Un flux altéré d'acides biliaires du foie vers l'intestin révèle un microbiome

npj Biofilms et Microbiomes volume 9, Numéro d'article : 35 (2023) Citer cet article

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Actuellement, il existe des preuves que l'altération de l'écosystème intestinal contribue au développement de maladies du foie, cependant, les mécanismes complexes impliqués ne sont toujours pas clairs. Nous avons induit une cholestase chez la souris par ligature des voies biliaires (BDL), reflétant le phénotype d'une obstruction des voies biliaires, pour comprendre comment les altérations du microbiote intestinal causées par une altération du flux d'acide biliaire vers l'intestin contribuent à la pathogenèse et à la progression de la maladie hépatique. Nous avons effectué un échantillonnage longitudinal des selles, du cœur et du foie en utilisant des souris recevant du BDL et des témoins recevant une opération fictive (ShamOP). Le profilage métagénomique du fusil de chasse à l'aide d'échantillons fécaux prélevés avant et le jour 1, le jour 3 et le jour 7 après la chirurgie a été effectué, et les profils de cytokines et de chimie clinique du sang cardiaque, ainsi que le profil des acides biliaires du foie, ont été mesurés. La chirurgie BDL a remodelé le microbiome des souris, résultant en des caractéristiques très distinctes par rapport au ShamOP. Notre analyse des voies du microbiome et des CE a révélé que la BDL réduit la production de composés hépatoprotecteurs dans l'intestin, tels que la biotine, la spermidine, l'arginine et l'ornithine, qui étaient négativement associés aux cytokines inflammatoires (IL-6, IL-23, MCP-1). La réduction du potentiel fonctionnel du microbiote intestinal dans la production de ces composés hépatoprotecteurs est associée à la diminution des espèces de bactéries bénéfiques des genres Anaerotruncus, Blautia, Eubacterium et Lachnoclostridium, ainsi qu'à l'augmentation des bactéries associées à la maladie, par exemple Escherichia coli et Entercoccus faecalis. Nos découvertes font progresser nos connaissances sur le triangle microbiome intestinal-acides biliaires-foie, qui peut servir de stratégie thérapeutique potentielle pour les maladies du foie.

À l'échelle mondiale, les maladies du foie (ML) sont responsables de plus de deux millions de décès par an, soit 3,5 % de tous les décès, et elles sont devenues plus fréquentes dans les populations vieillissantes1,2. L'étiologie compliquée de la LD englobe plusieurs facteurs de risque interconnectés, notamment l'obésité, l'âge avancé et la consommation excessive d'alcool3. La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) est la maladie hépatique chronique la plus courante qui touche jusqu'à 25 % de la population dans le monde4. Il s'agit d'une maladie complexe liée à un dysfonctionnement métabolique, à une altération du microbiome intestinal et à une dérégulation immunitaire5,6,7. Différentes approches thérapeutiques de la NAFLD ciblant le métabolisme de l'hôte, le microbiote intestinal et le système immunitaire ont été explorées8. Cependant, en raison de l'interaction complexe de ces facteurs dans les maladies, une approche intégrée est nécessaire pour étudier ces éléments.

De plus en plus de preuves suggèrent que le microbiote intestinal affecte le développement de la NAFLD de plusieurs manières. La perturbation de la barrière intestinale, la translocation bactérienne et la réponse inflammatoire dans le foie sont des mécanismes potentiels qui ont été suggérés dans la façon dont le microbiome intestinal peut influencer la NAFLD et la stéatohépatite non alcoolique (NASH)9. De plus, les patients NAFLD et NASH présentaient des acides biliaires primaires et secondaires (BA) sériques significativement plus élevés que les individus en bonne santé10. Les BA sont des métabolites importants dans les maladies du foie11. La régulation du métabolisme secondaire des BA est l'une des fonctions connues du microbiote intestinal. L'élévation de la production secondaire de BA était associée à l'augmentation des bactéries métabolisant la taurine et la glycine12,13. Par conséquent, une augmentation des BA secondaires peut exacerber la NAFLD.

Néanmoins, il a été rapporté que le microbiote régule le récepteur farnésoïde X (FXR) via des BAs14 secondaires. FXR a un rôle anti-inflammatoire et protège contre la cholestase, la NAFLD et l'inflammation du foie associée à la NASH. Il pourrait être activé par les BA secondaires acide lithocholique et acide désoxycholique15,16,17, suggérant que les BA secondaires ont également un rôle protecteur contre la progression de la NAFLD.

Les cytokines sont impliquées dans la pathogenèse des maladies du foie de manière à la fois favorable à la maladie et bénéfique. Leur rôle reste donc controversé. Par exemple, le facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) a un rôle dichotomique dans le foie. En plus d'agir comme médiateur de la mort cellulaire, il induit la prolifération des hépatocytes et la régénération du foie18, tandis que l'IL-6 agit également à la fois comme promoteur de la régénération du foie et comme inducteur de l'inflammation19. De plus, l'inflammation pourrait avoir un impact négatif sur le développement de la NAFLD en fonction du stade de la maladie, où l'inflammation contribue aux lésions hépatiques au stade précoce et devient un moteur essentiel de la défense de l'hôte contre l'infection par les agents pathogènes et la régénération du foie au stade avancé20. Enfin, le microbiote pourrait réguler la production de cytokines chez l'homme, principalement par la libération de médiateurs intermédiaires courants tels que le tryptophane, l'acide palmitoléique et les acides gras à chaîne courte, au lieu d'exercer une communication directe entre les microbes et les cellules immunitaires21,22.

La cholestase est une condition où le flux de bile du foie est diminué ou bloqué, et selon le mécanisme, elle pourrait être classée en cholestase intrahépatique ou extrahépatique. Fait intéressant, certains mécanismes physiopathologiques primaires sont partagés entre la maladie hépatique cholestatique et la NAFLD23. La ligature des voies biliaires (BDL) est une méthode standard pour induire la fibrose et la cirrhose chez la souris en introduisant une lésion cholestatique obstructive24. Les modifications morphologiques causées par la BDL sont similaires à celles observées dans la cirrhose biliaire humaine, permettant aux chercheurs d'étudier le mécanisme physiopathologique sous-jacent et de développer d'éventuels traitements25. Bien que le BDL soit un modèle de maladie hépatique cholestatique, il a également été utilisé avec succès comme outil dans la recherche préclinique sur la NAFLD et la NASH26,27,28. Des études récentes ont exploré les différences taxonomiques du microbiome entre les souris BDL et témoins à l'aide du séquençage de l'ARNr 16S, et ont proposé des genres bactériens spécifiques associés à la réponse d'expression du gène hépatique de l'hôte qui pourraient protéger le foie pendant la cholestase aiguë29. Pourtant, les mécanismes fonctionnels de l'interaction intestin-foie dans ce système de modèle de souris sont restés largement inexplorés.

Pour élargir notre compréhension de l'axe immunitaire intestin-foie dans les maladies du foie, nous avons effectué un prélèvement longitudinal de fèces et de sang chez des souris avec BDL et opération fictive (ShamOP). Notre analyse complète et intégrative du profil métagénomique du fusil de chasse avec les cytokines hôtes, les acides biliaires hépatiques et les marqueurs biochimiques a fourni des informations supplémentaires sur les mécanismes possibles du microbiome intestinal dans la modulation de la gravité des lésions hépatiques.

Un total de 38 souris ont été assignées au hasard pour recevoir BDL (n = 20) et ShamOP (n = 18) (Fig. 1a). Les souris ont été sacrifiées par lots le jour 1, le jour 3 et le jour 7 après la chirurgie, et leurs échantillons de sang cardiaque et de foie ont été prélevés. Nous avons profilé 8 marqueurs biochimiques et 12 cytokines à partir des échantillons de sang cardiaque et 15 acides biliaires à partir des échantillons de foie (tableau supplémentaire 1). Des échantillons de selles ont été obtenus à tous les moments, de la ligne de base (avant la chirurgie) au jour 1, au jour 3 et au jour 7 avant que les souris ne soient sacrifiées. Pour confirmer les dommages au foie induits par le BDL, nous avons examiné les images d'hématoxyline et d'éosine (H&E) et comparé les profils biochimiques, inflammatoires et des acides biliaires entre les souris BDL et ShamOP. Notre examen histopathologique du tissu hépatique par coloration H&E a confirmé le succès de la chirurgie BDL dans le groupe BDL (Fig. 1 supplémentaire). En outre, la concentration globale d'acides biliaires dans le foie a été significativement augmentée chez les souris BDL, ce qui suggère que le flux biliaire a été bloqué comme prévu (Fig. 2 supplémentaire, modèle linéaire généralisé, valeur P <0, 05). Nous avons observé que les marqueurs sériques liés aux lésions hépatiques, notamment l'aspartate aminotransférase (ASAT), l'alanine aminotransférase (ALAT), la gamma-glutamyl transférase (GGT) et les triglycérides (TG), étaient significativement plus élevés chez les souris BDL que chez les souris ShamOP (Fig. 2 supplémentaire, modèle linéaire généralisé, valeur P <0, 05). Les niveaux d'ASAT et d'ALAT ont montré la plus grande différence entre les deux groupes d'étude. Notre analyse a également montré que les cytokines inflammatoires IL-23, TNF-α, MCP-1, IL-1β, IL-6, IL-17A, GM-CSF et IFN-β étaient significativement augmentées chez les souris BDL. En revanche, l'IFN-γ a été significativement diminué (Fig. 1b et Fig. 2 supplémentaire, modèle linéaire généralisé, valeur P <0, 05). TNF-α, MCP-1 et IL-6 étaient les principales cytokines différentielles entre les souris BDL et ShamOP et étaient significativement positivement corrélés avec ALAT et ASAT (Fig. 1c, corrélation de Spearman, valeur P <0, 05).

a Une illustration graphique de la conception de l'étude, de la collecte des données et des procédures de génération des données. b Boîtes à moustaches de cytokines significativement différentes entre les souris BDL et ShamOP (valeur P <0, 05). La ligne centrale indique la médiane des données, les limites de la boîte représentent l'intervalle interquartile et les moustaches indiquent l'intervalle des données, à l'exclusion des valeurs aberrantes. c Corrélations entre des cytokines significativement différentes et des marqueurs biochimiques significativement différents, en utilisant des données de tous les points dans le temps (jour 1, jour 3 et jour 7). La signification des corrélations est indiquée par des astérisques, où un seul astérisque (*) indique la valeur P < 0,1 et un double astérisque (**) indique la valeur P < 0,05.

La structure du microbiome intestinal des souris BDL et des souris ShamOP a été évaluée par séquençage métagénomique shotgun de tous les échantillons fécaux. Au total, nous avons traité 110 échantillons de selles et séquencé 770,4 paires de gigabases avec une moyenne de 46 689 954 lectures de haute qualité par échantillon. En utilisant les mOTU pour le profilage taxonomique30, nous avons identifié 60 genres et 418 espèces. Les indices de diversité Chao1, Shannon et Simpson alpha n'ont montré aucune différence significative entre les souris BDL et ShamOP lors de l'utilisation des échantillons de tous les points temporels à des fins de comparaison (tableau supplémentaire 2, modèle mixte linéaire, valeur P> 0, 05). Les distances Bray-Curtis ont été calculées pour comparer la diversité bêta entre et au sein des groupes. La diversité bêta au niveau du genre et de l'espèce entre BDL et ShamOP au départ n'avait pas de différence significative (PERMANOVA, valeur P > 0,05). Cependant, il était significativement différent lors de la comparaison des deux groupes de souris au jour 1, au jour 3 et au jour 7 (sauf pour le niveau du genre, qui n'a pas atteint la signification statistique au jour 3) (tableau supplémentaire 2, PERMANOVA, valeur P <0, 05). Notamment, des différences significatives ont été détectées aux niveaux du genre et de l'espèce lors de la comparaison du BDL-jour contre le BDL-jour 1 et du ShamOP-jour 0 contre le ShamOP-jour 1, suggérant que l'incision abdominale favoriserait des changements dans le microbiote, quelle que soit la manipulation du système biliaire. La composition en genre et en espèce a continué à changer de manière significative aux jours 3 et 7 chez les souris BDL (PERMANOVA, P <0, 05), mais pas chez les souris ShamOP (PERMANOVA, valeur P> 0, 05) (Fig. 2a, b).

Analyse des coordonnées principales (PCoA) de la dissemblance Bray-Curtis entre les profils d'abondance du microbiome intestinal au jour 0, au jour 1, au jour 3 et au jour 7, au niveau du genre et de l'espèce b. c Carte thermique des genres et espèces significativement abondants différentiellement (modèle linéaire, FDR < 0,1). Les couleurs des cellules indiquent la direction et l'ampleur de l'abondance normalisée. Les boîtes à moustaches sur le côté montrent l'abondance de certains taxons sélectionnés. La ligne centrale indique la médiane des données, les limites de la boîte représentent l'intervalle interquartile et les moustaches indiquent l'intervalle des données, à l'exclusion des valeurs aberrantes. Les couleurs et les formes des points dans les diagrammes en boîte indiquent les types de traitement et les jours de prélèvement des échantillons.

En analysant le profil taxonomique du microbiome à chaque jour d'échantillonnage (normalisé à la ligne de base ; détaillé dans Méthodes), nous avons trouvé 19 genres (12 ayant l'annotation de genre exacte) significativement différents en abondance entre les souris BDL et ShamOP (Fig. 2c et Tableau supplémentaire 3, modèle linéaire, FDR <0,05). Parmi les 19 genres significatifs, neuf ont été enrichis dans le groupe BDL, tandis que dix ont été enrichis dans les souris ShamOP. Escherichia et Eubacterium étaient les genres les plus enrichis chez les souris BDL et ShamOP (abondance moyenne normalisée des trois jours post-opératoires = 5, 23 et 2, 22, respectivement) (tableau supplémentaire 3). Outre Escherichia, lorsque nous avons examiné spécifiquement les genres avec une annotation de genre exacte, cinq genres présentaient une abondance relative significativement plus élevée dans le BDL par rapport aux souris ShamOP (modèle linéaire, FDR <0,05), y compris Enterococcus et Prevotella, précédemment signalés dans des études sur des souris et des humains pour favoriser une maladie ou une inflammation du foie31,32. En revanche, six genres significativement enrichis chez les souris ShamOP comprenaient des bactéries productrices de butyrate connues, telles que Anaerotruncus, Blautia, Eubacterium et Lachnoclostridium (modèle linéaire, FDR <0,05)33,34. Certains genres ont montré des tendances claires dans les changements d'abondance relative. Par exemple, l'abondance relative d'Anaerotruncus a continué de diminuer chez les souris BDL jusqu'au jour 7 après la chirurgie (Fig. 2c et tableau supplémentaire 3).

Au niveau de l'espèce, nous avons trouvé au total 128 espèces (16 ayant une annotation d'espèce exacte) significativement différentes en abondance entre les souris BDL et ShamOP (Fig. 2c et tableau supplémentaire 4, modèle linéaire, FDR <0, 05). Parmi ces espèces, 22 et 106 se sont révélées significativement enrichies chez les souris BDL et ShamOP, respectivement. Escherichia coli et Enterococcus faecalis étaient les plus riches chez les souris BDL (abondance moyenne normalisée des trois jours post-chirurgie = 5,24 et 4,26, respectivement). Les espèces appartenant aux Clostridiales et aux Lachnospiraceae étaient les plus riches chez les souris ShamOP (abondance moyenne normalisée des trois jours post-opératoires = 3, 35 et 3, 33, respectivement) (tableau supplémentaire 4). Plusieurs espèces significativement différentes ont été rapportées comme étant négativement ou positivement associées au développement de maladies du foie. Une abondance accrue d'E. coli a été observée chez les patients NAFLD présentant une fibrose avancée et pourrait contribuer à l'activité pro-inflammatoire35. Il a été rapporté qu'Enterococcus faecalis exacerbe l'hépatite alcoolique chez la souris36. Une étude sur des souris a révélé une plus grande abondance de bactéries Bacteroidales dans le groupe de la stéatose hépatique alcoolique (AFLD) par rapport au groupe témoin37. Toujours dans notre étude, les espèces de Bacteroidales étaient plus élevées en BDL par rapport aux souris ShamOP (Fig. 2c et Tableau supplémentaire 4).

D'autre part, les bactéries productrices de butyrate telles que la bactérie Lachnospiraceae A2, la bactérie Lachnospiraceae A4 et Anaerotruncus sp G3 (2012) étaient significativement plus élevées chez les souris ShamOP (Fig. 2c, modèle linéaire, FDR <0,05)11. La bactérie Lachnospiraceae A2 a présenté une baisse significative de l'abondance relative chez les souris BDL au cours des trois jours postopératoires, tandis que son abondance relative n'a pas changé chez les souris ShamOP. Les bactéries appartenant au genre Oscillibacter seraient plus abondantes chez les individus sains que chez les individus atteints de NAFLD38. Au contraire, Oscillibacter a également été associé à une stéatose hépatique chez les femmes obèses non diabétiques39. Un membre de ce genre, Oscillibacter sp 1-3, a été trouvé en plus grande abondance chez ShamOP par rapport aux souris BDL (modèle linéaire, FDR < 0,05). Cependant, son abondance relative a continuellement diminué chez les souris BDL. Fait intéressant, une autre espèce de bactérie bénéfique, Parabacteroides goldsteinii, a montré des propriétés anti-inflammatoires dans l'obésité induite par un régime riche en graisses40, et a été trouvée en abondance relative plus élevée chez les souris BDL par rapport aux souris ShamOP (modèle linéaire, FDR < 0,05).

En résumé, le BDL a provoqué des changements significatifs dans la structure de la communauté intestinale, comme le montrent les comparaisons de diversité bêta avec les souris ShamOP. De plus, de nombreuses espèces ont été affectées par le blocage du flux d'acides biliaires dans l'intestin, comme en témoignent une réduction des producteurs connus de butyrate et une augmentation des bactéries principalement associées aux maladies du foie.

L'analyse métagénomique shotgun des échantillons de selles appliquée ici nous a permis d'annoter par la suite les voies et les profils enzymatiques des communautés microbiennes dans les deux groupes de souris. Nous avons identifié 392 voies et 1790 CE à l'aide de HUManN341. L'analyse des profils de voies a révélé l'effet du BDL sur la modification non seulement de la composition du microbiome mais également du profil fonctionnel de la communauté. Contrairement à la taxonomie, une différence significative a été observée au niveau fonctionnel lorsque nous avons comparé les diversités alpha communautaires entre les souris BDL et les souris ShamOP, mesurées en tant qu'indices de Shannon, Simpson et Chao1 (modèle mixte linéaire, valeur P <0, 05, tableau supplémentaire 5). De plus, la diversité bêta des profils de voie entre les groupes BDL et ShamOP regroupant des échantillons de tous les points dans le temps était significativement différente (PERMANOVA, valeur P < 0,05). La composition de la voie a changé de manière significative entre le départ et le jour 1 après la chirurgie chez les souris BDL et ShamOP (PERMANOVA, valeur P <0, 05). De même, dans le profil taxonomique du microbiome, nos résultats suggèrent que l'incision abdominale entraînerait également des altérations du potentiel fonctionnel du microbiote. Ces changements significatifs se sont poursuivis jusqu'au jour 3 chez les souris BDL (PERMANOVA, P-value < 0,05) mais pas chez les souris ShamOP (PERMANOVA, P-value > 0,05). Même si chez les souris BDL, la composition de la taxonomie a continué à changer de manière significative du jour 3 au jour 7 (Fig. 2a, b), le profil fonctionnel de la communauté n'a pas suivi (tableau supplémentaire 5, PERMANOVA, valeur P> 0, 05).

Nous avons normalisé l'abondance des voies et des enzymes à leur ligne de base et comparé les profils fonctionnels entre les souris BDL et ShamOP. Nous avons observé que 195 voies fonctionnelles et 762 CE étaient significativement différentes en abondance relative entre les souris BDL et ShamOP après la chirurgie (Fig. 3, modèle linéaire, FDR < 0,05) ; Les voies 139 et 56 et les gènes 483 et 279 ont été enrichis chez des souris BDL et ShamOP, respectivement (tableaux supplémentaires 6 et 7). La voie de biosynthèse de la biotine (PWY-5005) était significativement plus faible en abondance relative chez les souris BDL (modèle linéaire, FDR < 0, 05), et un gène codant pour l'enzyme 6-carboxyhexanoate – CoA ligase (EC 6.2.1.14), qui est impliqué dans la voie de biosynthèse de la biotine, était significativement plus faible chez les souris BDL (modèle linéaire, FDR < 0, 05). La biotine réduit l'hépatotoxicité et le stress oxydatif dans le foie de souris diabétiques, et une carence en biotine améliore la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires dans une étude humaine42. Les voies de biosynthèse de deux acides aminés à chaîne ramifiée (BCAA), l'isoleucine et la valine (ILEUSYN-PWY et VALSYN-PWY), étaient significativement plus élevées chez les souris ShamOP que chez les souris BDL (Fig. 3a et tableau supplémentaire 6, modèle linéaire, FDR <0, 05). Les patients atteints de NAFLD présentaient des niveaux accrus d'isoleucine et de valine à mesure que la maladie progressait43. Cependant, il a également été rapporté que l'isoleucine et la valine pourraient réduire l'accumulation de graisse hépatique au stade précoce de la NAFLD et prévenir les lésions hépatiques aiguës chez la souris et restaurer la fonction immunitaire chez les patients atteints de cirrhose avancée44,45. Plusieurs EC qui contribuent à la biosynthèse de l'isoleucine et de la valine avaient une abondance significativement plus élevée chez les souris ShamOP (Fig. 3b et tableau supplémentaire 7, modèle linéaire, FDR <0, 05), y compris la réductoisomérase acide cétol (NADP +) (EC 1.1.1.86), l'acétolactate synthase ( EC 2.2.1.6) et la dihydroxy-acide déshydratase (EC 4.2.1.9). Les voies de biosynthèse de l'arginine (ARGSYN-PWY et ARGSYNBSUB-PWY) étaient également significativement plus élevées chez les souris ShamOP (Fig. 3a, modèle linéaire, FDR < 0, 05). Une étude sur des souris a suggéré qu'un conjugué d'arginine et d'acide biliaire pourrait être un traitement possible pour NAFLD46. Le potentiel fonctionnel microbien dans la production d'ornithine (GLUTORN-PWY), un composé qui a un effet hépatoprotecteur dans NAFLD47, était également significativement plus faible chez les souris BDL (Fig. 3a, modèle linéaire, FDR <0, 05). De plus, la spermidine atténue les lésions hépatiques aiguës et la voie de biosynthèse de la spermidine (PWY-6834) était significativement plus faible chez les souris BDL que chez les souris ShamOP (Fig. 3a, modèle linéaire, FDR <0, 05). Cette voie avait une nette tendance à la baisse chez les souris BDL, tandis que son abondance relative n'a que légèrement fluctué au cours de la période post-opératoire chez les souris ShamOP. Dans la voie de biosynthèse de la spermidine, deux EC N1-aminpropylagmatine uréohydrolase (EC 3.5.3.24) et adénosylméthionine décarboxylase (EC 4.1.1.50) étaient significativement plus élevés chez les souris ShamOP que chez les souris BDL (Fig. 3b et modèle linéaire du tableau supplémentaire 7, FDR <0, 05). Un gène codant pour la taurine-pyruvate aminotransférase (EC 2.6.1.77), qui produit de l'alanine qui favorise la restauration d'un foie endommagé49, était également significativement plus élevé chez les souris ShamOP (Fig. 3b, modèle linéaire, FDR < 0,05). De plus, l'abondance relative de la voie de biosynthèse du peptidoglycane (PWY-5265) chez les souris BDL était significativement plus élevée que chez les souris ShamOP (tableau supplémentaire 6, modèle linéaire, FDR <0,05), tandis que le peptidoglycane était un facteur pro-inflammatoire induisant la progression de la stéatohépatite50. EC 2.3.2.17, un gène codant pour une enzyme impliquée dans la biosynthèse des peptidoglycanes, était significativement plus élevé chez les souris BDL (tableau supplémentaire 7, modèle linéaire, FDR < 0,05).

Parcelles volcaniques montrant les voies différentielles a et les profils de changement de pli EC b dans les deux groupes, BDL et ShamOP. Les lignes horizontales en pointillés représentent la valeur P ajustée de −log10 au FDR à 0,05 (modèle linéaire). Plusieurs voies et CE dont nous discutons dans le texte principal sont présentées sous forme de boîtes à moustaches, la ligne centrale à l'intérieur indique la médiane des données, les limites de la boîte représentent la plage interquartile et les moustaches indiquent la plage des données, à l'exclusion des valeurs aberrantes.

Au contraire, les voies de biosynthèse de la ménaquinone (PWY-5838, PWY-5840, PWY-5861, PWY-5897 et PWY-5899) avaient une abondance relative significativement plus élevée chez les souris BDL par rapport aux souris ShamOP (Fig. 3a et modèle linéaire du tableau supplémentaire 6, FDR <0, 05). De plus, il a été rapporté que les patients NAFLD avec fibrose ont un potentiel de production de ménaquinone bactérienne plus élevé que les patients NAFLD sans fibrose51. Enfin, nous avons étudié si la limitation du flux d'acides biliaires aurait un impact sur la capacité du microbiome intestinal à produire du butyrate. Même si au niveau de la taxonomie, nous avons trouvé des différences significatives dans l'abondance des producteurs de butyrate, aucune des voies de production de butyrate de notre ensemble de données (PWY-5022, PWY-5676, P162-PWY et CENTFERM-PWY) n'était significativement différente en abondance relative entre les deux groupes d'étude (tableau supplémentaire 6, modèle linéaire, valeur P = 0, 16-1). Pourtant, l'abondance relative de deux EC impliquées dans ces voies de production de butyrate, la butyrate kinase (EC 2.7.2.7) et la 3-hydroxybutyryl-CoA déshydratase (EC 4.2.1.55), était significativement plus faible chez les souris BDL que chez les souris ShamOP (Fig. 3b, modèle linéaire, FDR <0,05).

Dans l'ensemble, le potentiel fonctionnel du microbiome chez les souris BDL a été fortement affecté, notamment par une réduction de la production de composés anti-inflammatoires et hépatoprotecteurs (biotine, isoleucine, valine, ornithine, arginine et spermidine) et une production accrue de ménaquinone. En outre, des CE spécifiques participant à la biosynthèse du butyrate se sont également avérées réduites chez les souris BDL.

Nous avons ensuite cherché à étudier comment le remodelage du microbiome intestinal induit par la BDL est associé au profil des cytokines. Nous avons effectué une analyse de corrélation à trois voies entre le profil des cytokines, le profil fonctionnel et le profil de taxonomie pour déterminer quels taxons et fonctions étaient associés à la différence des niveaux des cytokines mesurées. Pour déterminer quels taxons/fonctions peuvent contribuer aux lésions hépatiques en limitant le flux d'acides biliaires, nous nous sommes concentrés sur les cytokines, les genres, les espèces, les voies et les CE dont l'abondance était significativement différente entre les groupes BDL et Sham OP après normalisation aux valeurs de référence (modèle linéaire généralisé ou modèle linéaire, FDR < 0,05).

Comme le montre la figure 4, les genres producteurs de butyrate Anaerotruncus, Blautia, Eubacterium et Lachnolostridium qui ont été trouvés plus bas chez les souris BDL étaient significativement positivement corrélés (corrélation de Spearman, valeur P <0, 05) avec la voie de biosynthèse de la biotine (PWY-5005), qui était également significativement plus faible chez les souris BDL. Deux espèces de ces genres producteurs de butyrate, Eubacterium sp. 14-2 et Anaerotruncus sp. G3 (2012) étaient également significativement positivement corrélés avec cette voie de biosynthèse. En revanche, deux genres plus élevés chez les souris BDL, Enterococcus et Prevotella, et deux espèces également plus élevées chez les souris BDL, Enterococcus faecalis et la bactérie Bacteroidales M14, présentaient des corrélations négatives significatives avec la voie de production de la biotine (Fig. 4, corrélation de Spearman, valeur P <0, 05). De plus, le potentiel fonctionnel du microbiote synthétisant la biotine était significativement corrélé négativement avec les cytokines pro-inflammatoires IL-6 et IL-23 (Fig. 4, corrélation de Spearman, P-value < 0,05). Il a été constaté qu'un taux élevé d'IL-6 augmentait le risque de NAFLD52, et l'IL-23 était élevé chez les patients NASH et il a été suggéré qu'il était indirectement lié à la stéatose hépatique et à la réponse pro-inflammatoire dans la NAFLD53.

Les genres et les espèces présentés diffèrent significativement entre les souris BDL et ShamOP (modèle linéaire, FDR < 0,05). Les voies indiquées sont significativement différentes chez les souris BDL par rapport aux souris ShamOP (modèle linéaire, FDR < 0,05). Les EC montrés font partie des voies significatives et ont changé de manière significative dans le BDL par rapport aux souris ShamOP. Les voies qui n'ont pas au moins une corrélation significative (corrélation de Spearman, valeur P < 0, 05) avec les taxons significatifs (modèle linéaire, FDR < 0, 05) et les cytokines (modèle linéaire généralisé, FDR < 0, 05) ont été supprimées. La signification des corrélations est indiquée par des astérisques, où un seul astérisque (*) indique la valeur P < 0,1 et un double astérisque (**) indique la valeur P < 0,05.

Anaerotruncus, Blautia, Eubacterium et Lachnolostridium avaient également des corrélations positives avec la biosynthèse du microbiote intestinal de deux acides aminés, l'ornithine et l'arginine (GLUTORN-PWY et ARGSYNBSUB-PWY) (Fig. 4, corrélation de Spearman, valeur P < 0,05). Ces deux voies de biosynthèse étaient plus faibles chez les souris BDL et étaient également fortement liées positivement à Eubacterium sp. 14-2 et Anaerotruncus sp. G3 (2012). A l'opposé, des corrélations négatives significatives ont été mises en évidence entre la voie de production d'ornithine et de Prevotella et la voie de biosynthèse de l'arginine et d'Enterococcus (Fig. 4, corrélation de Spearman, P-value < 0,05). Les bactéries Bacteroidales trouvées plus élevées chez les souris BDL (bactérie Bacteroidales M10, bactérie Bacteroidales M11, bactérie Bacteroidales M12 et bactérie Bacteroidales M14) étaient corrélées négativement avec les deux voies de biosynthèse des acides aminés (Fig. 4, corrélation de Spearman, valeur P <0, 05). De plus, les voies de biosynthèse de l'ornithine et de l'arginine étaient négativement corrélées avec MCP-1, une cytokine qui contribue à la stéatose hépatique et à la fibrose54,55.

De plus, nous avons constaté que la capacité fonctionnelle du microbiote à synthétiser la spermidine (PWY-6834) était significativement positivement corrélée avec Anaerotruncus, Blautia, Eubacterium et Lachnolostridium (Fig. 4, corrélation de Spearman, valeur P <0, 05). En revanche, la voie de biosynthèse de la spermidine était plus faible chez les souris BDL. Deux espèces qui étaient plus faibles chez les souris BDL, Anaerotruncus sp. G3 (2012) et la bactérie Lachnospiraceae A2, étaient également positivement corrélées avec la voie de production de spermidine. En revanche, Enterococcus, Prevotella, la bactérie Bacteroidales M11 et la bactérie Bacteroidales M14 étaient négativement corrélées à cette voie (Fig. 4, corrélation de Spearman, valeur P <0, 05). De plus, la voie de biosynthèse de la spermidine était négativement corrélée à l'IFN-bêta et à la MCP-1 (Fig. 4, corrélation de Spearman, valeur P < 0, 05).

Nous avons également observé des niveaux inférieurs de voies de production d'isoleucine et de valine (ILEUSYN-PWY et VALSYN-PWY) chez les souris BDL. Ces voies étaient positivement corrélées avec Lachnolostridium et Eubacterium sp. 14-2, et négativement corrélé avec la bactérie Bacteroidales M10, la bactérie Bacteroidales M11 et la bactérie Bacteroidales M12 (Fig. 4, corrélation de Spearman, valeur P < 0,05). De plus, les cytokines pro-inflammatoires IL-6 et MCP-1 ont montré des corrélations négatives significatives avec le potentiel fonctionnel du microbiote synthétisant l'isoleucine et la valine (Fig. 4, corrélation de Spearman, valeur P < 0,05).

De plus, la biosynthèse de la ménaquinone du microbiote (y compris PWY-5840, PWY 5899, PWY-5897, PWY-5861 et PWY-5838) s'est avérée plus élevée dans le BDL et avait des corrélations positives significatives avec les deux espèces les plus enrichies en BDL, E. coli et E. faecalis. Ces voies de biosynthèse étaient négativement corrélées avec Eubacterium sp. 14-2 et Oscillibacter sp. 1-3 (Fig. 4, corrélation de Spearman, valeur P < 0,05). Le GM-CSF, l'IFN-β, l'IL-23, l'IL-6, le MCP-1 et le TNF-α ont un lien positif fort avec la capacité fonctionnelle du microbiote à produire de la ménaquinone (Fig. 4, corrélation de Spearman, valeur P < 0,05).

Notre analyse a étudié le lien entre l'état inflammatoire de l'hôte et le microbiome intestinal, et met en évidence plusieurs mécanismes possibles des contributions du microbiote intestinal dans les lésions hépatiques lorsque l'arrêt du flux d'acides biliaires dans l'intestin. Les changements taxonomiques induits par la BDL ont été associés à une réduction de la biosynthèse de composés bénéfiques (biotine, ornithine, arginine, spermidine, isoleucine et valine) et à une augmentation de la production de ménaquinone dans l'intestin, ce qui a conduit à la promotion de cytokines pro-inflammatoires (telles que IL-6 et MCP-1) et aggravé les lésions hépatiques, comme le montre leur corrélation avec les marqueurs de lésions hépatiques (tels que ALAT et ASAT).

L'axe intestin-foie comprend l'intestin, qui fournit environ 70 à 75 % du flux sanguin vers le foie56. Le foie est un composant crucial du système immunitaire et agit comme point focal de communication entre le microenvironnement intestinal et le métabolisme de l'hôte. En conséquence, le foie est exposé à de nombreux composants bactériens, métabolites et signaux provenant du microbiome. Selon des recherches récentes, les acides biliaires fonctionnent comme des molécules de signalisation pléiotropes qui interviennent dans la diaphonie entre l'intestin et le foie57,58. L'interaction complexe entre les acides biliaires et la flore intestinale (qui implique une dépendance et une inhibition mutuelles) est cruciale pour le maintien de l'homéostasie des mammifères. Les acides biliaires qui n'ont pas été conjugués peuvent équilibrer la différence de pH à travers la membrane cellulaire. Les dommages à la membrane cellulaire peuvent résulter directement de l'absence subséquente de bioénergie de la pompe à protons. Les acides biliaires finissent par empêcher certaines bactéries de se développer et participent au développement du microbiome intestinal59. En parallèle, les acides biliaires sont des molécules essentielles à la régulation bidirectionnelle entre le foie et l'intestin, et deux voies de signalisation les activent. Une molécule de signalisation se lie au récepteur 1 des acides biliaires couplé aux protéines G (GPBAR1 ou TGR5), qui régule la stéatose hépatique et la réponse inflammatoire, et active l'expression du FXR ; celui-ci contrôle alors l'équilibre du métabolisme énergétique, contrôle la stéatose hépatique et la réponse inflammatoire, et influence la composition du tractus intestinal. En conséquence, la physiopathologie des maladies du foie peut être affectée par l'utilisation par le microbiome intestinal des acides biliaires comme molécules de signalisation12,60,61,62. De nouveaux traitements pourraient être basés sur une meilleure compréhension des domaines d'action précis du microbiome intestinal et des acides biliaires dans diverses voies de signalisation des troubles hépatiques.

La nécessité d'examiner les mécanismes moléculaires impliqués dans l'interaction du microbiote intestinal, des acides biliaires et des maladies du foie a été soulignée par une étude récente sur des souris29, où ils ont effectué des BDL sur des souris sans germes (GF) et des souris colonisées par la flore Schaedler modifiée. La cholestase aiguë a induit des lésions hépatiques plus graves chez les GF que chez les souris à charge microbienne intestinale limitée, ce qui, comme l'ont montré les auteurs, était associé à des modifications de l'expression des gènes hépatiques impliqués dans la réparation des tissus et à plusieurs fonctions métaboliques et immunitaires ayant des effets hépatoprotecteurs. Néanmoins, le rôle des espèces microbiennes individuelles et les mécanismes fonctionnels des différences induites par les microbes qui modulent les lésions hépatiques sont restés flous. Pour combler cette lacune et suggérer des modifications ciblées du microbiote intestinal qui pourraient être bénéfiques pour atténuer les lésions hépatiques, nous avons effectué ici un séquençage métagénomique shotgun dans le modèle de souris BDL et des souris ShamOP avec échantillonnage longitudinal. De plus, nous avons étudié comment les changements dans la composition des espèces microbiennes et le potentiel de biosynthèse en réponse à l'arrêt des acides biliaires du foie vers l'intestin étaient associés à des profils biochimiques et inflammatoires.

La chirurgie BDL a remodelé le microbiome des souris, résultant en des caractéristiques très distinctes par rapport au contrôle ShamOP. Comme la taxonomie, l'incision abdominale a modifié la capacité fonctionnelle du microbiome des souris BDL et ShamOP, tandis que les altérations n'ont été maintenues que chez les souris BDL. Notre analyse des voies et des CE a révélé le rôle fonctionnel du microbiote dans la pathogenèse lors de lésions hépatiques aiguës. La BDL réduit la production de composés hépatoprotecteurs dans l'intestin, tels que la biotine, la spermidine, l'arginine, l'ornithine, l'isoleucine et la valine42,44,45,46,48,63. La BDL induit la production bactérienne de ménaquinone. Il peut augmenter les dommages au foie en favorisant les protéines dépendantes de la vitamine K, qui jouent un rôle essentiel dans la fibrose chronique du foie64. Les abondances d'EC pour la production de butyrate ont chuté de manière significative chez les souris BDL, suggérant un rôle possible de l'acide biliaire dans le maintien à nouveau stable du niveau de butyrate dans l'intestin65. La réduction du potentiel fonctionnel du microbiote intestinal dans la production de plusieurs composés hépatoprotecteurs (biotine, ornithine, arginine, spermidine, isoleucine et valine) est associée à la diminution des bactéries bénéfiques Anaerotruncus, Blautia, Eubacterium et Lachnoclostridium et à l'augmentation des bactéries nocives dans les maladies du foie (espèces E. coli, E. faecalis et Bacteroidales). La biosynthèse de ces composés était négativement associée aux cytokines inflammatoires (IL-6, IL-23 et MCP-1) liées à la stéatose hépatique et à la fibrose dans la NAFLD52,53,54,55. En revanche, la production plus élevée de ménaquinone dans le microbiome intestinal des souris BDL est liée à des taux élevés d'E. coli et d'E. faecalis et à une réduction des bactéries productrices de butyrate. La production de ménaquinone était positivement associée aux cytokines inflammatoires (GM-CSF, IFN-β, IL-23, IL-6, MCP-1 et TNF-α). Ces résultats mettent en évidence l'association entre les profils de cytokines et le microbiote intestinal et révèlent le mécanisme potentiel par lequel le microbiome intestinal contribue à l'inflammation et aux lésions hépatiques.

Selon Gergiev et al., la plupart des lésions induites par le BDL surviennent au cours des 5 à 7 premiers jours, où des processus inflammatoires aigus sont observés jusqu'au jour 3, et une prolifération significative des voies biliaires est constatée après le jour 566. Le mécanisme de réparation et la prolifération des voies biliaires déterminent l'adaptation moléculaire au cours de la deuxième semaine et rétablissent un flux biliaire partiel qui a un impact sur le microbiome. Par conséquent, nous nous sommes concentrés sur les premiers jours (jours 1, 3 et 7) après la chirurgie dans notre étude pour éviter le biais potentiel induit par la restauration du flux biliaire à des moments tardifs. Par ailleurs, notre étude présente également des limites. L'échantillonnage longitudinal a duré 7 jours, tandis que les lésions hépatiques plus graves (fibrose hépatique) induites par la BDL mettent 20 jours à se développer complètement24. Nous n'avons pu examiner le rôle du microbiome intestinal dans le développement des lésions hépatiques que dans la phase initiale. La composition des espèces bactériennes individuelles et leurs fonctions respectives pourraient continuer à changer et montrer un schéma différent à mesure que la maladie progresse. Les altérations observées dans cette étude peuvent contribuer aux effets initiaux du développement de la BDL et des lésions hépatiques, mais peuvent ne pas être directement liées à une maladie hépatique grave. Ces modifications liées à la cholestase et dépendantes des BA dans le microbiote intestinal et la biochimie au cours des 7 premiers jours de l'étude peuvent servir de précurseurs et favoriser les changements liés à des affections hépatiques plus graves. Des études futures pourraient prolonger l'expérience à au moins 20 jours pour fournir un aperçu complet de la contribution du microbiote intestinal au cours de la fibrogenèse en cours. Il existe également certaines différences entre les pools d'acides biliaires des humains et des souris, ce qui peut limiter la transférabilité de nos découvertes aux humains. La composition des acides biliaires est différente entre les souris et les humains où les acides muricholiques 6-hydroxylés hydrophiles représentent la moitié du pool de BA chez la souris. De plus, la cholestase a un effet différent sur la production de BA chez la souris et chez l'homme, où la BDL augmente la synthèse de BA chez la souris, tandis que chez l'homme, la cholestase réduit la synthèse de BA67,68. Des études futures pourraient utiliser des modèles de souris humanisées pour remédier à ces limites et améliorer notre compréhension du lien entre les acides biliaires, les microbiomes intestinaux et la santé humaine.

Néanmoins, dans l'ensemble, nos résultats révèlent la contribution du microbiote intestinal et son mécanisme moléculaire potentiel lors de l'altération du flux d'acides biliaires du foie vers l'intestin dans l'inflammation hépatique, voire la fibrogenèse en cours, en ciblant la relation entre le métabolisme, le microbiome intestinal et le système immunitaire. Nos découvertes font également progresser nos connaissances sur le rôle des acides biliaires en tant que pierre angulaire de l'axe immunitaire entre le foie et le microbiome intestinal, et leur utilisation optimale en tant que cibles thérapeutiques potentielles.

Toutes les procédures animales expérimentales de cette étude ont été évaluées par le comité consultatif d'éthique indépendant et approuvées par l'autorité gouvernementale locale de Thuringe, Thüringer Landesverwaltungsamt, conformément aux lois et réglementations européennes et allemandes sous la licence UKJ-19-010. Pour toutes les expériences, des souris FVB/NRj mâles et femelles (Laboratoire Janvier, France) ont été hébergées dans des conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques et élevées dans l'animalerie de l'hôpital universitaire de Jena (Allemagne). Tous les animaux ont reçu un régime LASQ (Rod 16, Auto) de la société Altromin, qui était composé de céréales, de sous-produits végétaux, de minéraux, d'huiles, de graisses et de levure, et a fourni aux souris des nutriments bruts avec 16,9 % de protéines brutes, 4,3 % de matières grasses brutes, 4,3 % de fibres brutes et 7,0 % de cendres brutes.

Tous les animaux ont été pesés, notés et ont reçu 1 mg kg-1 de poids corporel (PC)-1 de méloxicam par voie orale (Meloxicam, CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH, Burgdorf, Allemagne, 0,5 mg mL-1 suspension orale) 1 jour et 1 h avant la chirurgie. La préparation pré-chirurgicale, les interventions chirurgicales sous anesthésie (Isoflurane, CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH, Burgdorf, Allemagne, 1,5–3 % dans 100 mL min-1 d'inhalation de courant d'O2) et le traitement post-chirurgical ont été décrits précédemment24,69. La voie biliaire a été ligaturée avec deux sutures en soie tressée 6-0 prédécoupées (Teleflex Medical GmbH, Fellbach, Allemagne, stérilisées et préalablement trempées dans de l'éthanol à 70 %) (groupe BDL). En revanche, le groupe d'opérations factices (ShamOP) a reçu les mêmes interventions chirurgicales à l'exception de la ligature des voies biliaires. Ensuite, les couches abdominales ont été fermées et cousues avec des sutures antibactériennes 4-0 (Johnson & Johnson Medical GmbH Ethicon, Norderstedt, Allemagne, Vicryl Plus avec 17 mm 1/2c RB-1 plus aiguille pré-attachée). Une solution de bupivacaïne de 2 à 4 μg g−1 BW−1 (PUREN Pharma GmbH, München, Allemagne, 2,5 mg mL−1) administrée en injection intra-incisionnelle lors de la suture a renforcé l'analgésie post-chirurgicale. Après la chirurgie, les animaux ont été pesés à nouveau et ont reçu 20 µL g-1 BW-1 Ringer acétate (Berlin Chemie AG, Berlin, Allemagne) par voie sous-cutanée. Les animaux récupérés séparément dans des cages individuelles avec libre accès à l'eau et aux aliments mous sous une lampe chauffante. La cholestase s'est manifestée chez tous les animaux du groupe BDL (mais pas dans le groupe ShamOP) par une décoloration de l'urine et un jaunissement des pattes ou de la cornée environ 12 h après la chirurgie. Les animaux ont été suivis pendant 1, 3 ou 7 jours. Le poids corporel a été mesuré matin et soir. Tous les animaux ont reçu une réanimation liquidienne deux fois par jour jusqu'à ce que le poids corporel soit approximativement au niveau pré-chirurgical. De plus, l'analgésie orale et la notation ont été traitées trois fois par jour.

Des selles fraîches ont été recueillies 1 h avant la chirurgie et 1, 3 et 7 jours après. Les selles ont été prélevées avec des pincettes stérilisées et transférées dans un microtube de 2 ml, où elles ont été immédiatement congelées dans de l'azote liquide pour l'extraction de l'ADN microbien.

À la fin de l'expérience (1, 3 ou 7 jours après la chirurgie), les animaux ont été sacrifiés avec une surdose anesthésique de xylazine (Rompun, Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Allemagne, 80 mg kg-1 PC-1) et de kétamine (bela-pharm GmbH, Vechta, Allemagne, 500 mg kg-1 PC-1). Une fois que les animaux ont atteint la tolérance chirurgicale, l'abdomen a été ouvert et le sang du cœur a été prélevé dans une seringue EDTA stérile de 1 ml connectée à une aiguille de 24 G via une ponction cardiaque finale. Ensuite, le foie et la rate ont été prélevés, congelés dans de l'azote liquide et stockés dans des microtubes à -80 ° C pour une analyse plus approfondie.

Le sang du cœur a été centrifugé à 15 000 × g pendant 15 min à température ambiante (RT) pour obtenir du plasma. Ensuite, 25 μL de plasma de chaque animal ont été traités avec le LEGENDplex Mouse Inflammation Panel (13-plex) (BioLegend, Coblence, Allemagne, #740150) pour quantifier les concentrations de 13 cytokines inflammatoires. Le LEGENDplex Mouse Inflammation Panel est un réseau de billes de cytokines quantifiant des cytokines spécifiques qui sont identifiées en fonction de leur diffusion vers l'avant et de leur fluorescence différentes. Le test a été réalisé, mesuré sur un cytomètre en flux BD Accuri C6 Plus (BD Bioscience, Heidelberg, Allemagne), qui a été validé par le fabricant pour ce test. En conséquence, IL-23, IL-1α, IFN-γ, TNF-α, MCP-1, IL-1β, IL-6, IL-27, IL-17A, IFN-β, GM-CSF et les cytokines anti-inflammatoires IL-12p70 et IL-10 ont été identifiés par cytométrie en flux et quantifiés par rapport à une courbe standard. L'analyse des données a été effectuée conformément au protocole du fabricant à l'aide de l'outil d'analyse en ligne calibré spécifique au lot et au test fourni par BioLegend. La stratégie de déclenchement pour les différentes billes est spécifique au fabricant et fournie avec le kit de matrice de billes de cytokines.

Les concentrations de 15 acides biliaires ont été déterminées dans des hépatocytes isolés à l'aide d'une méthode de quantification LC-MS/MS : acide taurocholique (TCA), acide glycocholique (GCA), acide glycochénodésoxycholique (GCDCA), acide taurochénodésoxycholique (TCDCA), acides taurolithocholiques (TLCA), acide glycolithocholique (GLCA), acide taurodésoxycholique (TDCA), acide glycodésoxycholique (GDCA), acide cholique (CA), chénodésoxy l'acide cholique (CDCA), l'acide ursodésoxycholique (UDCA), l'acide désoxycholique (DCA), l'acide tauroursodésoxycholique (TUDCA), l'acide glycoursodésoxycholique (GUDCA) et l'acide lithocholique (LCA). Les échantillons prépesés ont été mélangés avec un tampon éthanol-phosphate 3 fois (p/v) (solution tampon phosphate 15 % 0,01 mol/L pH 7,5, éthanol 85 %), suivi d'une étape d'homogénéisation dans un broyeur à galets (QiaShredder) et d'une étape de centrifugation (5 min, 16 000 × g). 270 µL de méthanol aqueux à 85 % ont été ajoutés à 30 µL du surnageant de l'échantillon dans un flacon de filtre Thomson Single Step® (membrane PES 0,2 µM, Thomson Instrument Company, Californie). Cette solution a été mélangée pendant 20 s, centrifugée à 200 × g pendant 1 min, filtrée et placée dans l'auto-échantillonneur. Un système de chromatographie liquide haute performance (HPLC) Agilent 1200 (Agilent Technologies GmbH, Böblingen, Allemagne) avec un échantillonneur automatique CTC-PAL couplé à un spectromètre de masse triple quadripôle API 4000 avec source d'ionisation par électrospray (AB Sciex, Darmstadt, Allemagne) a été utilisé tout au long. Toutes les séparations chromatographiques ont été réalisées avec une colonne analytique en phase inverse Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (3,5 µm, 100 × 3 mm) équipée d'une colonne de garde (C18, 4 × 3 mm ; Phenomenex, Aschaffenburg, Allemagne). La phase mobile était constituée d'eau (A) et de méthanol (B), contenant 0,012 % d'acide formique et 5 mM d'acétate d'ammonium, à un débit total de 300 µL min-1.

Le laboratoire clinique de routine de l'hôpital universitaire de Jena a quantifié huit marqueurs biochimiques : albumine, aspartate transaminase (ASAT), alanine transaminase (ALAT), glutamate déshydrogénase (GLDH, GDH), gamma-glutamyltransférase (Gamma-GT), triglycéride, lactate déshydrogénase (LDH) et phosphatase alcaline (ALP) lorsqu'il restait du plasma.

Tous les échantillons de selles (environ ~ 200 mg par échantillon) ont été traités par Novogene (Royaume-Uni). L'ADN a été extrait en utilisant le protocole suivant : les échantillons de selles ont été soigneusement mélangés avec 900 μL de tampon de lyse CTAB. Tous les échantillons ont été incubés à 65 °C pendant 60 min avant d'être centrifugés à 12 000 × g pendant 5 min à 4 °C. Les surnageants ont été transférés dans des tubes de microcentrifugeuse frais de 2 ml et 900 μl de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (25: 24: 1, pH = 6, 7; Sigma-Aldrich) ont été ajoutés pour chaque extraction. Les échantillons ont été soigneusement mélangés avant d'être incubés à température ambiante pendant 10 minutes. La séparation des phases s'est produite par centrifugation à 12 000 × g pendant 15 min à 4 ° C, et la phase aqueuse supérieure a été réextraite avec 900 μL supplémentaires de phénol: chloroforme: alcool isoamylique. Ensuite, les échantillons ont été centrifugés à 12 000 × g pendant 10 min à 4 ° C, et les phases aqueuses supérieures ont été transférées dans de nouveaux tubes de microcentrifugeuse de 2 ml. L'extraction finale a été effectuée avec 900 μL de chloroforme: alcool isoamylique (24: 1) et la séparation des couches s'est produite par centrifugation à 12 000 × g pendant 15 min à 4 ° C. La précipitation de l'ADN a été obtenue en ajoutant la phase supérieure de la dernière étape d'extraction à 450 μL d'isopropanol (Sigma-Aldrich) contenant 50 μL d'acétate d'ammonium 7,5 M (Fisher). Les échantillons ont été incubés à -20 ° C pendant la nuit, bien que des incubations plus courtes (1 h) aient produit des rendements d'ADN plus faibles. Les échantillons ont été centrifugés à 7500 × g pendant 10 min à 4 °C et les surnageants ont été jetés. Enfin, les culots d'ADN ont été lavés dans 1 mL d'éthanol à 70 % (v/v) (Fisher). Le culot final a été séché à l'air et remis en suspension dans 200 μL de tampon TE 75 mM (pH = 8, 0; Sigma-Aldrich). La bibliothèque de séquençage a été générée sur la base des technologies Illumina et en suivant les recommandations des fabricants. Les fragments d'ADN ont été polis en bout, à queue A et ligaturés avec les adaptateurs pleine longueur du séquençage Illumina, suivis d'une amplification PCR supplémentaire avec des oligos P5 et P7 indexés. Les produits de PCR en tant que construction finale des bibliothèques ont été purifiés avec le système AMPure XP. Ensuite, les bibliothèques ont été vérifiées pour la distribution de taille par Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, CA, USA) et quantifiées par PCR en temps réel (pour répondre aux critères de 3 nM). Les librairies qualifiées sont introduites dans des séquenceurs Illumina (système NovaSeq).

Pour le contrôle de la qualité des lectures brutes, nous avons supprimé toutes les séquences d'amorce/adaptateur/lieur Illumina dans la première étape. Par la suite, nous avons utilisé la version 0.7.4 de BWA pour aligner toutes les lectures sur le génome de la souris (version : GRCm39), suivies de la suppression des lectures avec une couverture > 90 % et une identité à 95 %. Nous avons ensuite effectué des comparaisons par paires de lectures appariées pour éliminer les doublons potentiels de PCR, en utilisant le critère de 25 pb qui correspondaient consécutivement aux deux extrémités des lectures avant et arrière. Enfin, nous avons coupé toutes les régions terminales de faible qualité dans chaque lecture, définies comme des bases consécutives avec un score de qualité Phred <2070.

L'annotation taxonomique des lectures de haute qualité a été effectuée par mOTUs2 avec des paramètres par défaut, générant des abondances relatives taxonomiques30. Pour une analyse plus approfondie, des profils de communautés bactériennes ont été construits au niveau de la famille, du genre et de l'espèce pour une analyse plus approfondie. L'annotation fonctionnelle après contrôle qualité a été réalisée par HUManN341. Les abondances quantifiées de la voie et de la famille de gènes dans les unités de RPK (lues par kilobase) ont ensuite été normalisées en unités de copies par million (CPM). Les familles de gènes ont ensuite été regroupées dans le domaine EC pour une analyse plus approfondie.

Toutes les analyses ont été effectuées à l'aide du logiciel statistique R (v4.1.1 ; R Core Team 2021).

Le filtrage de la prévalence a été effectué pour supprimer les caractéristiques à faible prévalence, prévalence <10 %, avant l'analyse de l'abondance différentielle et l'analyse de la diversité.

Les données cliniques ont été analysées par modèle linéaire généralisé, ajusté par le jour de récolte et le poids corporel des souris (données cliniques ~ groupe + jour de récolte + poids corporel). Les données taxonomiques et fonctionnelles ont été normalisées à la ligne de base (changement de facteur log2 [log2FC] du suivi par rapport à la ligne de base) avant analyse et ont été analysées par modèle linéaire, ajustées par le jour de récolte des matières fécales des souris (abondance log2FC ~ groupe + jour de récolte). Les données métagénomiques ont été transformées en rapport logarithmique centré (CLR) à l'aide du microbiome du package R avant l'analyse de corrélation71. Les corrélations de Spearman entre les données ont été analysées avec la fonction rcorr du package R Hmisc72. La valeur P < 0,05 était considérée comme statistiquement significative. Le taux de fausses découvertes (FDR) a été calculé pour ajuster les valeurs P pour les tests d'hypothèses multiples en appliquant la procédure de Benjamini-Hochberg.

La diversité alpha (indices de Shannon, Simpson et Chao1) a été calculée à l'aide du package R vegan73. Le modèle mixte linéaire a été appliqué pour comparer la diversité alpha entre les groupes. Les distances Bray-Curtis ont été calculées à l'aide du package R vegan pour estimer les dissemblances communautaires. Enfin, une analyse multivariée permutationnelle de la variance à l'aide de la fonction adonis du package R vegan a été réalisée pour analyser la diversité bêta entre les groupes. La valeur P < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données brutes de séquençage métagénomique pour tous les échantillons de cette étude ont été déposées dans European Nucleotide Archive sous l'ID d'accession PRJEB57214. De plus amples informations et demandes de ressources et de réactifs doivent être adressées à GP ([email protected]).

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Ce travail a été soutenu par le Centre interdisciplinaire de recherche clinique d'Iéna (ID : AMSP-05) ; Actions Marie Sklodowska-Curie (MSCA) et réseaux de formation innovants, H2020-MSCA-ITN-2018 813781 "BestTreat" ; et la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) dans le cadre de la stratégie d'excellence allemande, EXC 2051, ID de projet 390713860. Les auteurs remercient le Dr Jessica Hoff et le Dr Wanling Foo pour leur soutien à la notation et à la récolte des animaux.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Howell Leung, Ling Xiong.

Microbiome Dynamics, Institut Leibniz pour la recherche sur les produits naturels et la biologie des infections - Institut Hans Knöll, Iéna, Allemagne

Howell Leung, Yueqiong Ni & Gianni Panagiotou

Hôpital universitaire d'Iéna, Département d'anesthésiologie et de médecine de soins intensifs, Iéna, Allemagne

Ling Xiong, Anne Busch, Michael Bauer et Adrian T. Press

Université Friedrich Schiller, Écologie microbienne théorique, Institut de microbiologie, Faculté des sciences biologiques, Iéna, Allemagne

Anne Busch

Université Friedrich Schiller, Faculté de médecine, Iéna, Allemagne

Adrian T. Presse

Université Friedrich Schiller d'Iéna, Institut de microbiologie, Faculté des sciences biologiques, Iéna, Allemagne

Gianni Panagiotou

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GP et ATP ont conçu l'étude. LX et ATP ont effectué des expériences et des prélèvements sur des animaux et ont traité des échantillons de sang et de selles à partir des matériaux. ATP et MB ont supervisé l'expérimentation animale. HL a réalisé l'analyse métagénomique. GP et YN ont supervisé l'analyse métagénomique. GP et YN ont supervisé le manuscrit. HL et GP ont rédigé le manuscrit. HL et LX ont contribué à parts égales à cet article. Tous les auteurs ont lu, révisé et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Adrian T. Press ou Gianni Panagiotou.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Leung, H., Xiong, L., Ni, Y. et al. Un flux altéré d'acides biliaires du foie vers l'intestin révèle des interactions microbiome-immunitaires associées à des lésions hépatiques. npj Biofilms Microbiomes 9, 35 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00398-0

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Reçu : 29 novembre 2022

Accepté : 18 mai 2023

Publié: 07 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41522-023-00398-0

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