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Communications Biology volume 6, Article number: 277 (2023) Citer cet article

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L'élargissement de l'arsenal d'approches prophylactiques contre le SRAS-CoV-2 est de la plus haute importance, en particulier les stratégies qui résistent à la dérive antigénique chez Spike. Ici, nous avons effectué un criblage de plus de 16 000 déclencheurs ARNi contre le génome du SRAS-CoV-2, en utilisant un test massivement parallèle pour identifier les siARN hyper-puissants. Nous avons sélectionné dix candidats pour la validation in vitro et avons trouvé cinq siARN qui présentaient une activité hyper-puissante (IC50 < 20 pM) et un fort blocage de l'infectivité dans les expériences de virus vivants. Nous avons encore amélioré cette activité par appariement combinatoire des candidats siARN et identifié des cocktails actifs contre plusieurs types de variants préoccupants (VOC). Nous avons ensuite examiné plus de 2 000 mutations possibles dans les sites cibles d'ARNsi en utilisant la mutagenèse à saturation et confirmé une large protection du cocktail principal contre de futures variantes. Enfin, nous avons démontré que l'administration intranasale de ce cocktail d'ARNsi atténue efficacement les signes cliniques et les mesures virales de la maladie dans le modèle de référence du hamster syrien. Nos résultats ouvrent la voie au développement d'une couche supplémentaire de prophylaxie antivirale orthogonale aux vaccins et aux anticorps monoclonaux.

Le Covid-19 a été l'une des pires pandémies mondiales des temps modernes. Bien que les vaccins aient été un triomphe majeur, il est urgent d'élargir l'arsenal de mesures préventives pour remédier à certaines de leurs lacunes1. Premièrement, pratiquement tous les vaccins homologués ciblent la protéine Spike2,3, convergeant vers un seul point de défaillance, compte tenu de l'exposition aux mutants d'échappement et aux variantes virulentes émergentes4,5,6,7,8. De plus, comme tous les traitements par anticorps monoclonaux (mAb) ciblent cette même protéine, de tels déplacements antigéniques entravent non seulement la protection des vaccins, mais peuvent également réduire l'efficacité d'un large éventail d'autres types de traitement. Deuxièmement, plusieurs études ont montré que la protection des vaccins, y compris contre les maladies graves, diminue généralement en quelques mois seulement, après la deuxième9, la troisième10,11 ou la quatrième dose12. Troisièmement, des éléments de preuve récents provenant de souris et de primates non humains (PNH) suggèrent que les versions mises à jour des vaccins présentent une efficacité réduite et peuvent être sujettes au péché antigénique d'origine13,14, lorsque la première exposition à un virus façonne le résultat des expositions ultérieures aux souches antigéniquement apparentées. Ces données suggèrent l'utilité limitée des mises à jour des vaccins pour les variantes émergentes préoccupantes (VoC). Quatrièmement, les médicaments antiviraux tels que Paxlovid n'ont pas réussi à protéger les adultes contre l'exposition au COVID-19. Enfin, plusieurs études montrent systématiquement qu'il est difficile d'obtenir une protection élevée chez les personnes immunodéprimées, même après des doses répétées15, ce qui implique que les personnes qui ont le plus besoin d'un vaccin sont les moins susceptibles d'en bénéficier. Enfin, les infections chez les personnes immunodéprimées peuvent avoir une durée prolongée16,17, ce qui augmente le risque d'hyper-évolution et d'émergence de COV, faisant ainsi peser des risques majeurs sur la santé publique.

Forts du succès de plusieurs études antérieures où les petits ARN interférents (siARN) étaient efficacement utilisés comme antiviraux18,19,20,21, nous avons envisagé que les siARN administrés par voie intranasale (in) seraient particulièrement bien adaptés comme mesure d'augmentation du vaccin pour les infections de les voies respiratoires supérieures, où ils peuvent être utilisés pour atténuer la transmission.

À cette fin, nous avons criblé plus de 16 000 déclencheurs d'interférence ARN (ARNi) ciblant le génome du SRAS-CoV-2 afin d'identifier des candidats hyper-puissants. L'écran s'est appuyé sur un test massivement parallèle, Sens.AI, qui utilise un système de biologie synthétique pour récapituler l'activité de silençage de chaque candidat siRNA contre le virus. Dans nos études précédentes22,23, nous avons utilisé une version antérieure de Sens.AI pour identifier les siARN hyper-puissants contre le VIH et le VHC. Cependant, la conception précédente était inefficace, prenant plus de 6 mois à réaliser. Dans la nouvelle conception, nous avons inventé une méthode plus rapide qui améliore le rapport signal sur bruit en utilisant l'apprentissage statistique au lieu d'étapes expérimentales laborieuses. Des analyses informatiques approfondies et des expériences in vitro ont produit un cocktail de deux candidats siARN hyper-puissants, qui se sont avérés efficaces contre toutes les souches virales testées. Enfin. l'administration intranasale de ce cocktail d'ARNsi a été confirmée comme efficace dans le modèle de hamster syrien du SARS-CoV-2.

Nous avons analysé le génome du SARS-CoV-2 en une série de cibles potentielles d'ARN en épingle à cheveux courts (shRNA) (Fig. 1 supplémentaire). Ce processus a été mené en pavant le génome avec des séquences de 50 nucléotides qui se chevauchent, chacune décalée d'un seul nucléotide par rapport à l'autre. La région ciblée par chaque shRNA comprenait une étendue de 22 nucléotides positionnés au milieu de la séquence de 50 nucléotides, et le reste de la séquence flanquante servait à préserver le contexte génomique. Nous avons ensuite appliqué plusieurs filtres in silico pour exclure les régions cibles à faible fidélité de synthèse, celles qui ne dépassent pas un seuil minimal de conservation entre les souches virales, celles contenant des attributs de séquence généralement associés à une mauvaise réponse shRNA et celles possédant des régions de graines qui peuvent potentiellement correspondent à un transcrit humain (tableau supplémentaire 1). Au total, ce processus a récupéré 16 471 candidats shRNA ciblant le génome du SRAS-CoV-2 et son brin négatif ARN1 sous-génomique. Enfin, cette bibliothèque a été complétée par un ensemble de 1 118 shARN témoins positifs et négatifs qui avaient été rapportés dans des cribles antérieurs contre des gènes liés au cancer dans le génome de la souris22.

Nous avons synthétisé ces 17 589 shARN et leurs régions cibles correspondantes de 50 nucléotides à l'aide d'un pool d'oligo-ADN (Twist Bioscience). Chacun de ces oligos mesurait 185 nucléotides de long et se composait de deux sites d'hybridation PCR, le shRNA à base de miR-30, un guide et son brin passager selon notre conception, un espaceur contenant des sites de clonage et une région de 50 nucléotides qui récapitulait le site cible avec son contexte génomique (Fig. 1a). Nous avons utilisé une série d'étapes de clonage pour introduire un gène rapporteur de Vénus dans la région de l'espaceur, de sorte que le 3'UTR de Vénus inclue la région cible de 50 nucléotides et insère l'ensemble de cette construction dans notre bibliothèque de rétro-vecteurs (Fig. 1b).

une conception Oligo. Chaque oligo avait un déclencheur ARNi unique dans le contexte d'un squelette miR-30 avec un tronçon de 50 nucléotides flanquant le site cible de l'ARNi viral ; b Conception de la bibliothèque. Chaque plasmide contenait un déclencheur ARNi spécifique et son site cible correspondant en cis dans le cadre du 3'UTR d'un journaliste Venus ; c–e Schéma d'un crible in vitro dans des cellules humaines : c La machinerie ARNi a d'abord été éteinte. Les cellules Dicer-/- 293FT ont été infectées avec la bibliothèque de plasmides et triées pour l'expression de Venushigh, qui a formé la lecture de T0 ; d La machinerie ARNi a ensuite été mise en marche. Nous avons restauré la machinerie ARNi par l'expression ectopique d'un Dicer déstabilisé (ddDicer) ; e L'activité de la machinerie ARNi a été modulée quantitativement. Deux réplicats biologiques ont été soumis à sept conditions différentes, conçues pour titrer l'expression de Dicer soit vers le bas, par traitement avec un siRNA anti-Dicer, soit vers le haut, par traitement avec Shield-1. Lors du tri FACS, les cellules Venuslow et Venusdark ont été collectées et leurs régions de constructions oligo ont été séquencées; f La matrice de données résultante de l'écran. Chaque rangée représente une combinaison spécifique d'une condition de traitement (la colonne la plus à gauche) et d'une porte FACS (notée D, pour Dark, et L, pour Low). Ces vecteurs de ligne décrivent l'enrichissement de chaque déclencheur ARNi testé (bleu) par rapport aux contrôles négatifs (surlignés en vert) et positifs (surlignés en rouge). La colonne de l'aire sous la courbe (AUC) a été calculée sur la base de la capacité à distinguer les contrôles positifs des contrôles négatifs ; g Sélection des deux meilleures conditions. Les vecteurs à deux rangées avec l'ASC la plus élevée ont été sélectionnés. Les courbes des caractéristiques de rappel de précision (à gauche) et de fonctionnement du récepteur (à droite) calculées pour les commandes intrinsèques sont présentées. Le score d'écran de chaque déclencheur ARNi a été calculé comme la moyenne de ces vecteurs à deux rangées.

Notre procédure de dépistage consistait en deux étapes pour réduire l'effet de la variation de position qui peut être introduite par l'intégration rétro-vectorielle. Nous avons d'abord effectué le criblage dans une lignée cellulaire humaine Dicernull/null 293FT, conçue via CAS9/CRISPR knock-out (Fig. 1c; Supplémentaire Fig. 2a, b). L'absence de Dicer a empêché la maturation des shARN, découplant efficacement entre l'expression de Vénus et la puissance de chaque shARN codé. Dans l'ensemble, nous avons transduit 1,2 million de cellules Dicernull/null 293FT avec des rétro-vecteurs qui ont codé notre bibliothèque à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,8. Trois jours après l'infection, nous avons trié par FACS quatre millions de cellules Venushigh Dicernull/null 293FT sur un total de 50 millions de cellules. Ces cellules représentent des exemples d'intégration de construction réussie dans des loci génomiques, ce qui s'est traduit par une expression adéquate de Vénus. Nous avons ensuite restauré l'expression de Dicer en utilisant une construction synthétique et une expression modulée de DICER pour coupler le signal optique et la puissance de chaque shRNA (Fig. 1d). La construction synthétique était une fusion entre Dicer humain et un domaine déstabilisant (ddDicer) qui était basé sur une protéine humaine mutante FKBP12, nous permettant d'augmenter l'activité de Dicer en utilisant Shield-124. De plus, nous avons utilisé un siRNA contre Dicer pour induire l'effet inverse, réduisant son expression. L'idée principale derrière ces diverses conditions était d'identifier un régime dans lequel la machinerie ARNi permet aux shARN hyper-puissants d'inhiber leurs cibles, mais est trop faible pour supporter l'activité des shARN moins puissants.

Au total, nous avons criblé la bibliothèque dans huit conditions différentes d'expression de ddDicer (Fig. 1e). La première condition, que nous avons attribuée à T0, était dépourvue de ddDicer et reflétait l'abondance relative non manipulée des différents shARN. Les autres conditions contenaient des doses accrues de Shield-1 (pour induire l'activation de ddDicer) ou d'un siARN anti-Dicer (pour inhiber Dicer). Nous avons appliqué chacune de ces sept conditions à deux répétitions biologiques. Nous avons ensuite trié les cellules de chaque réplique en trois bacs en fonction de leur expression de Vénus : haut, bas et sombre, suivis du séquençage des bacs bas et sombres afin de décrypter le niveau et l'identité des shARN. Nous avons également séquencé des shRNA non triés T0 pour décrire la distribution des shRNA dans la bibliothèque initiale. Dans l'ensemble, nous avons obtenu (2 [réplique] × 2 [bacs de tri] × 4 [niveaux d'expression Dicer] + 1 [T0] =) 17 bibliothèques de séquençage (Illumina MiSeq), chacune composée de lectures appariées de 150 pb. Au total, nous avons obtenu 36 millions de lectures en moyenne pour chaque bibliothèque. Nous avons analysé la région de 50 paires de bases qui correspondait à la cible de ces bibliothèques, les avons annotées à leur shRNA et compté le nombre d'apparitions uniques de chaque shRNA dans chaque condition. Enfin, nous avons utilisé DESeq225 pour mesurer l'enrichissement du shRNA dans chaque condition par rapport à T0 et avons moyenné les deux réplicats biologiques. Ce processus a donné une matrice de 8 par 17 589 (Fig. 1f), où chaque colonne représentait un shRNA, pour lequel chaque ligne représente l'un des traitements (siRNA ou Shield-1, chacun pour l'un des deux bacs de tri, bas et sombre ), et la statistique d'enrichissement (la colonne la plus à droite) a ensuite été représentée par l'aire sous la courbe (AUC) telle que calculée par DESeq2.

Ensuite, nous avons utilisé nos contrôles internes pour identifier les paramètres optimaux qui séparent les shARN hyper-puissants du reste de la bibliothèque (Fig. 1f, g). Nous avons calculé l'ASC pour distinguer les contrôles peu puissants des contrôles hyper puissants en utilisant la statistique d'enrichissement DESeq2. En général, ce processus a montré que les bacs de Vénus bas surpassaient considérablement les bacs sombres en termes de distinction entre les contrôles hyper-puissants et pauvres. De plus, les conditions contenant Shield1 ont obtenu de meilleurs résultats que les conditions Shield-null, les concentrations de 10 pM et 100 pM étant les plus performantes. Par conséquent, nous avons décidé de nous concentrer sur ces deux conditions avec la porte de Vénus basse comme conditions optimales pour distinguer les nouveaux shARN hyper-puissants de ceux peu performants. Après s'être concentré sur les déclencheurs ARNi avec une couverture de séquençage élevée, ces deux conditions avaient des scores AUC approchant 80% pour les contrôles internes. Plus important encore, ces deux conditions affichaient une valeur prédictive positive (VPP) parfaite pour les contrôles internes lors de la restriction du rappel aux 5 % supérieurs de la liste.

Après avoir identifié les paramètres optimaux, nous avons classé les shRNA candidats SARS-CoV-2 en utilisant un processus similaire à celui utilisé pour les contrôles internes. Pour chaque shRNA, nous avons utilisé la statistique DESeq2 de chacune des conditions sous les mêmes restrictions de couverture de séquençage. Le résultat final était une liste ordonnée de shARN dans toutes les conditions testées, avec le shARN le plus puissant en haut, le moins puissant en bas.

Ensuite, nous avons validé le classement de notre écran en utilisant plusieurs méthodes. Premièrement, nous avons analysé la corrélation entre les tests statistiques SARS-CoV-2 shRNA dans les deux conditions les plus performantes. Cette analyse a révélé que la corrélation de Pearson entre les statistiques rapportées des deux conditions était de 72, 2% (p <10−9), indiquant que les résultats de l'écran avaient une cohérence interne significative (Fig. 2a). Ensuite, nous nous sommes concentrés sur les caractéristiques de séquence de nos shARN. Des études antérieures ont rapporté que les shARN très puissants étaient généralement associés à l'absence d'adénine en 20e position du guide22. Par conséquent, nous avons évalué la fréquence de l'adénine en fonction du score de dépistage moyen des deux conditions. Cette analyse a révélé une corrélation significative (Pearson = 90,4 %, p < 10−20) entre la fréquence des shRNA du SARS-CoV-2 sans adénine dans leur 20e position et la statistique de dépistage moyenne (Fig. 2b). En fait, les meilleurs shARN de notre criblage étaient pratiquement tous appauvris en adénine en position 20. Enfin, nous avons comparé les résultats de notre criblage aux prédictions de puissance de shARN in silico produites par un algorithme d'apprentissage automatique publié26 (Fig. 2c). Alors que la prédiction de ces algorithmes était loin d'être parfaite pour chaque déclencheur ARNi individuel, nous avons trouvé une corrélation hautement significative (Pearson = 90,6 %, p < 10−20) entre les scores de cet algorithme et notre score d'écran moyen.

a Les scores à l'écran avaient une cohérence interne élevée. Les résultats de l'écran ont montré une corrélation de Pearson de 72,2 % entre les scores dans les deux conditions les plus performantes ; b Enrichissement des caractéristiques associées aux shARN puissants. La probabilité de ne pas trouver d'adénine en position 20 des déclencheurs ARNi ciblant le SRAS-CoV-2 a augmenté avec les scores de dépistage, récapitulant les études précédentes indiquant que lorsque l'adénine occupe la position 20, elle affaiblit la maturation du shRNA ; c Les scores de dépistage sont fortement corrélés aux prédictions bioinformatiques. Les scores d'écran, représentant les statistiques d'enrichissement telles que calculées par DESeq2, étaient fortement corrélés avec un algorithme d'apprentissage automatique publié prédisant la puissance des shARN ; d Filtrer les résultats et les candidats sélectionnés. Le graphique montre les scores d'écran résultants de chaque déclencheur ARNi qui a dépassé le seuil de qualité, en fonction de la position le long du génome viral. Orange : déclencheurs ARNi ciblant les régions conservées entre le SARS-CoV et le SARS-COV-2. Vert : Les dix candidats sélectionnés. Bleu : tous les autres riggers RNAi ; e Courbes dose-réponse des dix candidats sélectionnés. Les siARN ont été testés à l'aide d'un test de rapporteur. Le graphique représente le rapport médian standardisé entre l'expression de mCherry (gène rapporteur) et GFP (gène de contrôle); f Scores de puissance de chacun des 10 candidats sélectionnés. La valeur IC50 de chacun des 10 candidats a été calculée sur la base des courbes dose-réponse en (e). Les erreurs standard pour les calculs IC50 ont été calculées à l'aide d'un bootstrap statistique sur tous les points de données à chaque niveau de concentration.

Encouragés par ces résultats, nous avons sélectionné manuellement dix candidats pour une expérimentation plus poussée (Tableau 1 ; Fig. 2d). Les cinq premiers candidats (S1-S3 et S5-S6) ont été sélectionnés principalement sur la base de leur score de dépistage moyen dans les deux conditions les plus performantes tout en s'efforçant de représenter plusieurs gènes viraux. Les cinq autres candidats (S4 et S7-S10) ont également été sélectionnés sur la base de leurs scores de dépistage, mais limités aux régions 22mer entièrement conservées entre le SARS-CoV et le SARS-CoV-2, car nous avons émis l'hypothèse que ces régions pourraient être applicables à l'avenir. les retombées des bêta-coronavirus également. Pour tester nos shRNA présélectionnés, nous avons cloné leur région cible dans le 3'UTR de mCherry et converti chaque shRNA en son siRNA correspondant. Nous avons ensuite transfecté chaque journaliste avec des doses réduites de son ARNsi correspondant pour identifier sa concentration inhibitrice demi-maximale (IC50). Huit des dix ARNsi testés présentaient des valeurs IC50 inférieures à 50 pM (Fig. 2e, f; Tableau supplémentaire 2), dont cinq présentaient des valeurs IC50 inférieures à 20 pM. Un seul candidat, S9, a montré une valeur IC50 relativement faible dans ce test (IC50 > 1,4 uM). Dans l'ensemble, ces résultats montrent que notre nouvelle méthode de criblage à l'échelle du génome identifie les siARN hyper-puissants en un seul cycle.

Parallèlement au dépistage Sens.AI, nous avons utilisé un pipeline de découverte plus traditionnel pour identifier les siARN contre le SARS-CoV-2. Notre motivation était d'évaluer les statistiques de performance, les caractéristiques techniques et les propriétés logistiques de notre nouveau pipeline Sense.AI par rapport aux algorithmes de prédiction de siRNA de pointe. À cette fin, nous avons utilisé trois algorithmes open source de prédiction de la puissance des siARN : RNAxs27, DSIR28, OligoWalk29, pour évaluer par ordinateur plus de 815 sites cibles potentiels, en nous concentrant sur les régions qui avaient précédemment montré de bons résultats contre le SARS-CoV30,31,32. Il y avait une corrélation relativement faible entre les algorithmes, à des corrélations de Spearman comprises entre 0,4 et 0,02 (Fig. 3 supplémentaire). Ensuite, nous avons sélectionné manuellement les candidats siARN qui étaient systématiquement meilleurs dans tous les programmes, à l'exclusion des candidats avec des régions de graines complémentaires au transcriptome humain. Cette liste a donné 88 siARN que nous avons synthétisés et testés par le même test de rapporteur (à 1 nM par candidat) décrit ci-dessus. Nous avons ensuite priorisé les 27 siARN les plus prometteurs et les avons retestés à des concentrations de 500 pM et 100 pM (Fig. 4 supplémentaire), constatant que 9 de ces 27 candidats inhibaient l'expression du rapporteur de plus de 50% (100 pM).

Ensuite, nous avons évalué nos meilleurs candidats à partir de l'écran du capteur et du pipeline bioinformatique à l'aide d'un test d'infection in vitro SARS-CoV-2 en direct de référence. Nous avons transfecté des cellules Vero E6 avec 100 nM de chacun des candidats ARNsi Sens.AI en triple. En tant que contrôle négatif, nous avons également transfecté des cellules avec un faux ARNsi ciblant l'eGFP. Après 24 heures, nous avons défié les cellules avec 60xTCID50, 600xTCID50 ou 6000xTCID50 du SARS-CoV-2 vivant (souche ancestrale). Enfin, nous avons mesuré le niveau de charge virale 48 heures après l'infection initiale via qPCR, en sondant les gènes RdRP et E.

Nous avons constaté que six des neuf siARN testés de notre crible étaient capables de réduire considérablement la quantité d'ARN viral. Alors que les résultats étaient qualitativement cohérents pour les trois titres de virus testés (Fig. 3 et Fig. 5a, b supplémentaires), nous avons décidé de nous concentrer sur le titre 600xTCID50 pour les futures expérimentations, car il offrait la plus grande plage dynamique (Fig. 3a). Dans ces conditions, nos cinq siARN les plus performants ont réprimé la charge virale génomique de > 95 %. Fait intéressant, S8 et S10 ont montré de faibles réponses, au niveau d'environ 10 % d'inhibition du SRAS-CoV-2 par rapport au siRNA témoin, malgré une puissance très élevée dans le dosage du rapporteur (IC50 < 20 pM). Cependant, contrairement aux autres candidats siARN, ces deux cibles ciblent le brin négatif du virus, qui est un intermédiaire dans le processus de réplication. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que le ciblage de cette molécule d'ARN intermédiaire n'interférerait probablement pas avec la réplication virale. Pour confirmer davantage nos meilleurs candidats, nous avons évalué l'effet sur l'infectivité du virus vivant dans les cellules à l'aide du test TCID50 (Fig. 3b). Encore une fois, nous avons trouvé une forte activité inhibitrice des trois premiers siRNA sur quatre, la répression virale présentant environ deux ordres de grandeur par rapport au contrôle siRNA GFP. Nous avons ensuite utilisé les mêmes paramètres pour tester cinq des siARN les plus puissants de la méthode de découverte open source (tableau supplémentaire 3). Un seul candidat, Hel14, a affiché des niveaux de répression de la charge virale de> 95%, à égalité avec les niveaux présentés par les meilleurs siARN de notre écran Sens.AI (~ 90% d'inhibition) (Fig. 3c).

Bleu et orange : résultats qPCR des transcrits E et RdRP, respectivement. Sauf indication contraire, la charge virale à 100 % a été calibrée au niveau viral après traitement avec un siARN anti-GFP. a Charge virale de SARS-CoV-2 (souche ancestrale) après traitement avec les meilleurs candidats siARN du crible Sens.AI ; b Niveaux TCID50 du SRAS-CoV-2 (souche ancestrale) après traitement avec quatre des meilleures molécules d'ARNsi. Dans chaque lot d'expériences, un siARN contre eGFP a été utilisé comme contrôle négatif (panneau de gauche n = 3, panneau de droite n = 1, barres d'erreur = SEM, la signification a été calculée à l'aide du test t) ; c Charge virale de SARS-CoV-2 (souche ancestrale) après traitement avec le top siRNA du pipeline bioinformatique ; d L'effet de divers cocktails d'ARNsi contre le SRAS-CoV-2 (souche ancestrale). Les résultats ont été calibrés à la répression de S3 à la même concentration ; e Charge virale du SRAS-CoV-2 (souche ancestrale) après traitement avec des cocktails d'ARNsi en culture ALI. La charge virale a été mesurée dans les milieux prélevés sur les milieux à 48, 72 et 96 heures après l'infection (n = 2 échantillons indépendants, barres d'erreur = SEM). f Post-traitement de la charge virale avec des cocktails d'ARNsi contre le delta du SRAS-CoV-2 par rapport à la souche ancestrale (n = 3 échantillons indépendants, barres d'erreur = SEM). g Charge virale du SARS-CoV-2 Omicron versus la souche ancestrale après traitement avec le cocktail S5/Hel14 et d'autres types d'antiviraux ; (h) Analyse DeSEQ2 du traitement du réplicon SARS-CoV-2 avec le cocktail d'ARNsi S3/S5. Nous avons observé une forte diminution de la couverture autour des sites de clivage S3 (~ 23, 5 kbase) et S5 (~ 28 kbase) le long de la séquence du réplicon (valeurs FDR 4 × 10-83 et 6 × 10-22, respectivement). Les barres d'erreur dans les panneaux ef représentent l'écart type, basé sur trois répétitions.

Ensuite, nous avons recherché la combinaison optimale de paires d'ARNsi parmi nos candidats les plus performants. Ces cocktails comprenaient quatre siARN du crible Sens.AI, complétés par trois des siARN les plus prometteurs du pipeline de découverte open source. Nous avons testé 14 cocktails différents de 2-siARN dans le test de virus vivant et comparé les résultats à la répression par S3 seul, car en monothérapie, il avait montré le niveau de répression le plus élevé (Fig. 3d). Nous avons identifié cinq cocktails où les deux composants d'ARNsi présentaient un effet synergique, multiplié par plusieurs fois par rapport à la répression par S3 seul à la même concentration. S5 s'est avéré être un composant récurrent dans la plupart de ces cocktails et nous avons décidé de donner la priorité à deux de ces cocktails à l'avenir : S5/S3 et S5/Hel14.

Pour valider davantage ces cocktails d'ARNsi, nous avons testé leur activité dans une culture d'interface Air-Liquide qui mime mieux les voies respiratoires par rapport aux cellules VeroE6. Nous avons transfecté la culture ALI du côté apical avec 100 nM de chaque cocktail. En tant que contrôle négatif, nous avons également transfecté des cellules avec un faux ARNsi ciblant l'eGFP. Après 24 h, nous avons défié les cellules du côté apical avec 600xTCID50 du SARS-CoV-2 vivant (souche ancestrale). Enfin, nous avons mesuré le niveau de charge virale à 48, 72 et 96 heures après l'infection initiale via qPCR, en sondant les gènes RdRP et E. Nous avons trouvé une forte inhibition de la réplication virale pour les deux cocktails dans ces conditions (Fig. 3e).

Nos cocktails se sont avérés très résistants aux VoC émergents. Tout d'abord, nous avons testé les cocktails contre la souche ancestrale par rapport à la variante Delta. Les cocktails ont conféré une répression substantielle contre Delta, à égalité avec leur effet sur la souche ancestrale (> 95% de répression) (Fig. 3f). Fait intéressant, S5 était tolérant et a montré une efficacité contre la souche Delta malgré le fait qu'il possède une mutation en position 14 de son site cible. Deuxièmement, nous avons testé le cocktail S5/Hel14 contre Omicron BA.1 en utilisant un réglage similaire. Semblable à d'autres rapports33, la variante Omicron ne s'est pas répliquée aussi rapidement que les autres VoC in vitro. Étant donné que ces taux de réplication plus faibles réduisaient la plage dynamique de nos tests, nous avons ajouté deux témoins positifs, la chloroquine et le molnupiravir, qui se sont tous deux révélés être de puissants inhibiteurs d'Omicron BA.1. L'activité du cocktail S5/Hel14 était en effet diminuée dans la variante Omicron. Néanmoins, il a inhibé la réplication virale à un niveau similaire à celui induit par les traitements témoins positifs (Fig. 3g). Cette découverte a suggéré que l'inhibition plus modeste était probablement le résultat d'une plage dynamique inférieure due à une réplication virale lente, plutôt qu'en raison de la puissance réduite du cocktail d'ARNi lui-même. Enfin, nous avons testé l'activité des cocktails contre notre nouveau système de réplicons, qui récapitule la fonction, mais pas l'infectivité de la souche Beta SARS-CoV-234. De manière constante, les cocktails ont réprimé le réplicon de 10 à 15 fois, ce qui indique qu'ils confèrent un profil d'inhibition robuste sur divers VoC34. Il est important de noter que l'analyse des données de séquençage à haut débit a montré que les cellules traitées avec le cocktail S3 / S5 présentaient un profil spécifique d'épuisement des lectures au niveau des sites de clivage d'ARNsi (Fig. 3h). Ces données fournissent un support mécaniste pour confirmer que la réduction observée de la charge virale était directement liée au silençage des siARN.

Ensuite, nous avons exploré la réactivité croisée de notre stratégie ARNi contre les futures VoC, compte tenu de son utilisation prévue dans le contexte de la préparation à une pandémie. À cette fin, nous avons développé un test de mutagenèse à saturation en utilisant notre stratégie Sens.AI. Nous avons répété la même stratégie RNAi-off/RNAi-on que le dépistage du SARS-CoV-2. La seule différence était que dans l'écran précédent, nous utilisions une variété de déclencheurs shRNA et un site cible parfaitement adapté, alors que dans cet essai, nous avons fixé le déclencheur shRNA à S5 et créé une série de sites cibles mutés (Fig. 4a) . Nous avons utilisé cette stratégie pour cribler 2 143 mutations dans le site cible S5, en évaluant de manière exhaustive pratiquement toutes les une et/ou deux substitutions possibles dans ce site. À notre connaissance, il s'agit de la plus grande mutagenèse à saturation in-cellulo jamais réalisée avec un déclencheur ARNi.

a Le schéma de conception des oligos utilisé dans ce cadre. La bibliothèque se composait du S5 comme déclencheur de shRNA avec 2 143 mutations, décrivant de manière exhaustive tous les mésappariements simples et doubles possibles dans le site cible de siRNA ; b L'effet des mésappariements stratifiés par position pour n = 66 shARN avec un seul mésappariement. L'axe X représente les positions le long du brin guide. Bleu : valeurs moyennes. Jaune : effet moyen lissé ; Les carrés représentent la moyenne, les lignes horizontales représentent la médiane, les bords des cases représentent les quartiles 25 % et 75 %, et les moustaches représentent les points de données les plus éloignés jusqu'à 50 % de la plage interquartile. c La distribution de l'effet des mutations sur l'activité de S5. La ligne verticale à 1,0 (axe X) signifie des scores identiques au score de dépistage d'un site cible dépourvu de toute mutation. Noir : la distribution des effets de toutes les 2143 mutations simples et doubles. Gris : la distribution de toutes les mutations simples. Orange : la distribution de toutes les doubles transitions. Rouge : la distribution de toutes les doubles transversions.

Nous avons validé l'écran de mutagenèse à saturation en reproduisant les tendances précédentes concernant les mésappariements de cibles d'ARNsi. Nous avons stratifié les résultats en fonction du nombre de discordances. En moyenne, une seule discordance dans le site cible a réduit les scores Sens.AI de 6 % par rapport à l'absence de discordance. Comme attendu, ce chiffre était significativement inférieur (test t, p < 3 × 10−10) à celui observé pour les doubles mésappariements, ce qui a réduit les scores Sens.AI de 31 % en moyenne. Ensuite, nous avons analysé l'effet de la position d'un seul mésappariement sur l'activité de S5 (Fig. 4b). De même, conformément aux études précédentes35, la région de la graine a montré la plus grande sensibilité aux mésappariements, tandis que le site de clivage a montré une sensibilité relativement plus faible à ces mutations.

Dans l'ensemble, notre criblage à haut débit a montré que le site cible S5 pouvait tolérer une grande variété de mutations sans perte significative de puissance (Fig. 4c; Fig. 6 supplémentaire). La plupart des mutations simples (56 %) ont amélioré le score Sens.AI et devaient augmenter la puissance de S5, ce qui pourrait être attribué à la dynamique de dissociation d'Ago235. En revanche, nous avons estimé que S5 perdrait la majeure partie de sa puissance dans le cas d'une double mutation dans le site cible. Pour mieux comprendre la dynamique de ces doubles mutations, nous avons comparé l'effet estimé des doubles transitions aux doubles transversions. Nos résultats montrent que les doubles transitions étaient bien mieux tolérées. La plupart des doubles transitions ont entraîné une réduction <32 % du score Sens.AI, tandis que la plupart des doubles transversions ont entraîné une réduction > 51 % de ce score. Sur la base d'études antérieures, le premier type de mutation est sept fois plus fréquent que le second36, ce qui suggère que S5 pourrait tolérer dans une certaine mesure le type le plus répandu de doubles mutations dans le site cible.

Afin d'évaluer l'efficacité préventive de nos cocktails d'ARNsi dans un modèle de maladie de COVID-19, nous avons administré le cocktail S5/Hel14 à des hamsters syriens comme mesure préventive à une provocation virale vivante. Nous avons décidé d'utiliser ce cocktail plutôt que celui de S3/S5 puisque S3 cible la région codant pour Spike, qui est sujette à des mutations en tant que mécanisme d'échappement des vaccins et des mAb. Nous avons utilisé un schéma posologique qui consistait en une dose d'environ 400 ug/kg du cocktail d'ARNsi par jour les jours -7, -3 et -1 en utilisant notre formulation brevetée d'administration sélective des poumons. De plus, nous avons utilisé le même schéma posologique pour traiter un autre groupe de hamsters avec un siARN connu et très puissant contre le virus de l'hépatite C (VHC), en tant que contrôle négatif. Comme il n'y a pas de médicament intranasal disponible que nous pourrions utiliser comme contrôle positif, nous avons administré du bamlanivimab37 (LY-COV555, qui a reçu une autorisation d'utilisation d'urgence de la FDA pour le traitement COVID-19) par voie intrapéritonéale (ip) au jour -1 au contrôle positif groupe. Chaque groupe était composé de six hamsters mâles et nous les avons provoqués par voie intranasale au jour 0 avec 4 × 103 PFU de la souche SARS-CoV-2 ancestrale WA-1.

Nos résultats montrent que le cocktail d'ARNsi conférait une protection contre l'infection par le SRAS-CoV-2 lorsqu'il était utilisé comme prophylaxie pré-exposition (PrEP) dans le modèle de référence de la maladie du hamster syrien (Fig. 5a). Le groupe témoin négatif a présenté une perte de poids moyenne > 7 % au jour 5 après l'infection, ce qui est conforme aux études précédentes38,39,40. Le groupe traité par siARN a bénéficié d'une protection significative contre la perte de poids par rapport à ce groupe témoin négatif (p <0, 05; test d'hypothèse bootstrap et ajustement de Bonferroni) (Fig. 5b). Cette perte de poids était statistiquement indiscernable du groupe témoin positif traité par le bamlanivimab. De plus, nous avons observé une suppression d'un ordre de grandeur de la charge virale dans les poumons du groupe de traitement actif (jour 5) par rapport au témoin négatif, telle que mesurée par la mesure qPCR du gène RdRP (ΔVLlung = 10,3x, plung < 0,001 ; test d'hypothèse bootstrap et ajustement de Bonferroni) (Fig. 5c). De même, nous avons également observé une suppression significative, bien que dans une moindre mesure, de la charge virale dans les narines (ΔVLlung = 2, 5x, plung < 0, 05; test d'hypothèse bootstrap et ajustement de Bonferroni) (Fig. 5d). Dans les deux cas, l'anticorps était plus efficace que le traitement par siRNA, ce qui suggère que des études supplémentaires d'optimisation de la dose sont nécessaires afin de développer pleinement le cocktail de siRNA en un prophylactique viable.

a Schéma posologique. Des hamsters syriens (n = 6, par groupe) prétraités avec un siRNA non ciblant (témoin négatif, gris), l'anticorps LY-CoV555 (témoin positif, jaune) ou notre cocktail de siRNA plomb (traitement, rouge) ont été infectés par 4 × 103 PFU de la souche ancestrale SARS-CoV-2 ; b Changement de poids après l'infection. Boîte à moustaches du changement de poids par groupe de traitement par rapport au temps après l'infection ; c, d Charge virale au jour 5 après l'infection. Toutes les mesures étaient basées sur la qPCR du gène RdRP cinq jours après l'infection à partir de poumons homogénéisés c et de narines d. Dans tous les panels, la valeur p est présentée comme : *<0,05,**<0,001. Ctrl : contrôle ; CV : charge virale ; Nég. : négatif ; Pos. : positif ; traitement : traitement ; ns : non significatif. Dans les panneaux b à d, les lignes horizontales représentent la médiane, les bords des cases représentent les quartiles 25 % et 75 %, et les moustaches représentent les points de données les plus éloignés jusqu'à 50 % de la plage interquartile. Les valeurs P ont été calculées à l'aide d'un bootstrap paramétrique (Méthodes).

Nous avons également testé le même cocktail d'ARNsi dans trois formats supplémentaires : des ARNsi chimiquement modifiés administrés par voie intranasale (variation #1 ; Fig. 7 supplémentaire), les mêmes ARNsi modifiés chimiquement administrés par nébulisation (variation #2) et des ARNsi nus administrés par nébulisation (variation # 3) (Méthodes). Les variations de traitement n ° 1 et n ° 2 ont toutes deux montré une réduction significative de la charge virale pulmonaire (variation plongeante n ° 1 <0, 001; variation plongeante n ° 2 <0, 001; test d'hypothèse bootstrap et ajustement de Bonferroni) (Fig. 8a supplémentaire). De plus, nous avons constaté une réduction plus faible mais significative de la charge virale des narines (variation plung # 1 <0, 001; variation plung # 2 < 0, 05; test d'hypothèse bootstrap et ajustement de Bonferroni) (Fig. 8b supplémentaire). Cependant, aucune de ces variations n'a protégé contre la perte de poids mesurée au jour 5 (Fig. 8c supplémentaire), ce qui suggère qu'elles peuvent afficher une pharmacocinétique plus lente que le bras de traitement principal ou induire un défi de tolérance.

Pris ensemble, nos résultats montrent que le traitement par siARN peut protéger efficacement les voies respiratoires supérieures contre l'infection par le SRAS-CoV-2, atténuant considérablement l'infection, comme en témoignent les mesures de la charge virale et les manifestations cliniques illustrées de manière prototypique par la perte de poids.

La prophylaxie, en particulier celle qui résiste à l'émergence de nouvelles variantes préoccupantes (VoC), a été identifiée à plusieurs reprises comme un élément manquant dans l'arsenal de thérapies utilisées pour lutter contre la pandémie continue de COVID-19. Les siARN présentent une modalité attrayante pour le traitement prophylactique, et en effet lors de la première épidémie de SRAS, différents chercheurs ont identifié des siARN pour cibler le génome du virus. Néanmoins, sur plus de 9000 séquences publiées, seuls 12 siRNA avaient une correspondance parfaite avec le génome du SARS-Cov2. Dans cette étude, nous rapportons, pour la première fois à notre connaissance, un dépistage systématique de l'ARNi à l'échelle du génome contre le SRAS-CoV-2. Nous avons testé plus de 16 000 déclencheurs d'ARNi dans un test de rapporteur massivement parallèle et validé les plus performants dans un test de virus vivant in vitro. De plus, nous avons testé 88 siARN identifiés via des méthodes de découverte in silico open-source. Nous avons ensuite testé plusieurs paires d'ARNsi sous forme de cocktails dans le test de virus vivant afin d'identifier les cas où les composants d'ARNsi confèrent des effets synergiques lorsqu'ils sont combinés. Ces cocktails se sont avérés actifs contre trois souches différentes du virus, à savoir Beta, Delta et l'ancestrale. Un criblage exhaustif des 2 143 mutations simples et doubles dans l'un des sites cibles a confirmé la faible probabilité de perte d'activité contre les futures VoC. Enfin, nous avons montré l'efficacité de ces cocktails comme préventifs pré-exposition contre l'infection par le SRAS-CoV-2 chez les hamsters syriens.

Notre étude comporte également certaines limites. Premièrement, dans leur constellation actuelle, les cocktails d'ARNsi ont été conçus comme des prophylactiques aiguës. On ne sait pas combien de temps ils restent efficaces et pourraient donc être plus appropriés dans les situations où un risque d'exposition élevé est présent, comme dans le cas des travailleurs de première ligne, l'immunodépression (transitoire ou chronique), une épidémie dans le ménage et pendant la hauteur ou une "vague" d'infection. Deuxièmement, alors que notre cocktail d'ARNsi protégeait les hamsters syriens de la maladie, l'effet a été principalement observé dans les voies respiratoires supérieures. Bien qu'il s'agisse du principal site d'infection et qu'il soit très prometteur en termes d'atténuation de la transmission, il nécessitera une adaptation supplémentaire pour une utilisation dans un cadre de traitement, ce qui nécessiterait une optimisation pour l'administration aux voies respiratoires inférieures et au parenchyme pulmonaire. Troisièmement, aux fins de cette étude de preuve de principe, nous avons adopté un régime de traitement pré-exposition composé d'une administration de plusieurs jours avant l'infection. Nous visons à optimiser davantage le régime avant de passer aux PSN et, finalement, aux essais cliniques chez l'homme.

Malgré ces mises en garde, l'étude actuelle contribue considérablement aux efforts mondiaux pour freiner le COVID-19, ainsi que les futures autres pandémies virales de proportions similaires de mortalité et de morbidité. Ici, nous illustrons l'efficacité des cocktails d'ARNsi administrés par voie intranasale en tant que préventifs pré-exposition résistants à l'évolution mutationnelle probable des agents pathogènes coupables. Ceci est particulièrement encourageant étant donné le rythme alarmant auquel nous assistons actuellement à l'émergence de nouvelles variantes du SRAS-CoV-2 résistantes aux thérapies des classes de mAb neutralisants et de vaccins. Il est important de noter que notre approche proposée n'est pas affectée par les mutations de Spike, ni ne repose sur un système immunitaire fonctionnel. Au lieu de cela, il exploite la voie naturelle de l'ARNi, active dans les cellules épithéliales tapissant les voies respiratoires, qui sont le point focal de la transmission des infections, et est complètement orthogonale aux vaccins et autres approches immunomodulatrices. Enfin, les proportions mondiales de la pandémie actuelle et les exigences restrictives de stockage et d'expédition de la chaîne du froid associées à de nombreux vaccins et thérapies approuvées par les mAb appellent de toute urgence une solution durable qui serait également accessible aux zones rurales, difficiles à atteindre. populations les moins aisées. Notre administration intranasale permet un déploiement à grande échelle qui ne dépend pas d'une infrastructure médicale nouvelle ou avancée pour l'accessibilité. Nous pensons que cette étude illustre un changement de paradigme dans l'approche de la préparation à une pandémie, et nous prévoyons que notre pipeline de découverte et de validation sera applicable à d'autres menaces pathogènes émergentes, y compris les nouveaux bêta-coronavirus et la grippe.

Des cellules HEK293FT (ThermoFisher Scientific) et VeroE6 (ATCC) (et leurs dérivés) ont été cultivées dans du DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), additionné de 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine (tous Thermo Fisher Scientifique), à 37 °C avec 5 % de CO2. La lignée cellulaire HEK293FT a été obtenue auprès de Thermo Scientific (cat. No R70007). La culture d'interface air-liquide (MucilAir) a été achetée chez Epithelix.

La lignée cellulaire HEK293FT-Dicer Knock-Out (KO) a été conçue par CRISPR/Cas9 dans la lignée cellulaire parentale 293FT. L'ARN guide (ARNg) avait la séquence suivante : AAGAGCUGUCCUAUCAGAUC. L'ARNg a été modifié avec une modification phosphorothioate pour empêcher la dégradation de la nucléase et a été obtenu auprès de Merck-Millipore. 80 pmol d'ARNg ont été complexés avec 4 ug de protéine TrueCut Cas9 (ThermoFisher) et transfectés dans les cellules à l'aide du nucleofector Amaxa. L'efficacité du KO a été déterminée à l'aide du séquençage de Sanger.

Pour chaque ARNsi candidat, nous avons extrait sa séquence cible dans un contexte de 150 paires de bases. La séquence cible a été clonée dans pLMN-ZsGreen-Neomycin (Transomics) à l'extrémité 3'UTR d'une protéine rapporteur mCherry exprimée de manière constitutive. Les cellules HEK293FT ont été transfectées avec de la Lipofectamine 3000 (Life Technologies) selon les directives du fabricant, soit avec le capteur seul, soit avec le capteur plus l'ARNsi à la concentration appropriée. Un deuxième plasmide exprimant eGFP a été co-transfecté à un rapport molaire de 1:1, servant de contrôle interne pour l'efficacité de la transfection. Les cellules ont été collectées et analysées 48 h après la transfection à l'aide d'un cytomètre en flux MACSquant VYB (Milteyi Biotec). La puissance de chaque candidat a été évaluée comme le rapport médian de mCherry à l'amplitude de rayonnement eGFP. La figure supplémentaire 9 présente la stratégie de déclenchement utilisée dans ces expériences.

La bibliothèque shRNA-Sensor a été assemblée via une procédure en deux étapes. Une bibliothèque d'environ 20 000 oligonucléotides dans laquelle chaque shARN était joint à son capteur apparenté par un lieur hébergeant les sites de restriction EcoRI et MluI a été obtenue auprès de Twist Bioscience. La banque a d'abord été amplifiée par PCR et clonée en utilisant XhoI et MfeI dans un vecteur rétroviral receveur. Ce dernier contenait le miR30 résistant à l'hygromycine, y compris sa partie 5' (5'mir30). Dans un second temps, une cassette 3'mir30-PGK-Venus a été insérée entre le shRNA et son Sensor, intégré via les sites EcoRI et MluI dans le linker.

Tous les plasmides pour le dosage du rapporteur et le Dicer déstabilisé ont été construits sur un échafaudage pZIP lentiviral obtenu auprès de Transomics (pZIP-SFFV-ZsGreen-Puro), qui avait été précédemment modifié pour basculer la cassette SFFV-ZsGreen avec le promoteur EF1alpha seul. Pour le dosage du rapporteur, nous avons cloné une cassette d'expression en aval du promoteur EF1aplha via Gibson Cloning, qui consistait en un fragment de capteur 3xFLAG-EGFP-NLS ou mCherry-STOP-150bp. Pour le ddDicer déstabilisé, le domaine de déstabilisation41 et le Dicer142 humain ont été amplifiés par PCR et assemblés dans pZIP-EF1aplha via un clonage Gibson à 3 voies. La construction finale avait la structure suivante EF1a :: dd-Dicer1-IRES-Puro.

Toutes les études in vitro avec un virus vivant ont été menées dans une installation de niveau de confinement 3 au Cambridge Institute Therapeutic Immunology and Infectious Disease (CITIID) conformément aux procédures et protocoles opérationnels standard approuvés.

L'isolat clinique de Sars-cov-2/human/Liverpool/REMRQ001/2020, un isolat de première vague désigné par WT, a été propagé dans Vero-E6 et principalement utilisé pour les infections virales vivantes dans cette étude. Des expériences supplémentaires ont été menées en utilisant des variantes Delta et Omicron nouvellement apparues. Les virus SARS-CoV-2 infectieux vivants propagés, B.1.1.617.2 (Delta) et B.1.1.529 (Omicron) ont été aimablement reçus du professeur Wendy Barclay (Imperial College London) et du Dr Jonathan Brown (Imperial College London) dans le cadre des travaux menés par G2P-UK National Virology Consortium. L'isolat de virus correspondant à la variante Omicron, aimablement donné par Gavin Screaton à l'Université d'Oxford, a été propagé sur des cellules Vero-ACE2-TMPRSS2 (VAT) pendant 3 jours jusqu'à ce qu'un effet cytopathique soit observé.

Des cellules Vero E6 transfectées avec une GFP témoin ou des ARNsi expérimentaux ont été préparées dans 96 puits. Sauf indication contraire, 10 000 cellules VeroE6 ont été transfectées avec 100 nM de traitement siRNA et infectées avec SARS-Cov-2 24 heures après le traitement siRNA. Les cellules ont été infectées en triples biologiques avec les variantes SARS-CoV-2 WT, Delta et Omicron à moi 1 ou 0,1 TCID50 par cellule dans 50 µl de DMEM avec ou sans inhibiteurs connus du SARS-CoV-2. Les infections ont été incubées jusqu'à 48/72 h après l'infection (pi) et les surnageants de culture cellulaire ont été récoltés à 0, 24, 48 et/ou 72 h pi où les ARN viraux ont été quantifiés par RT-qPCR et/ou les unités virales infectieuses ont été titrées par TCID50. Après cela, 40 ul du milieu ont été collectés directement dans 160 ul de réactif TRIzol™ LS (ThermoFisher). L'ARN viral a été extrait à l'aide des kits d'ARN Direct-zol-96 (recherche ZYMO) et utilisé comme modèle pour qRTPCR pour mesurer le nombre de copies virales. Le diphosphate de chloroquine (BioVision) a été utilisé à une concentration finale de 50 uM et le molnupiravir (Focus Biomolecules) a été utilisé à une concentration finale de 20 uM. Le séquençage du réplicon Beta a été décrit précédemment34.

Des dilutions en série de dix fois des surnageants de virus collectés ont été préparées dans du milieu de culture DMEM. Parmi ces dilutions, 50 µl ont été inoculés sur des monocouches de cellules Vero E6 cultivées sur des plaques à 96 puits et incubées à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. Les titres de virus ont été collectés à 4 jours pi et exprimés en valeurs TCID50 ml-1 par la méthode Reed-Muench43.

Le nombre de copies du génome viral a été mesuré par qPCR en utilisant le Charité/Berlin Primer Probe Panel (IDT) et le TaqPath™ 1-Step Multiplex Master Mix (ThemoFisher). Nous avons ensuite comparé les valeurs Ct moyennes de chaque condition aux valeurs Ct des siRNA eGFP.

Les oligos pour le test de saturation de mutagenèse S5 ont été obtenus auprès de Twist Bioscience et clonés dans la bibliothèque shRNA-Sensor comme décrit ci-dessus. Semblable à l'écran précédent, nous avons également incorporé 948 shRNA de contrôle de Fellmann et al.22, 511 qui sont très puissants et 437 de faible puissance. Cet écran a suivi une structure similaire à l'écran à l'échelle du génome avec quelques modifications : (a) nous avons modulé la machinerie ARNi avec seulement trois conditions : régulation à la hausse de Dicer, régulation à la baisse de Dicer et aucune modulation. Un pipeline d'apprentissage automatique a été construit pour faire la distinction entre le shRNA de contrôle puissant et faible. Le meilleur classificateur a été choisi par validation croisée et avait un taux de précision de 81,1 % en moyenne (se de 1,14 %). Le classificateur attribue un score de puissance pour chaque paire déclencheur-cible dans le test. L'effet de chaque cible mutée a été déterminé comme le score de classificateur pour la paire de déclencheur-cible mutée sur le score de la paire de déclencheur-cible parfaitement appariée.

Des hamsters syriens dorés mâles âgés de 6 à 8 semaines ont été traités avec des cocktails d'ARNsi aux jours -7, -3 et -1 avant l'infection. L'administration intranasale (IN) a été réalisée sur des hamsters dans l'étude en utilisant une formulation exclusive. Chaque hamster a été placé sur un tampon chirurgical stérile et légèrement étiré pour mieux placer une prise ferme sur la peau. Le hamster a été tourné sur le dos pour permettre au hamster de respirer et d'être à l'aise. Avec le cou et le menton plats et parallèles au coussinet, la pointe du pipetteur a été placée près de la narine gauche du hamster à un angle de 45 degrés, et 5 μL de matériel de dosage ont été administrés dans la narine avec un 2–3 sec intervalle entre les deux pour un total de 25 μL/narine. Le hamster a été maintenu dans cette position pendant 5 secondes ou jusqu'à ce qu'il reprenne conscience, puis l'administration a été répétée pour l'autre narine pour un total de 50 µL/hamster. Après la procédure, le hamster a été remis dans sa cage et surveillé pendant 5 à 10 minutes pour tout effet indésirable.

Pour les administrations par nébuliseur, les siARN ont été dilués dans du PBS + gélatine 0,5 mg/ml. L'aérosol a été produit à l'aide d'une nébulisation de purée vibrante (VMN) et la nébulisation a été effectuée dans une enceinte de sécurité biologique (BSC).

Lorsque cela était indiqué, 1 mg de mAb555 a été administré par voie intraveineuse au jour -1. Au jour 0, les hamsters ont été infectés par le SRAS-CoV-2 en utilisant une infection intranasale du virus 4 × 103 PFU. Au jour 5 après l'infection, les hamsters ont été abattus et la trachée et les poumons ont été prélevés pour une analyse plus approfondie.

Nous avons calculé toutes les valeurs p via des tests d'hypothèse bootstrap, en soustrayant de chaque hamster la moyenne de son groupe, en rééchantillonnant les hamsters de chaque groupe avec remplacement 20 000 fois et en calculant la fraction d'échantillons dans laquelle la différence entre les moyennes était supérieure à la valeur réelle. différence. Les valeurs p présentées sont après correction de Bonferroni pour les quatre bras.

Nous avons effectué le dépistage covid initial (Fig. 1) en utilisant deux répétitions (définies comme des cellules triées séparées). Nous avons effectué la validation de l'écran (Fig. 2) en utilisant deux répétitions (définies comme des expériences de transfection distinctes) pour chaque ARNsi testé à chaque concentration. Nous avons réalisé l'expérience de virus vivant (Fig. 3) en utilisant 3 répétitions (définies comme des expériences d'infection cellulaire séparées) pour chaque ARNsi et effectué une analyse statistique à l'aide du test de Dunnett. Nous avons effectué l'analyse de mutagenèse à saturation (Fig. 4) en utilisant 2 143 siARN différents, en testant trois mésappariements différents par position. Nous avons réalisé les expériences in vivo (Fig. 5) en utilisant six hamsters par groupe et effectué une analyse statistique en utilisant des tests d'hypothèse bootstrap (en soustrayant de chaque hamster la moyenne de son groupe, en rééchantillonnant les hamsters de chaque groupe avec remplacement 20 000 fois et en calculant la fraction d'échantillons dans lesquels la différence entre les moyennes était supérieure à la différence réelle).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données des expériences d'analyse de capteur, les données non traitées et les fichiers de métadonnées sont disponibles sur demande. Les données sources pour les graphiques et les figures sont incluses dans les données supplémentaires 1-5.

Le code requis pour reproduire les résultats est disponible sur demande auprès des auteurs.

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Cette étude a été financée en partie par la Fondation Bill & Melinda Gates et par le programme intra-muros des National Institutes of Health. Les résultats et les conclusions contenus dans ce document sont ceux des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les positions ou les politiques de la Fondation Bill & Melinda Gates. Ce travail a été mené en partie sous CRADA 2020-0597 entre le VRC/NIAID et Eleven Therapeutics. Une partie du travail a été financée par des subventions de recherche à IG de Wellcome Trust, référence no. 207498/Z/17/Z et MRC/UKRI G2P-UK National Virology consortium, référence no. MR/W005611/1. IG est Senior Fellow du Wellcome Trust.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Ohad Yogev, Omer Weissbrod, Giorgia Battistoni, Dario Bressan.

Eleven Therapeutics, Cambridge, Royaume-Uni

Ohad Yogev, Giorgia Battistoni, Dario Bressan, Adi Naamati, Ilaria Falciatori et Ahmet Can Berkyurek

Eleven Therapeutics, Tel-Aviv, Israël

Omer Weissbrod, Roni Rasnic, Shaul Ilan et Yaniv Erlich

CRUK Cambridge Institute, Université de Cambridge, Li Ka Shing Centre, Cambridge, Royaume-Uni

Giorgia Battistoni, Dario Bressan & Gregory James Hannon

Université de Cambridge, Département de pathologie, Division de virologie, Cambridge, Royaume-Uni

Rhys Izuagbe, Myra Hosmillo et Ian Goodfellow

Eleven Therapeutics, Cambridge, MA, États-Unis

Iris Grosman

Centre de recherche sur les vaccins, Institut national des allergies et des maladies infectieuses, Instituts nationaux de la santé, Bethesda, MD, États-Unis

Lauren McCormick, Christopher Cole Honeycutt, Timothy Johnston, Matthew Gagné et Daniel C Douek

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OY et YE ont rédigé ce document avec la contribution de GB, DB, OW et MGOY, YE et OW ont rédigé les figures et les tableaux. OY, GB, DB, AN et IF et ACB ont effectué les expériences in vitro. RI, MH et IGG ont effectué les expériences sur les virus vivants et effectué une analyse statistique. LM, TJ, CCH et MG ont mené l'étude in vivo. YE, OW et RR ont effectué des analyses de données de séquençage et effectué une analyse statistique. YE, SI, IG, DD, GJH ont contribué à la discussion et à la conception des études.

Correspondance à Ohad Yogev.

OY, OW, AN, IF, ACB, RR, SI, IG et YE sont des employés d'Eleven Therapeutics. GJH est le co-fondateur scientifique et détient une participation dans Eleven Therapeutics. GB et DB détiennent une participation dans Eleven Therapeutics. IG agissait en tant que conseiller chez Eleven Therapeutics lorsque ce travail a été effectué.

Toutes les études in vivo ont été menées conformément aux réglementations et aux normes des NIH sur les soins et l'utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire ainsi qu'aux comités de protection et d'utilisation des animaux du NIH Vaccine Research Center et de BIOQUAL, Inc. (Rockville, Maryland). Toutes les études ont été menées chez BIOQUAL, Inc.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la gestion principale : Zhijuan Qiu. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Yogev, O., Weissbrod, O., Battistoni, G. et al. D'un dépistage à l'échelle du génome des molécules d'ARNi contre le SRAS-CoV-2 à une prophylaxie validée à large spectre et puissante. Commun Biol 6, 277 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04589-5

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Reçu : 29 octobre 2022

Accepté : 13 février 2023

Publié: 16 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04589-5

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