Flag+, new) (Fig. 4g et Extended Data Fig. 5a) et mesuré leur pouvoir neutralisant contre les pseudovirus WH1 et BA.1. Comme prévu, l'épuisement des anticorps Flag + a eu un effet minimal sur la neutralisation de WH1, tandis que l'épuisement de Strep + a entraîné une diminution beaucoup plus importante (respectivement 1, 7 fois contre 8, 5 fois; Données étendues Fig. 5b, c). En revanche, la suppression des nouveaux anticorps (Flag +) des sérums WBB a entraîné une réduction plus importante de la neutralisation de BA.1 par rapport à la suppression des anticorps primaires (Strep +) (diminution de 4,9 fois contre 1,9 fois; Fig. 4h), même si les anticorps Strep + liés plus avidement au BA.1 RBD par ELISA (Fig. 4d). Pour estimer la puissance neutralisante par unité d'anticorps spécifique, nous avons divisé le titre de neutralisation à 50 % (NT50) dérivé du test de pseudovirus BA.1 par le titre de liaison au point final obtenu par ELISA spécifique à BA.1 RBD. Lorsqu'il est normalisé à la réactivité de cette manière, le nouvel anticorps (Flag +) était en moyenne 7, 0 fois plus puissant pour neutraliser BA.1 que l'anticorps Strep + produit par les clones de cellules B de la cohorte primaire en réponse à WH1 (Fig. 4i). Comme calculé dans Extended Data Fig. 5d, environ 80% de la neutralisation en excès de BA.1 par WBB par rapport aux échantillons WWW pourrait être attribuée à la génération de novo d'anticorps spécifiques à BA.1 à partir de cellules naïves plutôt qu'à une maturation d'affinité secondaire ou préférentielle. sélection des lymphocytes B mémoire de la cohorte primaire. Ainsi, les anticorps qui échappent à la dépendance primaire après le rappel de BA.1 sont optimisés pour neutraliser la souche variante.

Enfin, pour obtenir des informations mécanistes sur la façon dont la dérive antigénique conduit à l'atténuation de la dépendance primaire, nous avons effectué un balayage mutationnel profond31,32 pour définir les épitopes WH1 et BA.1 RBD ciblés par les anticorps Flag + et Strep + chez des souris boostées de manière hétérologue (Fig. 4j et Extended Données Fig. 6). Cette approche nous a permis de déterminer séparément les épitopes ciblés par les anticorps primaires et nouveaux chez la même souris. Nous avons mesuré les schémas d'échappement des anticorps de quatre souris contre BA.1 (anticorps Strep + et Flag +) et WH1 RBD (anticorps Strep + uniquement), dont trois ont montré des pics de dominance interprétables (Extended Data Fig. 7). Chez ces trois souris, il y avait une nette ségrégation des épitopes ciblés par les anticorps primaires Strep + et les nouveaux anticorps Flag + (Fig. 4k et Extended Data Fig. 7). Chez deux souris, les anticorps Strep+ ciblaient les résidus de l'épitope de « classe 3 » situé sur la face externe du RBD (Arg346, Arg357, Ile468), qui, comme prévu, étaient conservés entre WH1 et BA.1 (Fig. 4j,k ). En revanche, les anticorps Flag+ chez les deux souris étaient concentrés sur le résidu Arg493 spécifique à BA.1 (Gln493 dans WH1), situé au sommet du RBD dans la région de « classe 2 » de la surface de liaison à l'ACE2. La troisième souris a montré une ségrégation analogue entre les anticorps primaires et nouveaux mais ciblée sur différents épitopes. Alors que les anticorps Strep+ étaient fortement concentrés sur l'épitope conservé de classe 1/2 qui comprend Gly485/Phe486 (sur le dessus du RBD à l'interface ACE2), les anticorps Flag+ se lient principalement à un épitope qui comprend le résidu Lys440 spécifique de BA.1 ( Asn440 dans WH1) sur la face latérale du RBD distal à Gly485/Phe486 (classe 3). Notamment, il a été rapporté que N440K et Q493R conduisent à échapper à la neutralisation par divers anticorps monoclonaux33,34,35. Ainsi, les trois souris ont suivi une logique dans laquelle les nouveaux anticorps induits par immunisation hétérologue ciblaient préférentiellement les épitopes contenant des mutations d'échappement spécifiques à BA.1 et qui ne se chevauchaient pas avec les épitopes liés par des anticorps primaires à réaction croisée. Nous concluons que la dépendance primaire, en agissant de manière spécifique à l'épitope, supprime la génération de novo d'anticorps dirigés contre les épitopes conservés, tout en permettant l'induction de nouveaux anticorps ciblés spécifiquement contre les épitopes dérivés.

Pris ensemble, sur la base de nos découvertes utilisant le système Κ-tag, nous faisons deux remarques principales. Premièrement, la suppression des réponses anticorps de novo par l'immunité existante, une caractéristique nécessaire de l'OAS telle que nous la définissons, est extrêmement puissante lorsqu'elle est mesurée à une distance antigénique nulle. Ces résultats appuient le modèle de dépendance primaire/OAS2 (Fig. 2a) dans lequel les réponses existantes empêchent l'émergence de nouveaux anticorps sériques dirigés contre le même antigène, par rapport à un modèle séquentiel de contribution/ancienneté20 dans lequel les réponses de la première cohorte sont plus importantes simplement parce qu'elles ont été établies. d'abord et donc boosté un plus grand nombre de fois. Deuxièmement, la dépendance primaire s'affaiblit nettement à mesure que la distance antigénique entre les souches d'amorçage et de rappel augmente. Cette observation suggère une explication de la raison pour laquelle l'OAS a été si difficile à documenter expérimentalement de manière cohérente5 - les mesures traditionnelles, qui reposent sur les différences entre les antigènes dérivés pour attribuer des anticorps aux cohortes primaires ou de novo, peuvent être en mesure de distinguer ces cohortes de manière fiable uniquement lorsque la distance antigénique est trop grande pour permettre une détection claire de la dépendance primaire. Un exemple concret est que notre modèle estime que la dépendance primaire entre PR8 et FM1, les souches du virus de la grippe pour lesquelles OAS a été initialement décrite1,19, est relativement faible (équivalent à une suppression de 3,8 fois de la réponse de novo), et peut donc difficile à déterminer sans la précision offerte par le modèle K-tag.

Nos données sont cohérentes avec les observations chez l'homme montrant qu'après la vaccination contre la grippe saisonnière, une grande proportion de clonotypes d'anticorps sériques sont rappelés à partir de pools préexistants, bien que ces études soient restées agnostiques quant à savoir si les clonotypes d'anticorps induits par le vaccin provenaient de réponses de novo ou de rappel de cellules B mémoire non détectées17,36. Les humains, même avec leur riche historique d'exposition aux antigènes grippaux, sont capables de générer des réponses de novo substantielles dans les GC de rappel, tout en s'appuyant sur les lymphocytes B mémoire pour la réponse immédiate des plasmocytes37. Nous nous attendons donc à ce que les mécanismes généraux de la dépendance primaire rapportés ici s'appliquent également aux humains, du moins en termes généraux. Dans le contexte du SRAS-CoV-2, la suppression de type OAS peut expliquer les différences faibles et variables dans l'induction préférentielle de la neutralisation d'Omicron par variante spécifique ou bivalente par rapport à la vaccination homologue38,39,40,41,42. Nos données suggèrent qu'une deuxième dose d'un vaccin contenant de l'Omicron peut être nécessaire pour révéler toute l'étendue de l'induction d'anticorps de novo par le rappel d'Omicron. Cependant, dans la pratique, l'exposition répétée de la plupart des individus aux antigènes WH1 avant le rappel d'Omicron, ainsi que la plus grande propension potentielle des GC humains à permettre l'entrée de lymphocytes B mémoire réactivés, peuvent conduire à une suppression plus forte de type OAS des anticorps spécifiques d'Omicron. dans des scénarios réels.

Mécaniquement, nos mesures à distance antigénique nulle indiquent une division fonctionnelle entre les GC de rappel et les réponses sériques chez la souris - alors que les premiers consistent presque exclusivement en des clones de cellules B dérivés naïfs21,22,23, les seconds sont dominés par les effets de la dépendance primaire. Une explication potentielle de cette divergence est que les cellules B naïves qui contribuent aux GC secondaires n'ont pas une affinité suffisante soit pour sortir du GC sous forme de plasmocytes, soit pour sécréter des anticorps détectables par ELISA direct. Une faible liaison à l'antigène parmi les cellules GC B secondaires dérivées de naïfs a été rapportée précédemment par d'autres22, ce qui est cohérent avec cette dernière hypothèse. Comme la dérive antigénique du virus de la grippe et du SRAS-CoV-2 est principalement motivée par l'évasion immunitaire, le relâchement de l'OAS dans des contextes hétérologues devrait en principe concentrer les clones de cellules B nouvellement recrutés sur des épitopes neutralisants dérivés. Ce point de vue est étayé par les résultats de nos expériences de neutralisation et de cartographie des épitopes. De plus, les anticorps de liaison RBD qui ont échappé à la dépendance primaire avaient tendance à se concentrer sur de nouveaux résidus situés dans des épitopes qui n'étaient pas des cibles dominantes de la réponse de première cohorte à réaction croisée. Ce schéma suggère un masquage d'épitope médié par des anticorps - par lequel les anticorps sériques qui sont soit présents avant le rappel, soit produits de manière aiguë par les lymphocytes B mémoire boostés entrent en compétition avec les lymphocytes B naïfs pour se lier à un épitope spécifique - en tant que mécanisme potentiel de dépendance primaire. Des effets similaires ont été observés précédemment par perfusion d'anticorps monoclonaux avant l'induction d'une réponse immunitaire chez la souris et l'homme et devraient affecter la spécificité fine des réponses de rappel43,44,45,46. Ces résultats indiquent non seulement que la suppression des réponses d'anticorps de novo offertes par la dépendance primaire est spécifique à l'épitope plutôt qu'à l'antigène (masquage d'épitope, plutôt que piégeage d'antigène47), mais suggèrent également une explication téléologique de la raison pour laquelle cela pourrait être avantageux pour les cellules B mémoire. pour éviter de réintégrer les GC secondaires21,48, car la compétition par les cellules B mémoire pourrait inhiber la capacité des cellules naïves à générer des anticorps adaptés aux nouveaux épitopes dans les variantes d'échappement virales. Dans un tel cadre, le rôle principal des GC secondaires serait de contourner les pires effets de l'OAS.

Les souris WT C57BL/6J et B6.C(Cg)-Cd79atm1(cre)Reth/EhobJ (Cd79aCre/+, également connues sous le nom de Mb1-Cre49) ont été obtenues auprès du Jackson Laboratory. Les souris transgéniques S1pr2-creERT2 BAC25 étaient un cadeau de T. Kurosaki et T. Okada. Des souris IgkTag ont été générées à l'Université Rockefeller. Nous avons conçu l'allèle comme indiqué sur la Fig. 1a et la Fig. 1 sur les données étendues, avec une étiquette Flag (DYKDDDDK) et une étiquette Strep-II (WSHPQFEK) séparées par des codons d'arrêt et le terminateur transcriptionnel SV40 poly-A. La matrice d'ADN simple brin de 522 nucléotides (y compris les bras d'homologie 5 'et 3', chacun de 100 nucléotides de long) et l'ARN guide CRISPR (GGAGCTGGTGGTGGCGTCTC) ont été achetés auprès d'IDT et préparés selon la méthode de ciblage du gène Easi-CRISPR50 par le Centre de ressources sur le ciblage génétique de l'Université Rockefeller et injecté dans des zygotes obtenus à partir de souris C57BL / 6 par l'installation centrale des services transgéniques de l'Université Rockefeller. Nous avons vérifié que l'allèle était correctement inséré par séquençage de Sanger sur l'ensemble du locus à l'aide d'amorces génomiques situées à l'extérieur des bras d'homologie. Pour réduire le risque d'effets potentiels hors cible CRISPR, une souris fondatrice a été rétrocroisée pendant au moins cinq générations sur des souris C57BL/6J avant d'être utilisée dans des expériences. Pour générer des souris IgkFlag/Strep, des souris excisées de la lignée germinale (souris Cre-négatives présentant une coloration de surface des cellules Strep+ B), obtenues à partir d'une recombinaison spontanée occasionnelle de la lignée germinale dans les élevages Cd79aCre/+IgkTag, ont été croisées avec la souche IgkTag parentale. Toutes les souris ont été détenues dans l'installation propre d'immunocore de l'Université Rockefeller dans des conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques. Toutes les procédures de souris ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université Rockefeller.

Des réponses immunitaires ont été induites chez des souris (mâles et femelles, âgées de 7 à 12 semaines) soit par immunisation sous-cutanée du coussinet plantaire avec 10 µg de TNP17 -KLH (Biosearch, T-5060) complété par 1/3 de volume d'alun Imject (Thermo Fisher Scientific) ou immunisation ip avec 50 ug de TNP-KLH préparé avec 1/3 de volume de gel d'alun ou d'hydroxyde d'aluminium (alhydrogel, Invivogen); 20 µg de HA stabilisé au trimère produit par recombinaison (voir ci-dessous) dans un alhydrogel ; immunisation intramusculaire des muscles quadriceps avec 3 µg d'ARNm de pointe WH1 (réf. 51) ou BA.1 encapsulé dans des nanoparticules lipidiques (ARNm – LNP), généré comme décrit ci-dessous ; ou par infection intranasale avec le virus grippal PR8 adapté à la souris produit dans des œufs de poule embryonnés (~ 33 unités formant plaque, fournies par M. Carroll). Chez les souris S1pr2-IgkTag, la réponse immunitaire primaire a été cartographiée par gavage oral de 200 µl de tamoxifène (Sigma-Aldrich) dissous dans de l'huile de maïs à 50 mg ml-1, les jours 4 et 8 pour l'expérience de cytométrie en flux du jour 12 ( Fig. 1), aux jours 4, 8 et 12 pour toutes les autres expériences d'immunisation, et aux jours 4, 8, 12 et 16 pour l'expérience d'infection grippale (Fig. 3). Dans les expériences de rappel TNP (Fig. 2c), le rappel a été effectué de manière identique à l'immunisation primaire, aux moments indiqués. Pour les expériences homologues d'ARNm – LNP (Fig. 2e), le rappel a été effectué de la même manière que l'amorçage, sauf que, pour certaines souris, le muscle quadriceps gauche a été boosté (contralatéralement, stratifié dans Extended Data Fig. 3e). Pour les expériences de rappel ARNm-LNP hétérologues (Fig. 4), le rappel était controlatéral dans tous les cas. Pour les expériences d'immunisation HA (Fig. 3), un rappel de protéine HA homologue ou hétérologue a été effectué de manière ipsilatérale, exactement comme l'immunisation primaire. Pour les expériences d'infection, les souris ont reçu un rappel après 3 mois par immunisation sous-cutanée du coussinet plantaire avec 5 µg de HAPR8 ou HAFM1 préparé avec 1/3 de volume d'alhydrogel, comme décrit précédemment21. Dans tous les cas, des immunisations de rappel supplémentaires ont été effectuées de manière identique au premier rappel. Des échantillons de sang ont été prélevés par ponction de la joue dans des microtubes préparés avec un gel de sérum activateur de coagulation (Sarstedt, 41.1378.005).

Les HA recombinants utilisés pour les immunisations et les ELISA ont été produits en interne en utilisant le système d'expression des protéines des cellules CHO, comme décrit précédemment21. Des résidus de cystéine ont été introduits dans la séquence HA pour créer des liaisons disulfure stabilisatrices de trimère, comme décrit à l'origine pour H1/A/California/07/2009 (réf. 52). Nous avons décrit la production de HAPR8 et HACA09 précédemment21. Pour HAFM1 et HANC99, la même procédure a été suivie, y compris l'introduction de mutations stabilisatrices du trimère. Pour les immunisations, les domaines C-terminaux non natifs de HA (foldon, Avi-tag, His-tag) ont été éliminés par clivage par la thrombine et les HA ont ensuite été purifiés par chromatographie liquide sur protéines rapides (FPLC) avant stockage dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) . Pour ELISA, des protéines purifiées par FPLC non traitées à la thrombine ont été utilisées. Un anticorps monoclonal spécifique d'IgY de haute affinité obtenu à partir de souris immunisées par CGG (clone 2.1 (réf. 53)) a été modifié pour être utilisé comme standard pour la détection ELISA Flag/Strep. Les régions constantes des chaînes lourdes et légères dans les plasmides d'anticorps monoclonaux humains d'origine54 ont été remplacées par les régions constantes IgG1 et Igκ de souris et l'extrémité C-terminale de Cκ a été modifiée pour coder un site LoxP et un lieur Ser-Gly-Gly suivi soit d'un Flag ou Strep-tag, produisant des chaînes Cκ identiques à celles produites par les souris IgkTag avant et après recombinaison, respectivement. Les plasmides de chaîne légère mAb-Flag ou mAb-Strep ont été transfectés avec le plasmide de chaîne lourde dans des cellules HEK293F (Thermo Fisher Scientific, R79007) et purifiés en utilisant la chromatographie d'affinité de la protéine G comme décrit précédemment 53 . Les lignées cellulaires ont été testées négatives pour les mycoplasmes et n'ont pas été authentifiées en plus de tester la protéine qu'elles ont produite. Pour comparer la maturation d'affinité entre les titres d'anticorps anti-TNP Flag + et Strep + (Fig. 1h), des conjugaisons personnalisées d'albumine sérique bovine (BSA) à faible et à haut haptène ont été réalisées en interne. La BSA (dans du PBS ; Thermo Fisher Scientific, 77110) à 2,5 mg ml-1 a ​​été incubée avec du TNP-ε-aminocaproyl-OSu (Biosearch Technologies, T-1030) dans du PBS avec 20 % de diméthylsulfoxyde à un rapport molaire de 1 : 2 ou 1h20 pendant 2 h à température ambiante en tournant. Le TNP-ε-aminocaproyl-OSu non conjugué a été éliminé par dialyse dans du PBS. Les rapports de conjugaison finaux TNP:BSA ont été estimés à ~ 1: 1 et ~ 1: 13 en mesurant l'absorbance à 280 et 348 nm, ces réactifs sont appelés TNP1-BSA et TNP13-BSA. La concentration en BSA a été corrigée en déterminant le coefficient d'extinction du TNP-ε-aminocaproyl-OSu à 280 nm. À l'exception de la figure 1h, le TNP4-BSA commercial (Biosearch Technologies, T-5050) a été utilisé pour tous les autres ELISA TNP (décrits ci-dessous).

Le vaccin à ARNm WH1 S a été conçu sur la base de la séquence de la protéine SARS-CoV-2 S (Wuhan-Hu-1, GenBank : MN908947.3) où les acides aminés lysine et valine aux positions 986-987 ont été modifiés en résidus de proline pour obtenir un immunogène codé par ARNm stabilisé par préfusion. La séquence d'acides aminés de BA.1S a été obtenue à partir de WH1S en introduisant des modifications spécifiques à BA.1. Les séquences codantes de WH1 et BA.1 S ont été optimisées en codons, synthétisées et clonées dans un plasmide de production d'ARNm (GenScript) comme décrit précédemment55. La production d'ARNm et l'encapsulation de LNP ont été réalisées comme décrit précédemment55. En bref, les ARNm ont été transcrits pour contenir des queues poly(A) de 101 nucléotides. m1Ψ-5′-triphosphate (TriLink) au lieu d'UTP a été utilisé pour générer des ARNm contenant des nucléosides modifiés. Le coiffage des ARNm transcrits in vitro a été réalisé de manière co-transcriptionnelle à l'aide de l'analogue trinucléotide cap1, CleanCap (TriLink). L'ARNm a été purifié par purification sur cellulose (Sigma-Aldrich), comme décrit précédemment56. Tous les ARNm ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose et conservés congelés à -20 °C. Des ARN contenant du m1Ψ purifiés à la cellulose ont été encapsulés dans des LNP à l'aide d'un processus d'auto-assemblage tel que décrit précédemment, dans lequel un mélange lipidique éthanolique de lipide cationique ionisable, de phosphatidylcholine, de cholestérol et de polyéthylène glycol-lipide a été rapidement mélangé à une solution aqueuse contenant de l'ARNm à des niveaux acides. pH57. La composition de lipide cationique ionisable et de LNP est décrite dans la demande de brevet WO 2017/004143. Les particules chargées d'ARN ont été caractérisées puis stockées à -80 ° C à une concentration de 1 μg μl-1. Le diamètre hydrodynamique moyen de ces ARNm-LNP était d'environ 80 nm avec un indice de polydispersité de 0,02 à 0,06 et une efficacité d'encapsulation d'environ 95 %.

Pour l'analyse par cytométrie en flux des cellules B périphériques, le sang a été prélevé dans des microtubes avec de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour empêcher la coagulation et traité avec un tampon ammonium-chlorure-potassium (ACK) (Lonza) pour lyser les globules rouges. Pour les échantillons de ganglions lymphatiques, les suspensions cellulaires ont été obtenues par dissociation mécanique avec des micropilons jetables (Axygen). Les rates ont été homogénéisées par filtration à travers un tamis cellulaire de 70 μm et traitées avec du tampon ACK. Les cellules de la moelle osseuse ont été extraites par centrifugation des tibias et des fémurs perforés jusqu'à 10 000 g pendant 10 s, puis traitées avec du tampon ACK. Les cellules de chaque tissu ont été remises en suspension dans du PBS additionné de 0,5 % de BSA et d'EDTA 1 mM et incubées d'abord avec FC-block (rat anti-souris CD16/32, 2.4G2, Bio X Cell) pendant 30 min sur de la glace, puis avec divers tubes fluorescents. anticorps marqués (tableau supplémentaire 1) pendant 30 min. Les cellules ont été filtrées et lavées avec le même tampon avant analyse sur un cytomètre BD FACS Symphony. Les données ont été analysées à l'aide de FlowJo (v.10).

Pour déterminer la présence d'anticorps marqués par un épitope chez les souris IgkTag, des échantillons de sérum de souris adultes à l'état d'équilibre et des étalons de protéines de précision plus bicolores (Bio-Rad) ont été analysés en triple sur des gels de protéines SDS-PAGE mini-protean TGX (Bio- Rad) dans des conditions dénaturantes, pour séparer les chaînes d'anticorps lourds et légers. Les échantillons ont été transférés sur une membrane de difluorure de polyvinylidène en utilisant le système de transfert de gel Iblot (Invitrogen). Les membranes ont été bloquées pendant 2 h à température ambiante tout en secouant doucement avec du lait en poudre écrémé à 5 % dans du PBS-Tween-20 (0,05 %), avant une incubation d'une nuit dans le même tampon avec 1:2 000 anti-Flag-HRP (D6W5B, Cell Signaling Technology, 86861S) ou anti-Strep (Strep-tag II StrepMAB-Classic, Bio-Rad, MCA2489P) ou chèvre anti-souris Igκ-HRP (Southern Biotech, 1050-05). Les membranes ont été lavées abondamment avec du PBS-Tween-20, puis incubées avec un substrat ECL de transfert Western (Amersham) avant la détection par chimiluminescence à l'aide de l'imageur de gel Azure c300 (Azure Biosystems).

Les ELISA ont été réalisés comme décrit précédemment21, avec des modifications spécifiques pour permettre une comparaison directe Flag/Strep. Les ELISA Flag/Strep ont été réalisées côte à côte et avec des étalons internes sur chaque plaque à 96 puits. Pour détecter les titres d'anticorps sériques spécifiques à l'antigène, les plaques ont été enduites pendant une nuit à 4 ° C avec de l'antigène dans du PBS (10 µg ml-1 pour TNP4-BSA, 2 µg ml-1 pour TNP1/13-BSA conjugué en interne ( voir ci-dessus), et 1 µg ml-1 pour les protéines HA et SARS-CoV-2 spike ou RBD (Sinobiological, 40592-V08H, 40592-V08H121, 40589-V08H26 ; les protéines WH1 S et RBD étaient un cadeau de P. Wilson) ). Pour les courbes standards Flag/Strep, les puits ont été recouverts de 10 µg ml-1 d'IgY purifiée (Gallus Immunotech). Après lavage avec du PBS-Tween (PBS + 0,05% Tween-20, Sigma-Aldrich), les plaques ont été bloquées pendant 2h à température ambiante avec 2,5% de BSA dans du PBS. Les échantillons de sérum ont été dilués au 1:100 dans du PBS et titrés en série en trois dilutions. Le mAb-Flag anti-IgY de souris ou le mAb-Strep ont également été titrés en série dans des dilutions triples (Extended Data Fig. 2d). Les échantillons ont été incubés pendant 2h puis lavés avec du PBS-Tween, avant d'ajouter l'un des anticorps de détection HRP suivants : chèvre anti-souris IgG (Jackson Immunoresearch, 15-035-071), rat anti-souris Igκ (Abcam, ab99632), chèvre anti-souris IgM (Southern Biotech, 1020-05), lapin anti-Flag-HRP (D6W5B) ou souris anti-Strep (Strep-tag II StrepMAB-Classic) pendant 30 à 45 min. Les dilutions d'anticorps anti-Flag et anti-Strep ont été définies de manière à ce que les courbes générées par titrage des anticorps monoclonaux marqués Flag et Strep soient équivalentes (Extended Data Fig. 2d). Après lavage avec du PBS-Tween, les échantillons ont été incubés avec le substrat 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (forme cinétique lente, Sigma-Aldrich) et la réaction a été stoppée avec du HCl 1N. L'absorbance de la densité optique (DO) a été mesurée à 450 nm sur le lecteur de plaques Fisher Scientific accuSkan FC. Pour normaliser les titres au point final Flag et Strep, la dilution du titre sérique a été calculée à laquelle chaque échantillon a dépassé la valeur seuil de DO de son anticorps monoclonal respectif à une concentration fixe de 20 ou 6,67 ng µl-1. Les titres ont été calculés par interpolation logarithmique des dilutions avec des lectures immédiatement au-dessus et immédiatement en dessous de la DO d'anticorps monoclonal utilisée58.

Pour les ELISA IgG sériques totaux, les plaques ont été recouvertes d'IgG anti-souris. Des courbes standard ont été générées à l'aide d'IgG de souris non marquées (Southern Biotech, 0107-01) et la détection a été réalisée à l'aide d'IgG-HRP anti-souris (Southern Biotech). Pour épuiser l'IgM des échantillons de sérum, des billes d'agarose anti-IgM de souris (Sigma-Aldrich, A4540) ont été utilisées conformément aux instructions du fabricant. Les billes ont été lavées avec du PBS et les échantillons ont été incubés dans un rapport de 1:20 échantillon/billes pendant une nuit à 4°C avec rotation. La fraction d'IgM liée aux billes a été éliminée par centrifugation pendant 3 min à 10 000 g, et la fraction de surnageant non liée a été utilisée pour les ELISA ultérieurs. Pour confirmer l'efficacité de l'épuisement des IgM, les taux d'IgM totaux ont été mesurés comme décrit ci-dessus pour les IgG totales, avec des IgM anti-souris de chèvre, des IgM non marquées et des IgM-HRP anti-souris (Southern Biotech).

Les titres de neutralisation du virus ont été évalués dans les fractions sériques Flag+ versus Strep+ d'échantillons prélevés sur des souris S1pr2-IgkTag immunisées par ARNm S–LNP. Pour séparer les fractions, une immunoprécipitation avec des billes magnétiques anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich, M8823-5ML) et des billes MagStrep de type 3 XT (IBA, 2-4090-010) a été réalisée conformément aux instructions du fabricant. En bref, les billes magnétiques ont été lavées avec un tampon d'échantillon (solution saline tamponnée au Tris pour les billes Flag et 1 × tampon W (IBA, 2-1003-100) pour les billes MagStrep) et les échantillons ont été incubés dans un rapport de 20 : 1 échantillon pour perler la résine pendant la nuit à 4 ° C avec rotation. Les fractions liées aux billes ont été séparées à l'aide d'un séparateur magnétique et jetées, tandis que la fraction non liée a été collectée. Les échantillons fractionnés ont été concentrés par centrifugation à la moitié de la concentration d'entrée et inactivés par la chaleur. Le degré auquel les échantillons de sérum totaux et fractionnés ont neutralisé WH1 et BA.1 SARS-CoV-2 a été approximé à l'aide du test de rapporteur de luciférase NanoLuc pseudotypé SARS-CoV-2 spike basé sur le VIH-1 décrit précédemment29. En bref, les échantillons de sérum ont été dilués en série cinq fois avec une dilution supérieure finale de 1:00 de sérum et incubés pendant 1 h à 37 ° C avec le virus rapporteur du VIH-1 pseudotypé SARS-CoV-2 WH1 ou BA.1 spike, puis transféré aux cellules HT1080/ACE2.cl1459. A 48 h, les cellules ont été lavées et lysées et l'activité luciférase a été mesurée à l'aide du Nano-Glo Luciferase Assay System (Promega) et du luminomètre Glomax Navigator (Promega). Les unités de luminescence relative ont été normalisées à l'aide de cellules infectées en l'absence de sérum, puis tracées dans GraphPad Prism. Les valeurs NT50 ont été calculées à l'aide d'une régression non linéaire à quatre paramètres (méthode de régression des moindres carrés sans pondération) des courbes présentées dans la Fig. 5b des données étendues. La moyenne de deux doublons techniques est indiquée, les points aberrants ont été exclus. Pour les comparaisons NT50 entre l'entrée et les fractions (Fig. 4g et Extended Data Fig. 5c), le NT50 des échantillons fractionnés a été ajusté pour égaliser le titre ELISA BA.1 RBD de l'étiquette non appauvrie par rapport à son titre ELISA correspondant dans l'entrée. fraction.

Des bibliothèques de variantes de saturation de site à un seul mutant en double ont été conçues en arrière-plan du SARS-CoV-2 Omicron BA.1 spike RBD et produites par Twist Bioscience, essentiellement comme cela a été fait précédemment pour d'autres variantes de SARS-CoV-260, 61. La carte GenBank du plasmide codant pour le RBD Omicron BA.1 non muté dans le vecteur de présentation de levure est disponible sur GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_DMS_Omicron/blob/main/data/3294_pETcon -SARS2-RBD_Omicron-BA1.gb). Les bibliothèques de variantes de saturation du site ont été livrées sous forme de fragments d'ADN double brin par Twist Bioscience et ont été codées à barres et clonées en masse dans le squelette du vecteur de présentation de la levure. L'ADN plasmidique de la bibliothèque mutante à code-barres a été électroporé dans Escherichia coli (cellules électrocompétentes NEB 10-beta, New England BioLabs, C3020K) et goulot d'étranglement à environ 1 × 105 UFC (une moyenne de> 25 codes-barres par mutant unique). L'ADN plasmidique a été purifié et transformé dans la souche de levure AWY101. Des codes-barres de seize nucléotides ont été associés à leurs variantes BA.1 par séquençage PacBio, et les effets des mutations de l'expression RBD et de la liaison ACE2 ont été mesurés, essentiellement comme décrit61. Ces expériences sont décrites et analysées sur GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_DMS_Omicron).

Des expériences de cartographie des mutations qui réduisent la liaison RBD des sérums de souris immunisées ont été réalisées en double biologique avec des bibliothèques mutantes WH1 ou BA.1 RBD indépendantes, de la même manière que celle décrite précédemment pour les anticorps monoclonaux62 et les échantillons de plasma polyclonal humain63. Tout d'abord, 75 µl de chacun des sérums ont été appauvris deux fois en anticorps non spécifiques de liaison à la levure en incubant pendant 2 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C avec 37,5 unités OD de levure AWY101 contenant un vecteur vide, comme décrit précédemment63 . Les bibliothèques de levures RBD mutantes WH1 et BA.161 ont été induites avec un milieu synthétique défini contenant du galactose et à faible teneur en dextrose avec des casaminoacides (SD-CAA, 6,7 g l−1 base azotée de levure, 5,0 g l−1 acides casaminés, 1,065 g l−1 MES acide et 2 % (w/v) galactose + 0,1 % (w/v) dextrose) pour exprimer RBD, puis lavé et incubé avec du sérum dilué pendant 1 h à température ambiante avec une agitation douce. Chaque combinaison testée de sérum de souris contre chaque bibliothèque de mutants WH1 ou BA.1 RBD pour la perte de liaison des anticorps Strep ou Flag-tag a été réalisée indépendamment. Pour chaque sérum, une dilution sous-saturante a été utilisée de telle sorte que la quantité de signal fluorescent due à la liaison des anticorps sériques au RBD était approximativement égale entre les échantillons (1: 1 000 pour la cartographie des anticorps Strep contre les bibliothèques WH1; 1: 200 pour la cartographie des anticorps Strep contre les bibliothèques BA.1 ; et 1:50 pour la cartographie des anticorps Flag contre les bibliothèques BA.1). Les bibliothèques de levure ont ensuite été marquées secondairement pendant 1 h avec des anticorps anti-MYC conjugués à 1:100 FITC (Immunology Consultants Lab, CYMC-45F) pour marquer l'expression de RBD et soit de la streptavidine conjuguée à 1:200 APC (Invitrogen S-868) pour marquer les anticorps Strep liés ou l'anti-Flag de rat conjugué à l'APC (BioLegend, 637308) pour marquer les anticorps marqués Flag liés. Une porte de sélection de cytométrie en flux a été dessinée pour capturer des mutants RBD avec une liaison d'anticorps réduite pour leur degré d'expression de RBD. Pour chaque échantillon, environ 4 × 106 cellules ont été traitées sur le trieur de cellules BD FACSAria II. Les cellules échappées au sérum ont été cultivées pendant une nuit dans du SD-CAA tel que défini ci-dessus avec du dextrose à 2 % (p/v), sans galactose et 100 U ml-1 de pénicilline + 100 µg ml-1 de streptomycine pour développer les cellules avant l'extraction du plasmide.

L'ADN plasmidique a été extrait de 30 unités OD (1,6 × 108 unités formant colonies (UFC)) de populations de levure de présélection et d'environ 5 unités OD (environ 3,2 × 107 UFC) de cultures d'une nuit de cellules échappées au sérum (Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II ) comme décrit précédemment60,62. Les codes à barres de 16 nucléotides identifiant chaque variant WH1 ou BA.1 RBD ont été amplifiés par réaction en chaîne par polymérase et préparés pour le séquençage Illumina comme décrit précédemment60,62. Les codes-barres ont été séquencés sur le système Illumina NextSeq 2000 avec des lectures à extrémité unique de 50 pb.

Les fractions d'échappement ont été calculées essentiellement comme décrit précédemment62. Nous avons utilisé le package dms_variants (https://jbloomlab.github.io/dms_variants/, v.1.4.0) pour compter chaque variante RBD à code-barres dans chaque population de présélection et d'échappement de sérum. Pour chaque sélection, nous avons calculé la fraction d'échappement pour chaque variante à code-barres par la formule fournie dans la réf. 62. Ces fractions d'échappement représentent la fraction estimée de cellules exprimant ce variant spécifique qui tombe dans la poubelle d'échappement, de sorte qu'une valeur de 0 signifie que le variant est toujours lié au sérum et une valeur de 1 signifie qu'il échappe toujours à la liaison au sérum. Nous avons ensuite appliqué un filtre informatique pour supprimer les variantes avec > 1 mutation d'acides aminés, un faible nombre de séquençage (<50 dans la condition de présélection) ou des mutations hautement délétères qui pourraient provoquer une fuite d'anticorps simplement en conduisant à une mauvaise expression de RBD correctement replié sur la levure. surface cellulaire (un score de liaison ACE2 <−2 ou un score d'expression RBD <−1,25 ou <−0,83361 pour les bibliothèques mutantes WH1 et BA.1, respectivement, reflétant les différents niveaux d'expression de base des deux RBD de type sauvage) . Les scores d'évasion d'anticorps signalés tout au long de l'article sont la moyenne des bibliothèques en double ; ces scores figurent également dans le tableau supplémentaire 1. Les corrélations dans les scores finaux d'échappement d'un seul mutant sont présentées dans les données étendues de la Fig. 6c. La documentation complète de l'analyse informatique est disponible sur GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS).

Le logo de la carte sérum-évasion et les tracés linéaires ont été créés à l'aide du package dmslogo (https://jbloomlab.github.io/dmslogo, v.0.6.2). La hauteur de chaque lettre indique la fraction d'échappement pour cette mutation d'acide aminé. Pour chaque sérum, les tracés du logo présentent n'importe quel site où, pour ≥1 condition d'étiquette de bibliothèque/anticorps, l'échappement total d'anticorps au site était > 10 × la médiane sur tous les sites et au moins 10 % le maximum de n'importe quel site. Pour chaque échantillon, l'axe y a été mis à l'échelle pour être le plus grand de (1) la métrique d'échappement maximale par site observée pour cet échantillon ou (2) 20 × la fraction médiane d'échappement par site observée sur tous les sites pour ce plasma. Le code qui génère ces visualisations de tracé de logo est disponible sur GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS/blob/main/results/summary/escape_profiles.md). Pour visualiser l'évasion sérique sur la structure RBD, la surface WH1 RBD (PDB : 6M0J) a été colorée par la métrique d'évasion par site sur chaque site, le blanc n'indiquant aucune évasion et le rouge indiquant le site avec le plus d'évasion.

Les tests statistiques utilisés pour comparer les conditions sont indiqués dans les légendes des figures. Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour déterminer la taille de l'échantillon. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide de GraphPad Prism v.9. L'analyse par cytométrie en flux a été réalisée à l'aide de FlowJo (v.10). Les graphiques ont été tracés à l'aide de Prism (v.9) et modifiés pour l'apparence à l'aide d'Adobe Illustrator CS. Pour les données tracées sur des échelles logarithmiques (telles que les titres d'anticorps sériques), une analyse statistique a été effectuée sur les données transformées en log. Les échantillons dont la réactivité était inférieure à la limite de détection se sont vu attribuer une valeur de 100, car la dilution maximale était de 1:100.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les lectures brutes d'Illumina des codes à barres variants de 16 nucléotides des expériences de balayage mutationnel profond sont disponibles au NCBI SRA sous BioProject PRJNA770094, BioSample SAMN30086726. Tous les scores d'échappement sont indiqués dans le tableau supplémentaire 1 et sont disponibles sur GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS/blob/main/results/supp_data/all_raw_data.csv). Les rendus des structures de pointe RBD et HA ont été obtenus à partir du PDB sous les codes d'accession 6M0J, 1RU7 et 3LZG.

Le code complet utilisé pour analyser les expériences de balayage mutationnel profond est disponible sur GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS). Le code pour générer les visualisations de tracé de logo est disponible sur GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS/blob/main/results/summary/escape_profiles.md).

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Nous remercions le personnel des installations de transgénèse et de ciblage génétique de l'Université Rockefeller pour avoir généré la souche de souris K-tag et le Comparative Biosciences Center pour le logement de la souris ; P. Wilson pour le pic SARS-CoV-2 WH1 recombinant et la protéine RBD ; JT Jacobsen pour l'assistance technique ; et tout le personnel de l'Université Rockefeller pour leur soutien continu. Cette étude a été financée par les subventions NIH/NIAID R01AI119006 et R01AI139117 à GDV, P01AI165075 à PDB, R01AI146101 et R01AI153064 à NP et R01AI141707 à JDB. la Fondation Robertson. AS a été soutenu par une bourse de doctorat du Fonds Boehringer-Ingelheim. PDB et JDB sont des enquêteurs HHMI. GDV est chercheur Burroughs-Wellcome dans la pathogenèse des maladies infectieuses, boursier Pew-Stewart et boursier MacArthur.

Laboratoire de dynamique des lymphocytes, Université Rockefeller, New York, NY, États-Unis

Ariën Schiepers, Marije FL van 't Wout, Luka Mesin & Gabriel D. Victora

Division des sciences fondamentales et programme de biologie computationnelle, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, États-Unis

Allison J. Greaney, Tyler N. Starr et Jesse D. Bloom

Laboratoire de rétrovirologie, Université Rockefeller, New York, NY, États-Unis

Trinity Zang et Paul D. Bieniasz

Département de microbiologie, Perelman School of Medicine, Université de Pennsylvanie, Philadelphie, PA, États-Unis

Hiromi Muramatsu et Norbert Pardi

Acuitas Therapeutics, Vancouver, Colombie-Britannique, Canada

Paulo JC Lin & Ying K. Tam

Institut médical Howard Hughes, Chevy Chase, MD, États-Unis

Paul D. Bieniasz et Jesse D. Bloom

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AS et MFLv'tW ont effectué tous les travaux expérimentaux, avec la contribution essentielle du LMAJG, réalisé et interprété les expériences de balayage mutationnel profond sous la supervision de TNS et JDBNP et HM a conçu et produit les ARNm codant pour WH1 et BA.1 S. PJCL et YKT ont formulé des ARNm en LNP. TZ a effectué des essais de neutralisation de pseudovirus sous la supervision de PDBAS et GDV a conçu l'allèle K-tag et toutes les expériences de l'étude et a rédigé le manuscrit avec la contribution de tous les auteurs.

Correspondance à Gabriel D. Victora.

NP est nommé sur un brevet (62/153,143 - ARN modifié par nucléoside induisant une réponse immunitaire adaptative), décrivant l'utilisation d'ARNm modifié par nucléoside dans les LNP comme plate-forme vaccinale. Il a entièrement divulgué ces intérêts à l'Université de Pennsylvanie et a mis en place un plan approuvé pour gérer tout conflit potentiel découlant de la licence de ce brevet. PJCL et YKT sont des employés d'Acuitas Therapeutics, une société impliquée dans le développement de thérapies ARNm-LNP. YKT est nommé sur un brevet (WO 2017/004143 — Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucléic acids) qui décrit les LNP pour la délivrance d'acides nucléiques thérapeutiques, y compris l'ARNm, et l'utilisation d'ARNm modifié dans des nanoparticules lipidiques comme plateforme vaccinale . PDB a effectué des travaux de conseil dans le domaine des vaccins COVID pour Pfizer. JDB consulte ou a récemment consulté pour Apriori Bio, Oncorus, Merck et Moderna sur des sujets liés aux virus, aux vaccins et à l'évolution virale. JDB, TNS et AJG sont répertoriés comme inventeurs sur les brevets sous licence de Fred Hutch (62/935 954 et 62/692 398) liés au balayage mutationnel profond viral. GDV et JDB sont des conseillers pour la Vaccine Company.

Nature remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Séquence nucléotidique de la matrice d'ADN de 522 pb utilisée pour générer l'allèle IgkTag, avec traductions d'acides aminés données pour toutes les séquences codantes (police en gras). Les nombres de nucléotides sont donnés pour chaque ligne. La traduction des acides aminés est positionnée sous le nucléotide central de chaque codon.

( a ) Parcelles représentatives de cytométrie en flux de cellules B périphériques (fermées: B220 + CD4 – CD8 – CD138 –) obtenues à partir du sang de souris WT et IgkTag / Tag, colorées pour l'expression de surface des immunoglobulines marquées Igλ et FLAG. (b) Concentration totale d'IgG dans le sérum de WT, IgkTag/Tag et Cd79aCre/+. Souris IgkTag/Tag comme déterminé par ELISA. Les différences n'étaient pas significatives par ANOVA unidirectionnelle (p < 0,05). ( c ) Cytométrie en flux de plasmocytes de moelle osseuse (PC) à l'état d'équilibre obtenus à partir de souris IgkFLAG / Strep adultes (âgées de 6 semaines). La stratégie de déclenchement pour les PC est indiquée dans le panneau de gauche (pré-fermé sur des cellules T non CD4/CD8), pour les PC IgA+ et Igλ– de surface dans le panneau du milieu et pour FLAG/Strep dans le panneau de droite. La quantification sur 9 souris de 3 expériences indépendantes est indiquée dans le panneau le plus à droite (chaque point représente une souris IgkFLAG/Strep individuelle, la ligne représente la médiane). ( d ) Courbes standard ELISA avec anticorps monoclonal (mAb) -FLAG et mAb-Strep détectés à des dilutions des anticorps HRP respectifs où les courbes se chevauchent. La concentration de mAb à laquelle les courbes ont franchi le seuil de fond d'absorbance (indiqué par les lignes pointillées) a été utilisée pour calculer le titre final, comme décrit dans la section méthodes. ( e ) Titres anti-TNP spécifiques à l'étiquette chez des souris IgkFLAG / Strep immunisées et immunisées avec un rappel ip avec TNP-KLH / alun aux moments indiqués par les flèches noires. Les résultats proviennent de 14 souris issues de 2 expériences indépendantes. Le point temporel du jour 7 n'a pas été collecté pour la première cohorte. Les lignes fines représentent les souris individuelles, les lignes épaisses relient les médianes des valeurs de titre transformées en log à chaque instant. ( f ) Cytométrie en flux de souris S1pr2-IgkWT / Tag comme sur la Fig. 1d, e. avec la quantification en (g), cre– et aucun groupe témoin de tamoxifène n'est inclus. Les points de données proviennent de 6 à 13 ganglions lymphatiques poplités par groupe d'au moins 2 expériences indépendantes. ( h ) Réactivité ELISA anti-TNP pour les souris S1pr2-IgkTag / Tag immunisées comme sur la figure 1d. Le sérum a été obtenu à 47 dpi de 6 souris qui ont reçu du tamoxifène et 4 qui n'ont pas reçu de tamoxifène. L'absorbance ELISA IgG (gauche), FLAG (milieu) et Strep (droite) est indiquée. Les échantillons ont été dilués au 1:100.

( a ) Cytométrie en flux des GC secondaires dans la rate de 3 souris TNP-KLH ip amorcées et boostées S1pr2-IgkTag / Tag, avec marquage au tamoxifène à 4, 8 et 12 dpi. Gated sur des cellules GC B (FAS + CD38 – B220 + CD4 – CD8 – CD138 –) exprimant FLAG ou Strep-tag comme sur la Fig. 1e. ( b ) Concentrations totales d'IgM des échantillons de sérum avant et après l'épuisement des IgM par immunoprécipitation, mesurées par ELISA. Les données proviennent de 8 échantillons de sérum, provenant des mêmes 4 souris que sur la figure 2c. ( c ) Titres anti-TNP spécifiques à l'étiquette avant et après l'épuisement des IgM pour les échantillons prélevés 6 jours après le premier et le deuxième rappel avec TNP-KLH (mêmes échantillons que dans ( b ) et Fig. 2c). Les barres représentent les moyennes des titres transformés en log et les barres d'erreur sont SEM. Les valeurs P sont pour un test T bilatéral apparié, seules les valeurs statistiquement significatives (p < 0,05) sont indiquées. ( d ) Titres anti-RBD Strep + de fond chez des souris témoins S1pr2-IgkTag / Tag immunisées comme sur la Fig. 2b, e, mais non traitées avec du tamoxifène. Les graphiques montrent le pourcentage médian du titre anti-RBD qui est Strep+ ((S/(S + F)*100)) en l'absence de tamoxifène avant le rappel et deux semaines après les deuxième et troisième immunisations. Cela représente le pourcentage médian par lequel les titres FLAG+ dans les réponses de rappel sont susceptibles d'être sous-estimés par la recombinaison spontanée par le pilote S1pr2-CreERT2. Les données proviennent de 8 souris issues de 2 expériences indépendantes. ( e ) Comparaison des données primaires sur la dépendance présentées à la Fig. 2e, f, stratifiées par cohorte et boost ipsilatéral par rapport au boost controlatéral. La 4ème cohorte de souris est le groupe boosté de manière homologue illustré à la Fig. 4b—e, représenté ici par des cercles ouverts. Les barres représentent la moyenne des titres transformés en log, les barres d'erreur sont SEM. Les données proviennent de 16 souris de 4 cohortes indépendantes. ( f ) Comparaison de la dépendance primaire entre les 3e et 4e réponses chez 9 souris de 2 cohortes, sur la base des données de la Fig. 2e, f, h. Les barres représentent la moyenne des titres transformés en log, les barres d'erreur sont SEM.

( a ) Comparaison des réponses d'anticorps FLAG + de novo à HAFM1 en présence ou en l'absence d'infection primaire par le virus de la grippe PR8. Les données PR8>FM1>FM1 concernent les mêmes échantillons que sur la Fig. 3d, remesurées dans le même dosage que Ø>FM1>FM1. ( b ) Représentation schématique de la stratégie HA prime-boost. Les souris S1pr2-IgkTag/Tag ont été amorcées par voie ip avec HANY95 dans un alhydrogel et stimulées de manière homologue ou hétérologue avec HAN99 ou HACA09 dans un alhydrogel, comme indiqué. ( c ) Évolution à plein temps de la réactivité ELISA spécifique à l'étiquette anti-HA (densité optique à une dilution de 1: 100) des mêmes souris illustrées à la Fig. 3f. Les ELISA anti-HANY95 (en haut), HANC99 (au milieu) et HACA09 (en bas) sont présentés, avec détection de Strep (à gauche) et FLAG (à droite). (d) Relation entre la dépendance primaire et la distance antigénique pour les expériences d'infection et d'immunisation. Le graphique compile les indices de dépendance primaires des Fig. 3d et 3g. Les barres sont classées par identité d'acides aminés entre les HA d'amorçage et de rappel. Les valeurs P sont pour une ANOVA unidirectionnelle, avec % d'identité comme variable catégorielle, ou corrélation de Pearson, avec (100 - % d'identité) comme variable linéaire.

( a ) Efficacité du fractionnement du sérum en fractions FLAG et Strep-appauvries, telle que mesurée par ELISA anti-RBD des échantillons d'entrée par rapport aux échantillons post-épuisement. Le sérum a été obtenu à partir de souris immunisées de manière hétérologue deux semaines après la 3ème immunisation, Fig. 4d (8 souris de 2 expériences indépendantes). (b) Neutralisation de WH1 (à gauche) et de BA.1 (à droite) SARS-CoV-2 S-exprimant le virus VIH-1 pseudotypé par les fractions sériques indiquées en (a). Les valeurs moyennes des doublons techniques sont indiquées. ( c ) Titres NT50 du pseudovirus WH1 S pour les échantillons en ( b ). Les NT50 post-épuisement ont été normalisés au sérum d'entrée sur la base des titres ELISA BA.1 RBD (a), en appliquant une correction égalisant le titre anti-RBD Strep de la fraction appauvrie en FLAG à l'entrée, et le FLAG anti-RBD -titre de la fraction déplétée en Strep à l'entrée. Les valeurs P sont pour le test T apparié unilatéral. FC, changement de pli. ( d ) Estimation de la contribution des anticorps de novo par rapport aux anticorps dérivés de la mémoire à la neutralisation excessive de BA.1 par le régime WBB. La contribution de la maturation d'affinité secondaire ou de la sélection préférentielle des lymphocytes B mémoire à réaction croisée par le rappel de BA.1, ΔS, est calculée comme la différence entre les titres de neutralisation Strep+ WBB et total WWW BA.1 (ces derniers sont supposés être tous FLAG+). La contribution des anticorps spécifiques de BA.1 induits de novo par le rappel de BA.1, F, est donnée par le titre FLAG+ WBB. La contribution en pourcentage de F à la neutralisation BA.1 améliorée dans WBB est calculée comme (F/(F + ΔS))*100. Les barres et les lignes pointillées représentent les médianes pour chaque condition, qui ont été utilisées pour calculer F et ΔS. La ligne pointillée supérieure (4.) représente la neutralisation médiane des anticorps WBB totaux et est indiquée à des fins de référence uniquement. Les données des groupes 1 et 4 sont reproduites à partir de la Fig. 4b, les données des groupes 2 et 3 de la Fig. 4h.

(a) En haut : Parcelles représentatives de la stratégie de gating FACS imbriquée utilisée pour toutes les expériences afin de sélectionner des cellules de levure uniques. En bas : Stratégie de déclenchement pour sélectionner des cellules individuelles exprimant RBD (FITC-A vs FSC-A). ( b ) Stratégie de gating FACS pour l'une des deux bibliothèques indépendantes pour sélectionner des cellules exprimant des mutants BA.1 ou WH1 RBD avec une liaison réduite aux anticorps Strep ou FLAG (cellules en bleu), mesurée par coloration secondaire avec de la streptavidine conjuguée à l'APC ou conjuguée à l'APC anticorps anti-FLAG, respectivement. Les portes ont été définies manuellement pour chaque échantillon afin de capturer les cellules qui ont une quantité réduite de liaison d'anticorps étiquetés pour leur degré d'expression de RBD. Les diagrammes de dispersion FACS étaient qualitativement similaires entre les deux bibliothèques. L'identifiant de la souris (#1-4), la bibliothèque cible DMS (WH1 ou BA.1) et l'étiquette d'anticorps (Strep ou FLAG) sont indiqués au-dessus de chaque parcelle. ( c ) Corrélations au niveau de la mutation (à gauche) et du site (à droite) des scores d'échappement entre deux bibliothèques biologiques répliquées indépendantes.

Résultats de l'analyse mutationnelle profonde du sérum prélevé sur 4 souris immunisées de manière hétérologue, 2 semaines après la 3ème dose (Fig. 4d). La "fraction d'échappement" de chaque mutation a été mesurée, qui varie de 0 (aucun effet des cellules sur la liaison des anticorps) à 1 (toutes les cellules porteuses de la mutation ont une liaison des anticorps réduite). La souris 4 n'est pas montrée dans le texte principal car il n'y avait pas de pics interprétables dans la liaison des anticorps aux bibliothèques BA.1 pour l'une ou l'autre des fractions d'anticorps. Les tracés de logo montrent les fractions d'échappement d'anticorps pour des mutations d'acides aminés individuelles sur des sites clés d'échappement fort. Les sites dans lesquels BA.1 diffère de la séquence WH1 sont indiqués en violet. Tous les scores d'échappement sont présentés dans le tableau supplémentaire 1 et sont disponibles en ligne sur https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS/blob/main/results/supp_data/all_raw_data.csv.

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Réimpressions et autorisations

Schiepers, A., van 't Wout, MFL, Greaney, AJ et al. Cartographie du destin moléculaire des réponses d'anticorps sériques à une immunisation répétée. Nature 615, 482–489 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05715-3

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Reçu : 29 août 2022

Accepté : 06 janvier 2023

Publié: 16 janvier 2023

Date d'émission : 16 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-023-05715-3

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