Émulsions doubles comme high

ISME Communications volume 3, Numéro d'article : 47 (2023) Citer cet article

Accès 2002

19 Altmétrique

Détails des métriques

Notre compréhension de la physiologie microbienne in situ est principalement basée sur la caractérisation physiologique des microbes à croissance rapide et facilement isolables. Les enrichissements microbiens pour obtenir de nouveaux isolats avec des taux de croissance plus lents ou des physiologies adaptées aux environnements à faible teneur en éléments nutritifs sont en proie à des biais intrinsèques pour les espèces à croissance plus rapide lors de l'utilisation de protocoles d'isolement de laboratoire standard. De nouveaux outils de culture pour minimiser ces biais et enrichir pour les taxons moins bien étudiés sont nécessaires. Dans cette étude, nous avons développé une plateforme d'enrichissement bactérien à haut débit basée sur l'encapsulation et la croissance d'une seule cellule dans des émulsions doubles (GrowMiDE). Nous avons montré que GrowMiDE peut cultiver de nombreux micro-organismes différents et s'enrichir de taxons sous-représentés qui ne sont jamais observés dans les enrichissements par lots traditionnels. Par exemple, empêcher la dominance de l'enrichissement par des microbes à croissance rapide en raison de la privatisation des nutriments dans les gouttelettes à double émulsion a permis la culture de Negativicutes et de Methanobacteria à croissance plus lente à partir d'échantillons de selles dans des cultures d'enrichissement en milieu riche. Dans des expériences de compétition entre des souches spécialisées dans le taux de croissance et le rendement de croissance, les enrichissements GrowMiDE ont empêché la concurrence pour les pools de nutriments partagés et ont été enrichis pour des souches à croissance plus lente mais plus efficaces. Enfin, nous avons démontré la compatibilité de GrowMiDE avec le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) commercial pour obtenir des isolats à partir d'enrichissements GrowMiDE. Ensemble, GrowMiDE + DE-FACS est une nouvelle plateforme d'enrichissement à haut débit prometteuse qui peut être facilement appliquée à divers enrichissements ou cribles microbiens.

Notre compréhension de la physiologie microbienne est largement basée sur des études utilisant des microbes isolés dans des cultures pures. Les techniques d'isolement de nouveaux microbes au cours des 140 dernières années consistent à recréer un environnement favorable et un flux de nutriments en laboratoire qui imitent les conditions naturelles, puis à tenter de récupérer les nouvelles espèces cultivées. En conséquence, les méthodes actuelles sont intrinsèquement biaisées en faveur des microbes à croissance rapide qui peuvent supplanter d'autres espèces pour les nutriments partagés, même les espèces présentant des différences mineures dans le taux de croissance maximal (µMax) (Fig. S1–S3) [1, 2]. Les espèces manquantes à croissance plus lente pourraient avoir des stratégies physiologiques inconnues pour s'adapter à leur environnement naturel et qui jouent probablement un rôle essentiel dans la résilience de la communauté [3]. Par exemple, l'efficacité de la croissance (rendement de la croissance) par rapport aux taux de croissance a été suggérée comme stratégie de survie dans des environnements à faible flux de nutriments ou à structure spatiale, y compris les biofilms [1, 2, 4] et l'environnement sous-marin marin (~ 30 % de la biomasse terrestre) [5,6,7,8]. Un défi supplémentaire non trivial consiste à créer un environnement chimique approprié qui favorise la croissance de différents modes de vie microbiens (par exemple, oligotrophes ou copiotrophes). Par conséquent, il existe un besoin critique de développer de nouveaux outils de culture qui minimisent le biais pour les taux de croissance microbienne rapides.

Les méthodes traditionnelles qui limitent la concurrence pour les ressources finies (c'est-à-dire par la privatisation des nutriments) reposent généralement sur la séparation spatiale et incluent la dilution jusqu'à l'extinction ou le placage pour les unités formant des colonies [9, 10]. Cependant, ces techniques dépendent de l'abondance des cellules, sont à faible débit et ne permettent pas de récupérer les microbes qui se développent mal aux interfaces air-liquide, en particulier les anaérobies [11, 12]. Les approches microfluidiques de gouttelettes sont apparues comme une technique puissante à haut débit pour cultiver de nouveaux micro-organismes dans des bioréacteurs isolés, chacun avec des distributions précises de réactifs nécessaires à la croissance [10, 13, 14, 15, 16], facilitant les cribles de résistances aux antibiotiques [13, 17, 18], et des mesures d'activité cellulaire [19,20,21]. La plupart des approches de gouttelettes microbiologiques utilisent des gouttelettes d'émulsion simples, dans lesquelles des gouttelettes aqueuses contenant des cellules et un milieu sont en suspension dans une phase huileuse. De nombreuses études ont montré l'utilité de la microfluidique à gouttelettes d'émulsion unique pour étudier la diversité microbienne [21, 22, 23, 24], obtenir des génomes de haute qualité [25] et des écrans fonctionnels [10, 13, 16, 18]. Les techniques d'enrichissement en émulsion unique ont également démontré la sélection de souches qui ont des rendements de croissance élevés ou des taux de croissance plus lents, servant de preuve de concept pour l'impact de la privatisation des nutriments sur les résultats de l'enrichissement [26]. Cependant, les gouttelettes d'émulsion uniques nécessitent un équipement personnalisé pour être analysées en aval et n'ont été triées que dans des démonstrations de preuve de concept avec des vitesses de tri lentes et des canaux de fluorescence limités [27, 28], ce qui les rend difficiles à appliquer à de nouveaux systèmes.

Les gouttelettes à double émulsion (DE) sont une plate-forme microfluidique innovante avec le potentiel de simplifier considérablement la croissance microbienne et les isolements [29,30,31,32]. Les DE consistent en un compartiment aqueux interne entouré d'une coquille d'huile en suspension dans une couche aqueuse externe (Fig. 1B). La suspension aqueuse externe rend les DE directement compatibles avec les équipements de cytométrie en flux courants, leur permettant d'être triés via un tri sélectif par fluorescence (FACS) similaire aux cellules [33]. Des travaux récents d'optimisation de la conception de l'appareil, des tensioactifs et des paramètres de tri ont amélioré la capacité de trier les DE à haut débit (12-14 kHz) et avec une précision de gouttelette unique (>99 % de pureté, 70 % de récupération de gouttelette unique) dans les instruments FACS traditionnels [33, 34]. Les applications actuelles de la technologie DE comprennent l'encapsulation cellulaire [21, 29], l'administration de médicaments [31] et les criblages de fonctions protéiques [21]. Cependant, les DE n'ont pas encore été utilisés comme plate-forme d'enrichissement pour les micro-organismes.

Une représentation schématique de la plateforme GrowMiDE. Quatre pompes à seringue entraînent l'huile et les solutions aqueuses dans un dispositif microfluidique personnalisé pour encapsuler des microbes uniques dans des émulsions doubles (DE) de 30 ou 45 µm de diamètre ; La génération DE est surveillée en temps réel par une caméra à grande vitesse fixée à un stéréoscope Amscope. B Image schématique et représentative en fond clair des gouttelettes DE (barre d'échelle = 30 µm). C Images fusionnées en fond clair et fluorescentes de cellules E. coli-GFP simples chargées dans des DE (à gauche) et après croissance dans M9 + glucose pendant 24 h (à droite). D Images de microscopie en fond clair indiquant la croissance de divers anaérobies dans les DE, y compris le sulfate-réducteur Desulfovibrio ferrophilus IS5 sur 60 mM de lactate et 30 mM de NaSO4, l'acétogène Thermoanaerobacter kivui sur 50 mM de glucose à 65 °C, le fermenteur producteur d'acide lactique Lactococcus lactis NZ9000 sur glucose 50 mM et fermenteur acide mixte E. coli MG1655 sur glucose 50 mM.

Nous avons conçu une plate-forme DE à haut débit (GrowMiDE) qui (i) est compatible avec diverses physiologies microbiennes, (ii) facilite les enrichissements et les isolements ultérieurs pour les caractérisations phénotypiques en aval, et (iii) démontre la récupération des espèces microbiennes qui sont normalement perdues en raison de surconcurrence dans les enrichissements par culture discontinue. La plate-forme GrowMiDE a minimisé le biais pour les taux de croissance rapides grâce à la privatisation des nutriments dans les gouttelettes individuelles, facilitant l'enrichissement des espèces à croissance plus lente. À l'aide de GrowMiDE, nous avons démontré l'enrichissement de compositions communautaires distinctes par rapport aux cultures par lots traditionnelles du microbiome intestinal humain, y compris une multiplication par 22 d'une nouvelle espèce de Negativicutes de la liste des microbiomes "les plus recherchés" [35]. Nous avons également déterminé que GrowMiDE peut être appliqué pour enrichir de nouveaux taxons en raison de la priorisation de traits autres que des taux de croissance rapides, en particulier des rendements de croissance plus élevés. Enfin, nous avons démontré la combinaison de GrowMiDE et DE-FACS comme outil d'isolement pour les microbiologistes. Cette plate-forme peut être facilement adaptée à divers systèmes biologiques et nos résultats démontrent la faisabilité de la culture DE à haut débit pour obtenir des représentants cultivés de physiologies négligées.

E. coli MG1655 et E. coli-GFP ont été cultivés en routine sur de la gélose LB ou du milieu M9 additionné de glucose 25 mM à 37 ° C sous agitation. Lactococcus lactis spp cremoris WT (NZ9000) et le mutant dérivé ∆ldhA (NZ9010) [26] ont été cultivés dans 10 mL de milieu chimiquement défini (CDM) [36] additionné de 1,5 % d'acides casaminés (p/v), 26 mg/ L L-tryptophane et 50 mM de glucose à 30 °C. Des cultures de départ de NZ9000 ou NZ9010 ont été inoculées à partir d'une seule colonie de bouillon Difco M17 + 25 mM de glucose (GM17) ou GM17 + 5 ug/mL d'érythromycine, respectivement. Pseudomonas putida a été régulièrement cultivé sur des plaques de gélose LB ou de cétrimide. Toutes les courbes de croissance ont été démarrées avec un inoculum à 1 % provenant d'une culture starter en phase stationnaire. Pour la culture d'anaérobies stricts dans les DE, des cultures stationnaires de 20 ml cultivées dans des flacons de sérum anaérobie de 60 ml ont été utilisées comme inoculum. Desulfovibrio ferrophilus IS5 (DSM n° 15579) a été cultivé à 30 °C dans un milieu d'eau de mer artificiel modifié [37] additionné de lactate 60 mM et de sulfate 30 mM. Thermoanaerobacter kivui TKV002 a été cultivé à 65 ° C dans un milieu contenant 25 mM MES (acide libre), 75 mM MES (sel de sodium), 13,7 mM NaCl, 0,8 mM MgSO4, 18,7 mM NH4Cl, 1,3 mM KCl, 0,1 mM CaCl2, 0,7 mM KH2PO4, uracile 40 µM, solution d'oligoéléments 1 mL/L SL10, solution sélénate-tungstate 1 mL/L, Na2S 1 mM, résazurine 0,5 mg/L et glucose 50 mM comme substrat catabolique dans les DE. Les enrichissements de selles ont été cultivés à 37 °C dans un milieu mBHI modifié contenant : 37 g/L de mélange BHI (RPI), 200 mg/L de tryptophane, 1 g/L d'arginine, 5 mg/mL de ménadione, 500 mg/L de cystéine HCl, Solution d'hémine 0,12 µg/mL [38], mucine 0,2 g/L, résazurine. Pour certains enrichissements, le mBHI a été complété par des composants de milieu supplémentaires (mBHI+) basés approximativement sur les concentrations ajoutées au Gut Microbiota Medium (GMM) [38] : 3 mM de sucres (glucose, cellobiose, maltose, fructose), 30 mM d'acétate de sodium, 8 mM acide propionique, butyrate de sodium 4 mM, lactate de sodium 15 mM, NaHCO3 30 mM.

Les densités cellulaires ont été déterminées sur la base de la densité optique à 600 nm (DO600) à l'aide d'un spectrophotomètre Ultraspec 2100 (GE Healthcare) ou d'un lecteur de microplaques Tecan Infinite M1000. Les profils de glucose et de fermentation des souches de L. lactis ont été quantifiés à l'aide d'un chromatographe liquide haute performance Agilent 1260 Infinity comme décrit précédemment [39]. Pour les expériences de compétition de L. lactis, les unités formant colonies ont été mesurées sur des plaques GM17 (NZ9000 + NZ9010) ou GM17 + 5 ug/mL d'érythromycine (NZ9010 uniquement). L'analyse par microscopie a été réalisée sur un microscope à fluorescence Leica DM4000B-M en utilisant des paramètres standard de fond clair et de filtre FITC.

La configuration Dropception se compose de quatre pompes à seringue pour les phases porteuses (Harvard Apparatus PicoPlus Elite), d'un stéréoscope (Amscope), d'une caméra haute vitesse (ASI 174MM, ZWO) et d'un ordinateur de bureau (HP). Les consommables comprenaient des tubes PE-2, des flacons eppendorf ou anaérobies pour la collecte des gouttelettes, des composants de milieu et de l'huile HFE7500 + 2,2 % de Krytox ionique (FSH, Miller-Stephenson) [40]. Le tableau S2 contient des composants détaillés de la phase aqueuse pour toutes les expériences, mais brièvement, les phases cellulaire et interne des noyaux de gouttelettes aqueuses contenaient généralement un milieu de croissance de bactéries basales (LB, M9, CDM, mBHI), 0,5 % de BSA et tout substrat catabolique indiqué ou colorants. 10% Optiprep (Sigma) a été ajouté à la phase cellulaire en tant que modificateur de densité pour assurer des débits relatifs égaux entre les phases interne et cellulaire pendant la génération de DE en direct. Les cellules ont été diluées à une DO600 = 0, 05 dans la phase de support cellulaire pour le chargement d'une seule cellule (~ 20% des DE contiennent une seule cellule, ~ 2% des DE contiennent 2 cellules) sur la base d'une distribution de Poisson. Les phases porteuses aqueuses externes contenaient un milieu de croissance bactérienne correspondant au noyau aqueux, 2 % de Pluronix F68 (Kolliphor P188, Sigma) et 1 % de Tween-20 (Sigma). Pour les enrichissements anaérobies, tous les composants ont été assemblés à l'intérieur d'une chambre anaérobie (COY) et tous les consommables ont été laissés dans la chambre anaérobie pour éliminer l'excès d'oxygène au moins 3 jours avant utilisation. Les moules maîtres du dispositif Dropception pour les DE de 30 et 45 µm ont été conçus dans AutoCAD 2019 et fabriqués par photolithographie multicouche dans une salle blanche comme décrit précédemment [33]. Les dispositifs Dropception PDMS ont été fabriqués par lithographie douce standard à une couche sur une paillasse de laboratoire standard, comme décrit précédemment [33]. Immédiatement avant l'utilisation, les canaux extérieurs et de sortie des dispositifs PDMS ont été sélectivement traités au plasma O2 pendant 12 minutes à 150 W dans un nettoyeur à plasma Harrick PDC-001, rincés avec du PBS + 2% Pluronic F68, collés avec du scotch et transférés dans la chambre anaérobie ou la configuration aérobie. Les quatre phases (huile, cellule, interne, externe) ont été chargées dans des seringues (PlastiPak, BD) et connectées à l'appareil via un tube PE/2 (Scientific Commodities). Les débits typiques étaient de 300:100:105:6000 (huile : cellule : interne : externe) µL h–1 pour les dispositifs à double entrée de 45 µm et de 275:85:2500 (huile : interne : externe) µL h–1 pour les dispositifs simples -dispositifs d'entrée 30 µm. La génération de DE en direct a été surveillée à l'aide du stéréoscope et de la caméra à grande vitesse à l'intérieur de la chambre anaérobie.

Le DE-FACS a été réalisé comme décrit précédemment sur un Sony SH800 [29, 33]. En bref, 50 µL de DE ont été dilués dans 500 µL de tampon diluant FACS (PBS + 1 % de Tween-20) dans un tube FACS à fond rond de 5 mL 12 × 75 mm (BD Biosciences). Après un autocalibrage standard sur le Sony SH800, les DE ont été doucement remis en suspension avant le chargement, et les gouttelettes ont été analysées sur une puce microfluidique de 130 µm à l'aide d'une configuration laser standard de 408 nm. Les DE apparaissent sur le SH800 après 2 à 3 min dans des portes FSC-H et FSF-W spécifiques, suivies d'un déclenchement ultérieur sur la fluorescence FITC lorsqu'il est indiqué pour le tri (mode rendement). Les ajustements de délai de chute pour le tri ont été calibrés manuellement comme décrit précédemment [33] ; les paramètres de délai de chute optimaux correspondaient généralement à ceux estimés par les paramètres Sony SH800 autocalibrés pour obtenir une récupération DE > 50 % dans des plaques à 96 puits pour des DE de 30 µm. Les taux d'événements pour l'analyse FACS ont été maintenus en dessous de 1000 événements/s et les taux de tri ont été maintenus en dessous de 50 événements/s. Les paramètres de gain pour DE-FACS ont été décrits précédemment [33], à l'exception du gain FITC, qui a été fixé à 32 % ou 40 % pour E. coli GFP ou cellules colorées SYTO, respectivement. Les DE triés ont été déposés dans des tubes FACS ou des plaques à 96 puits préchargées avec 100 µL de solution externe équilibrée sur le plan osmolaire basée sur des composants de support de noyau interne. Les populations DE triées ont été imagées sur un microscope à fluorescence Leica DM4000B-M et un microscope à fond clair Leica DM E.

Les modèles mathématiques utilisés pour simuler les résultats compétitifs des spécialistes du taux par rapport au rendement étaient basés sur les modèles Monod précédents [41, 42], sauf que le terme de dilution a été supprimé pour refléter la croissance dans les cultures alimentées par lots et que les paramètres cinétiques de croissance étaient basés sur des facteurs déterminés expérimentalement. tendances de croissance en monoculture recueillies précédemment [26] et dans le cadre de cette étude. Les équations différentielles utilisées dans le modèle de base et les discussions approfondies sont incluses dans les données supplémentaires.

Le programme MATLAB a été personnalisé pour analyser les images du microscope à fluorescence Leica DM4000B-M (format TIFF) avec les paramètres de fond clair standard et de filtre FITC superposés (F1C). MATLAB a d'abord traité chaque image en accentuant les bords des gouttelettes, en identifiant les coordonnées de chaque gouttelette via la fonction findcircles et en recadrant autour de chaque gouttelette. Ensuite, il a superposé un masque circulaire blanc dimensionné avec les rayons de chaque gouttelette de sorte que seuls les pixels à l'intérieur de la gouttelette soient inclus dans le recadrage de l'image. Les rayons des masques blancs ont été ajustés pour éliminer les limites de bord de gouttelettes en excès (SF5). Ensuite, le code a additionné toutes les intensités de pixels au-dessus d'un seuil déterminé expérimentalement (données non présentées) à l'intérieur de la gouttelette. Ce seuil a été mis en œuvre pour supprimer les pixels noirs en excès afin que les gouttelettes plus grosses ne renvoient pas des intensités de pixel additionnées plus élevées. Le programme a finalement renvoyé un tableau avec toutes les gouttelettes indexées et leurs sommes de fluorescence respectives, qui ont ensuite été analysées pour relier le nombre de cellules à la fluorescence.

L'ADNg a été préparé à partir d'enrichissements de selles à l'aide du kit Qiagen PowerSoil avec l'ajout d'une étape d'incubation de 1 h à 65 ° C avant le battage des billes. Le séquençage de l'amplicon du gène de l'ARNr 16S des échantillons d'ADNg a été réalisé et analysé par le service ZymoBIOMICS (Zymo Research, Irvine, CA). Zymo Research a effectué la préparation de la bibliothèque (Quick-16S rRNA gene amplicon NGS Library Prep, D6400), le CQ post-bibliothèque, le séquençage de lectures appariées de 2 × 300 pb à l'aide d'une plate-forme Illumina MiSeq et l'analyse bioinformatique à l'aide du pipeline Dada2 et QIIME [43 , 44]. Un étalon interne (ZymoBIOMICS Microbial Community DNA Standard D6305) a été inclus pour la préparation de la bibliothèque comme mesure de contrôle de la qualité. Les lectures brutes et les métadonnées ont été soumises à SRA dans le cadre du BioProject PRJNA852267.

Pour encapsuler des cellules microbiennes uniques pour une culture parallèle à haut débit dans des DE, nous avons basé GrowMiDE sur la plate-forme microfluidique Dropception [33], qui consiste en un simple dispositif microfluidique en une étape, des pompes à seringue pour les phases porteuses, une caméra à grande vitesse, et un stéréoscope (Fig. 1A, Fig. S4). Des DE monodisperses de 30 ou 45 µm de diamètre total, respectivement en fonction de la géométrie de l'appareil, ont été générés à ~ 1 kHz contenant : HFE7500 + 2,2 % de Krytox ionique [40] comme phase huileuse, milieu de croissance basal + 2 % de Pluronix F68 + 1 % Tween-20 en tant que phase externe, et PBS ou milieu de croissance basal + 0,5 % de BSA + substrats cataboliques en tant que phases cellulaire et interne, respectivement (Fig. 1A, B). Après avoir généré des DE dans le dispositif microfluidique, nous les avons collectés en vrac pour une incubation ou une analyse en aval (Fig. 1B). Pour garantir que les DE ne contenaient qu'une seule cellule après le chargement stochastique, nous avons opéré dans un régime de Poisson dans lequel 80 % des DE étaient vides et 98 % des DE contenant des cellules ne contenaient qu'une seule cellule (OD600 0, 05 en phase porteuse de cellule). La collecte de DE pendant 4 h a donné environ 48 millions de cultures de microréacteurs DE parallèles contenant des cellules individuelles, permettant une encapsulation accrue d'espèces à faible abondance.

Pour déterminer si des cellules individuelles encapsulées dans des DE se développeraient, toutes les DE ont été incubées en vrac et la croissance microbienne dans les gouttelettes a été évaluée par microscopie à fond clair ou à fluorescence (Fig. 1C, D). L'incubation d'une nuit de DE contenant des cellules uniques d' Escherichia coli exprimant constitutivement la GFP a donné des DE contenant 30 à 100 cellules (~ 5 à 7 générations), indiquant une croissance robuste des gouttelettes non inhibées par les composants DE (Fig. 1C). GrowMiDE est compatible avec la croissance microbienne aérobie et anaérobie ; la configuration Dropception est entièrement utilisable dans une boîte à gants anaérobie (Fig. S4). Pour démontrer ces capacités, nous avons réussi à encapsuler et à cultiver plusieurs microbes facultatifs et strictement anaérobies, notamment E. coli MG1655 (effectuant une fermentation acide mixte), Lactococcus lactis spp cremoris NZ9000 (fermentation produisant de l'acide lactique), Desulfovibrio ferrophilus IS5 (réduction des sulfates) et le thermophile Thermoanaerobacter kivui (acétogénèse à 65 °C) (Fig. 1D). Ces résultats établissent que les DE sont une plate-forme à haut débit appropriée pour cultiver diverses espèces microbiennes.

Pour quantifier la croissance des DE, nous avons développé un script MATLAB personnalisé pour détecter automatiquement les intensités par gouttelette à partir d'images de microscopie à fluorescence (Fig. S5, S6). En utilisant E. coli exprimant la GFP et ce script automatisé, nous avons analysé la croissance des DE contenant du glucose ou de l'acétate dans la phase interne en tant que seuls substrats cataboliques (Fig. S7A). La croissance nette d'E. coli-GFP dans les DE correspondait aux cultures par lots (Fig. S7B – D), ce qui indique que les rendements de croissance d'E. coli-GFP dans GrowMiDE et les cultures par lots sont comparables. Ensemble, ces données démontrent que la plateforme GrowMiDE peut être utilisée pour cultiver et quantifier la croissance de diverses espèces microbiennes à haut débit.

Nous avons ensuite utilisé la plateforme GrowMiDE pour cultiver des cellules d'une communauté microbienne mixte. Nous nous sommes concentrés spécifiquement sur le microbiome intestinal humain en raison de la connaissance des principaux groupes métaboliques de micro-organismes [45, 46, 47, 48] et des conditions de milieu établies qui peuvent cultiver de nombreux taxons différents [35, 49]. Plus précisément, nous avons testé si la culture GrowMiDE était enrichie pour de nouveaux taxons en comparant les enrichissements microbiens effectués dans des cultures par lots ou des DE (Fig. 2A) (Tableau S3). En bref, des échantillons de selles ont été homogénéisés, filtrés et centrifugés pour éliminer les grosses particules et isoler les suspensions cellulaires. Les suspensions cellulaires ont ensuite été diluées dans mBHI à une faible concentration cellulaire (OD600 ~ 0,05) pour minimiser le risque d'encapsuler plus de 1 cellule par DE à moins de 2 % de tous les événements totaux. Le séquençage de l'amplicon du gène ARNr 16 S a révélé une composition de communauté microbienne clairement distincte dans les enrichissements GrowMiDE par rapport aux cellules cultivées par lots, même dans le même milieu de base (mBHI) (Fig. 2D). Alors que le nombre absolu d'espèces récupérées ne différait pas significativement entre les enrichissements par lots et GrowMiDE (Fig. 2B), les identités uniques des ASV enrichis étaient significativement différentes (Fig. 2C). Fait intéressant, GrowMiDE a produit de manière unique une croissance significative (6,0 ± 4,0%, SD, 4/6 répétitions) du méthanogène hydrogénotrophique intestinal Methanobrevibacter smithii, enrichi d'environ 0,4% dans la communauté de selles d'entrée correspondante (Fig. 2D, Fig. S8A, C) . L'augmentation la plus surprenante d'un seul taxon dans les enrichissements de GrowMiDE a été l'enrichissement du Negativicutes Phascolarctobacterium faecium (17,8 ± 9,8%, SD, 6/6 répliques), une augmentation de 22 fois par rapport à l'abondance relative dans la communauté des selles d'entrée (0,8 ± 0,2 %, ET, n = 5). (Fig. 2D, Fig. S8B, D). Les Negativicutes sont un groupe phylogénétique mal compris avec une structure d'enveloppe cellulaire unique, et on pense qu'ils jouent un rôle dans la production d'acides gras à chaîne courte critiques (SCFA) dans le microbiome intestinal [50, 51]. Le métabolisme in situ de P. faecium est inconnu, mais on pense que son catabolisme primaire est la fermentation secondaire (du succinate au proprionate) [52]. Étonnamment, P. faecium est présent dans plus de 67% des échantillons de selles humaines [50], cependant, il est difficile à isoler et, par conséquent, il figurait sur la liste des "Most Wanted" du Human Microbiome Project [35].

Un aperçu schématique des enrichissements de selles dans les DE par rapport aux enrichissements par lots dans le mBHI. B Diversité alpha des selles d'entrée, GrowMiDE et enrichissements par lots basés sur des ASV uniques totaux. Les diagrammes à barres flottantes représentent la moyenne et la plage, n = 5–6. C Beta diversité des selles d'entrée, GrowMiDE et enrichissements par lots basés sur le type d'ASV uniques. D Abondances relatives d'amplicons du gène de l'ARNr 16 S à partir d'échantillons de selles d'entrée, d'enrichissements GrowMiDE et d'enrichissements par lots à partir de suspensions de cellules fécales. E Abondances relatives d'amplicons du gène de l'ARNr 16 S à partir d'un cours temporel d'enrichissement des selles dans DE par rapport aux cultures par lots sacrifiées à 12, 24, 48 et 72 h, et abondances absolues correspondantes de l'amplicon du gène de l'ARNr 16 S de (F) M. smithii (classe : Methanobacteria) et (G) P. faecium (classe : Negativicutes). Des explications détaillées des conditions d'enrichissement et des types d'échantillons de la figure 2D sont décrites dans le tableau S3.

Dans les cultures par lots, la composition microbienne finale a été principalement établie dans les 12 h, ce qui correspond à une croissance dominée par les espèces les plus rapides dans un environnement de laboratoire artificiel (par exemple E. coli et Enterococcus spp) (Fig. 2E). Cependant, dans les enrichissements GrowMiDE, nous avons observé un enrichissement progressif et une augmentation des copies de gènes de M. smithii et P. faecium au fil du temps (Fig. 2E – G). L'apparition de ces taxons à des moments ultérieurs et leur enrichissement dans le temps soutiennent l'hypothèse selon laquelle la plateforme GrowMiDE a diminué le biais contre les espèces à croissance plus lente et a facilité l'enrichissement de nouvelles physiologies, même avec un milieu non sélectif.

Nous avons émis l'hypothèse que les cultures de selles GrowMiDE enrichies pour les taxons à croissance plus lente en minimisant la concurrence pour les nutriments partagés entre les gouttelettes (c'est-à-dire la privatisation des nutriments). La privatisation des nutriments par la structuration spatiale favorise la diversité dans les communautés, y compris les microbes qui donnent la priorité au rendement de croissance par rapport au taux qui serait autrement perdu dans les enrichissements en laboratoire (Fig. S1C). Les compromis entre les spécialistes du taux et du rendement ont été bien documentés dans les souches de Lactococcus lactis [26, 36] (Fig. 3A). Dans des conditions de flux de glucose élevé, le type sauvage L. lactis (NZ9000) fermente 1 mol de glucose en 2 mol de lactate par fermentation d'acide lactique homofermentaire (Fig. S2A), ce qui donne un rendement net de 2 mol d'ATP par mol de glucose. Dans des conditions de faible flux de glucose, la fermentation se déplace vers la formation d'éthanol et d'acétate (Fig. S2B), ce qui entraîne un gain net total de 3 mol d'ATP par mol de glucose. Ce dernier métabolisme fermentatif est verrouillé dans un mutant de délétion de L. lactis lactate déshydrogénase (∆ldhA, NZ9010). Bien que la souche ∆ldhA ait un rendement de croissance plus élevé, elle a pour compromis une réduction du taux de croissance maximal (Fig. 3B). Dans d'élégantes expériences d'émulsion unique, l'encapsulation des souches WT et ∆ldhA a entraîné un enrichissement de la souche ∆ldhA efficace, mais à croissance plus lente à travers les transferts [26].

A Voies de fermentation des souches L. lactis WT (noir) et ∆ldhA (rouge) dans des cultures discontinues mixtes ou des enrichissements GrowMiDE. B Croissance des monocultures et cocultures de L. lactis (rapport de départ 1:1) sur CDM + glucose 25 mM (n = 3, répétitions biologiques, les barres d'erreur indiquent SEM). C Fréquences des populations à travers les transferts dans des cultures discontinues mixtes de souches de L. lactis sur glucose 50 mM. Chaque transfert a reçu un inoculum de 1 % dans du CDM frais + 50 mM de glucose, et les UFC pour chaque souche ont été déterminées à partir de la communauté cultivée à chaque transfert (n = 3, répétitions biologiques, les barres d'erreur indiquent SEM). D Densités cellulaires à travers les transferts dans les enrichissements GrowMiDE de souches de L. lactis sur 50 mM de glucose. La culture mixte initiale contenait environ 80 % de ∆ldhA tel que déterminé par les UFC/mL sur les plaques CDM + Ery5. À la fin de chaque transfert, les DE ont été perturbés en vrac par incubation avec 1H,1H,2H,2H-perfluoro-1-octanol (PFO), dilué à une DO = 0,05 pour obtenir une seule cellule de chargement, et les cellules ont été re -emballé dans des DE pour le prochain transfert. (n = 3, répliques techniques, les barres d'erreur indiquent SEM). Les UFC pour chaque souche ont été déterminées à partir de la communauté cultivée à chaque transfert pour déterminer les densités cellulaires relatives, et la culture mixte initiale contenait environ 80 % de ∆ldhA avant de se diviser en expériences de compétition par lots ou DE. Tous les transferts de L. lactis ont été incubés pendant 48 h à 30 °C.

Pour tester si les DE maintenaient de manière similaire les populations avec un rendement de croissance plus élevé, nous avons mis en compétition les souches L. lactis WT et ∆ldhA en lots par rapport aux enrichissements GrowMiDE sur des transferts en série. Les taux de croissance des cocultures discontinues contenant un mélange 1: 1 des deux souches ressemblaient à la souche WT plus rapide (Fig. 3B), ce qui était cohérent avec le WT constituant plus de 80% de la culture après le transfert 0 (Fig. 3C). Comme prévu, même lorsque la souche ∆ldhA a été inoculée à une fréquence élevée de 80 %, elle a été surpassée à moins de 0,003 % par WT dans les 2 transferts en culture discontinue (Fig. 3C) [26]. En revanche, la population ∆ldhA plus lente a été maintenue et a même dominé WT dans les enrichissements GrowMiDE à travers les transferts (99,33 % ∆ldhA par transfert 4) (Fig. 3D), ce qui montre que GrowMiDE peut conserver ou même enrichir les espèces à croissance plus lente des communautés mixtes à travers privatisation des nutriments.

Une caractéristique utile des plates-formes DE est la compatibilité directe avec la microscopie traditionnelle ou FACS (DE-FACS) (Fig. 4A) [33, 34, 53, 54]. Le développement d'une plate-forme qui facilite l'encapsulation à haut débit et la capacité d'isoler sélectivement les gouttelettes d'intérêt a de nombreuses applications, notamment une meilleure récupération du génome [55], des tests de sensibilité aux antimicrobiens [18, 56] et des études d'évolution dirigée [57]. Pour tester si nos DE contenant des cellules pouvaient être distingués et isolés avec précision des DE vides par fluorescence pendant le FACS, nous avons encapsulé et cultivé des cellules E. coli exprimant la GFP dans les DE, puis tenté d'isoler uniquement les gouttelettes contenant des cellules via les FAC. Des populations FACS distinctes de DE vides et chargées de cellules ont été observées par FACS, et des mesures de microscopie fluorescente ont confirmé que 97, 5% de la population positive triée contenait des DE intacts chargés de cellules (Fig. S9A). En accord avec les résultats de la microscopie, nous n'avons pas été en mesure de différencier les DE vides des DE chargés de cellules en fonction de la diffusion vers l'avant ou latérale pendant le FACS. Nous avons également évalué si DE-FACS peut différencier les DE vides et contenant des microbes en ajoutant le colorant fluorescent SYTObc lors de l'encapsulation cellulaire, ouvrant ainsi la possibilité de détecter et de trier des espèces non génétiquement traitables. Une limitation des approches à base de colorant SYTO est le marquage différentiel des espèces à de faibles concentrations (<1 µM) [58] ; nous avons donc choisi d'utiliser 2,5 µM SYTObc qui contient un mélange de colorants à base de SYTO pour augmenter les chances de coloration cellulaire universelle. Nous avons identifié des portes FACS qui distinguaient les DE vides des DE contenant E. coli MG1655 chargé avec 2, 5 µM de SYTObc cultivé pendant 24 h (Fig. S9B). Au sein de la population SYTO+ DE, 92,2 % contenaient des cellules, comme l'a confirmé la microscopie à fond clair basée sur la détection de la motilité cellulaire. Des temps d'incubation plus longs ont diminué le signal de fluorescence ; cependant, les populations SYTO + DE étaient encore détectables à 48 h (Fig. 4C). Par rapport à l'enrichissement GrowMiDE d'entrée qui contenait environ 80 % de DE vides, DE-FACS a entraîné un enrichissement de 443 et 419 fois pour les DE contenant E. coli-GFP et E. coli + SYTObc DE, respectivement. Ces résultats démontrent l'application de DE-FACS pour trier les gouttelettes DE contenant des cellules bactériennes cultivées.

Un aperçu et des applications potentielles pour les enrichissements microbiens à l'aide de GrowMiDE suivi de DE-FACS pour obtenir des isolats. B Rapports relatifs de 4 souches catabolisant le glucose dans une communauté fictive enrichie en cultures discontinues ou sur la plateforme GrowMiDE sur CDM + 25 mM de glucose pendant 48 h. n = 3. Les barres d'erreur indiquent SEM. Profils C FACS de DE de 30 µm contenant la communauté fictive encapsulée avec 2,5 µM de SYTObc après 48 h et ensuite triée dans des puits individuels sur une plaque à 96 puits. Les puits de plaque ont été préchargés avec un milieu de croissance et 10 uL de PFO pour perturber les DE. 767 événements ont été classés dans les 2 % supérieurs de la population SYTO+ DE (38 321 événements) et 192 ont été triés sur des plaques pour évaluer la croissance. D Courbes de croissance de 34 isolats de sortie représentatifs en aval du DE-FACS. Tous les tests de croissance ont été effectués à 30 °C.

Un obstacle majeur dans la microfluidique à émulsion unique et le tri FACS traditionnel à cellule unique est la difficulté à isoler les cellules vivantes pour l'analyse phénotypique en aval. Alors que les génomes unicellulaires peuvent parfois être récupérés dans des processus en aval même si les cellules meurent [59, 60], la préservation de la viabilité cellulaire dans les populations triées est essentielle pour la caractérisation en aval de la physiologie microbienne. La culture microbienne à haut débit utilisant GrowMiDE et les isolements en aval utilisant DE-FACS a donc le potentiel d'être une approche puissante pour les écrans, les enrichissements et les isolements (Fig. 4A). Comme preuve de concept, nous avons démontré l'application de GrowMiDE + DE-FACS dans une communauté synthétique catabolisant le glucose contenant E. coli, Pseudomonas putida, L. lactis WT et L. lactis ∆ldhA. La communauté synthétique a été choisie en raison (i) de la compatibilité de toutes les espèces dans un milieu défini, (ii) d'une utilisation catabolique comparable du glucose et (iii) de la possibilité d'utiliser un placage sélectif pour évaluer phénotypiquement les identités des espèces à partir de cultures mixtes. E. coli a dominé les enrichissements par lots et GrowMiDE en raison d'un taux de croissance relatif et de rendements plus élevés dans les cultures pures (Fig. S10); cependant, seule la culture GrowMiDE a conservé les 4 souches de la communauté synthétique (Fig. 4B, Fig. S11). Illustrant comment même des diminutions mineures des taux de croissance maximaux peuvent entraîner la perte d'espèces dans les cultures par lots, P. putida était fréquemment perdue dans les compétitions de culture par lots après 48 h malgré le deuxième taux de croissance et le rendement les plus élevés en monocultures (Fig. S10). Pour les enrichissements GrowMiDE, nous avons trié les DE individuels de la population SYTO + DE (Fig. 4C) dans des plaques à 96 puits, libéré des populations clonales encapsulées à partir de DE avec PFO et collecté les mesures de croissance des isolats récupérés. Ici, nous avons utilisé des incubations de 48 h malgré une diminution des intensités bactériennes colorées et des portes FACS plus larges résultantes pour donner suffisamment de temps à toutes les souches pour se développer dans les DE (Fig. 4C, Fig. S10). Notre approche comprenait des DE faiblement fluorescents pour limiter le biais dans l'efficacité de la coloration entre différentes espèces avec le compromis de trier une fraction plus élevée de DE vides (Fig. 4C). Sur deux réseaux de plaques à 96 puits, 77 puits contenaient des bactéries récupérées à partir de DE triés, dont 73 (95%) ont été confirmés comme étant des cultures pures par placage sélectif pour les 4 espèces d'entrée (Fig. 4D). Conformément aux 2 abondances d'espèces dominantes des enrichissements GrowMiDE (87 % E. coli : 12 % P. putida), 79 % des cultures pures récupérées étaient E. coli et 16 % étaient P. putida. Ensemble, ces résultats démontrent la faisabilité des enrichissements et des isolements microbiens à l'aide de GrowMiDE + DE-FACS.

Ici, nous avons démontré une nouvelle application de la technologie DE pour cultiver des microbes et effectuer des enrichissements à haut débit pour des microbes à croissance plus lente dans des communautés définies et non définies. Nous avons démontré que de nombreuses espèces microbiennes métaboliquement diverses peuvent se développer dans GrowMiDE, y compris les anaérobies stricts (Fig. 1). De plus, GrowMiDE peut également faciliter l'enrichissement pour les microbes poursuivant une stratégie de rendement de croissance sur le taux de croissance (Fig. 3D). Les enrichissements GrowMiDE ont produit de manière unique des espèces microbiennes qui n'ont jamais été observées dans la culture par lots en utilisant le même milieu d'enrichissement (Figs. 2,4). Enfin, nous avons démontré l'application de GrowMiDE et DE-FACS en tant que plate-forme pour obtenir des isolats pour la caractérisation en aval et les études physiologiques (Fig. 4).

Dans notre étude, la privatisation des nutriments a permis aux espèces à croissance lente d'échapper à la concurrence [1, 2]. Bien que les DE séparent spatialement les cellules et les grandes macromolécules dans des microréacteurs séparés, le noyau aqueux interne n'est séparé de l'environnement que par une fine coque d'huile. En fonction des tensioactifs locaux et des agents bloquants utilisés dans la couche d'huile, les DE peuvent donc être sélectivement perméables aux petites molécules, notamment l'oxygène, les sels et certains colorants [30, 31, 32, 61]. Cet effet serait réglable en fonction des propriétés et des concentrations du surfactant [61]. D'autres études rhéologiques sur les DE ont également montré que la rhodamine A, les conjugués de BSA et l'anhydrotétracycline peuvent circuler à travers la coque d'huile dans un système de délivrance médié par le pH dans certaines formulations de DE [31]. Le mécanisme moléculaire du croisement est inconnu, bien que la diffusion facilitée et l'émulsification spontanée aient été émises [31, 62].

Bien qu'il soit possible que de faibles niveaux de croisement de sources de carbone se soient produits dans nos enrichissements GrowMiDE, les niveaux de glucose retenus dans les DE sont restés suffisants pour favoriser la croissance des mutants L. lactis ∆ldhA à croissance lente (Fig. 3D). Les degrés de privatisation des nutriments peuvent être dynamiques ; même une privatisation partielle, dans laquelle la concurrence est limitée, peut être suffisante pour préserver des populations distinctes [63,64,65]. Une autre possibilité est que la faible perméabilité des DE pour certains composés aurait pu faciliter la croissance de M. smithii et/ou P. faecium. P. faecium et M. smithii ont été indiqués comme étant entièrement dépendants des métabolites nourris de manière croisée de la communauté intestinale, succinate et H2 respectivement ; cependant, aucun composé n'a été ajouté aux enrichissements GrowMiDE. H2 est produit pendant la fermentation par de nombreuses espèces intestinales co-enrichies et devrait se diffuser facilement à travers l'huile HFE7500. Nous n'avons pas pu détecter H2 dans les espaces de tête des enrichissements DE, mais il est possible que H2 soit inférieur à la limite de détection (<10ppm), surtout s'il a été rapidement consommé par M. smithii. En raison du petit volume d'échantillon dans les enrichissements DE (<500 µL), nous n'avons pas pu mesurer le CO2, mais les incubations DE complétées avec du bicarbonate de sodium 30 mM (mBHI+) ou sans (mBHI) ont donné des enrichissements similaires de M. smithii. Pour les enrichissements en P. faecium, on ne sait pas comment les concentrations picomolaires de croisement de succinate d'une sous-section d'une communauté mixte favoriseraient un enrichissement significatif. L'analyse complète de la séquence du génome des deux souches isolées existantes de P. faecium suggère que la fermentation du succinate en proprionate est leur seul catabolisme primaire [66]. Cependant, il est possible que l'enrichissement GrowMiDE ait facilité l'utilisation d'autres substrats cataboliques qui étaient disponibles dans nos enrichissements, soit dans le milieu basal mBHI, soit produits par une autre espèce. Il a été suggéré que P. faecium participe à l'alimentation croisée en vitamine B12 avec Bacteroidetes [67]. Les enrichissements de culture par lots de contrôle complétés avec des composants DE n'ont pas enrichi pour P. faecium (données non présentées), excluant la possibilité d'un catabolisme de l'huile ou des tensioactifs DE.

Malgré un enrichissement significatif de l'abondance relative des espèces à croissance plus lente dans nos enrichissements du microbiome intestinal, nous n'avons pas pu isoler avec succès P. faecium. Plusieurs tentatives d'isolement au cours d'une année n'ont pas réussi à produire des isolats de P. faecium, y compris une incapacité à reproduire avec succès l'isolement précédent de P. faecium sur des plaques de chocolat ou de milieu anaérobie Gifu [50, 66]. En raison de la physiologie inconnue de notre P. faecium poussant sur des milieux sans succinate dans les DE et de la possibilité d'alimentation croisée, nous soupçonnons que nous n'avons pas été en mesure de récapituler des conditions de croissance similaires sur des plaques solides avec des colonies isolées. Nous avons tenté d'utiliser DE-FACS pour isoler P. faecium directement dans des cultures liquides, mais le signal SYTObc était trop faible après plus de 48 h d'incubation pour distinguer clairement les gouttelettes vides des gouttelettes pleines dans des conditions anaérobies. L'application réussie de DE-FACS pour obtenir P. faecium est donc actuellement limitée par le manque de colorants hautement fluorescents qui fonctionnent dans des conditions entièrement anaérobies. Récemment, des travaux prometteurs ont été réalisés dans la création de protéines rapporteurs fluorescentes anaérobies [68, 69], mais les physiologistes microbiens bénéficieraient grandement de la création de colorants fluorescents anaérobies pour les systèmes non génétiquement traitables. En plus du manque de choix de colorants fluorescents puissants, certains anaérobies stricts, y compris éventuellement P. faecium, ne survivraient probablement pas à une exposition transitoire à l'oxygène pendant le tri sur un instrument FACS commercial. Cependant, des chambres de tri anaérobies personnalisées dans les instruments FACS existent [70, 71] et certains anaérobies stricts ont été récupérés avec succès après le tri [72].

Les progrès récents de la technologie microfluidique pour augmenter le nombre d'espèces cultivées comprennent des dispositifs personnalisés pour isoler et incuber des cellules individuelles (iChip, SlipChip) [73,74,75] et la culturomique, dans laquelle les colonies bactériennes sont disposées dans des conditions de milieu sur des plaques et identifiées à l'aide MALDI-TOF [49]. Cependant, ces technologies ont un débit limité et nécessitent un équipement spécialisé et coûteux pour analyser et trier les cultures cultivées. La plate-forme d'enrichissement GrowMiDE est très adaptée à diverses applications et ne nécessite qu'une instrumentation simple, qui peut toutes être assemblées et utilisées avec une formation minimale. Dans cette étude, nous avons montré que GrowMiDE éliminait la concurrence avec les microbes à croissance plus rapide et enrichit les microbes d'une communauté mixte qui sont catégoriquement perdus dans les cultures par lots dans les mêmes conditions de milieu (Fig. 4). En plus d'utiliser GrowMiDE comme outil d'enrichissement à haut débit, nous sommes ravis de la perspective future d'utiliser DE-FACS comme outil de dépistage pour les communautés aérobies non définies. Le développement de méthodes d'enrichissement à haut débit telles que celles qui ne favorisent pas les micro-organismes à croissance rapide et qui sont compatibles avec les équipements FACS couramment disponibles pourrait constituer une nouvelle approche pour lutter contre «l'anomalie du nombre de plaques».

Toutes les données brutes et les scripts Matlab sont librement accessibles à tout chercheur sur demande. Les données de séquençage de l'amplicon du gène ARNr 16S ont été soumises à la SRA dans le cadre du BioProject PRJNA852267.

Pfeiffer T, Schuster S, Bonhoeffer S. Coopération et compétition dans l'évolution des voies de production d'ATP. Science. 2001;293:1436.

CAS Google Scholar

Kreft JU. Les biofilms favorisent l'altruisme. Microbiologie. 2004;150:2751–60.

Article CAS PubMed Google Scholar

Weissman JL, Hou S, Fuhrman JA. Estimation des taux de croissance microbienne maximaux à partir de cultures, de métagénomes et de cellules individuelles via des modèles d'utilisation de codons. Proc Natl Acad Sci USA. 2021;118:1–10.

Article Google Scholar

Rouleau BRK, Schmidt TM. La physiologie et les implications écologiques d'une croissance efficace. ISME J. 2015;9:1481–7.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Gray DA, Dugar G, Gamba P, Strahl H, Jonker MJ, Hamoen LW. Croissance extrêmement lente comme stratégie alternative pour survivre à une famine profonde chez les bactéries. Nat Commun. 2019;10:1–12.

Article CAS Google Scholar

Jørgensen BB, Marshall IPG. Vie microbienne lente dans les fonds marins. Ann Rev Mar Sci. 2016;8:311–32.

Article PubMed Google Scholar

Levier MA. L'acétogénèse dans la biosphère profonde en manque d'énergie, un paradoxe ? Microbiol avant. 2012;2:1–18.

Article Google Scholar

Lloyd KG, Bird JT, Buongiorno J, Deas E, Kevorkian R, Noordhoek T, et al. Preuve d'une zone de croissance pour les clades microbiens du sous-sol profond dans les sédiments anoxiques proches de la surface. Appl Environ Microbiol. 2020;86:e00877–20.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schut F, Quang P, Martin R, Robertson BR. Viabilité et isolement des bactéries marines par culture de dilution : théorie, procédures et premiers résultats. Appl Environ Microbiol. 1993;59:881–91.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Mahler L, Niehs SP, Martin K, Weber T, Scherlach K, Hertweck C, et al. Culture de gouttelettes hautement parallélisée et priorisation sur les producteurs d'antibiotiques des communautés microbiennes naturelles. Elife. 2021;10:1–23.

Article Google Scholar

Greenberg L. Isolement d'une seule colonie d'anaérobies. Can Public Heal J. 1941;32:314–6.

Google Scholar

Hanišáková N, Vitězová M, Rittmann SKMR. L'évolution historique des techniques de culture des méthanogènes et autres anaérobies stricts et leur application à la microbiologie moderne. Microorganismes. 2022;10:412.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Watterson WJ, Tanyeri M, Watson AR, Cham CM, Shan Y, Chang EB, et al. Culture à haut débit basée sur des gouttelettes pour un dépistage précis des microbes intestinaux résistants aux antibiotiques. Elife. 2020;9:1–22.

Article Google Scholar

Liu W, Kim HJ, Lucchetta EM, Du W, Ismagilov RF. Isolement, incubation et tests fonctionnels parallèles et identification par FISH de cellules microbiennes rares à copie unique provenant de mélanges multi-espèces en utilisant la combinaison de la chimistrode et du confinement stochastiqueY. Puce de laboratoire. 2009;9:2153–62.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Grodrian A, Metze J, Henkel T, Martin K, Roth M, Köhler JM. Génération de flux segmenté par des réacteurs à puce pour une culture cellulaire hautement parallélisée. Biosens Bioélectron. 2004;19:1421–8.

Article CAS PubMed Google Scholar

Villa MM, Bloom RJ, Silverman JD, Durand HK, Jiang S, Wu A, et al. Variation interindividuelle du métabolisme des glucides alimentaires par les bactéries intestinales révélée par la culture microfluidique en gouttelettes. mSystèmes. 2020;5:1–17.

Article Google Scholar

Kim HJ, Boedicker JQ, Choi JW, Ismagilov RF. La structure spatiale définie stabilise une communauté bactérienne synthétique multi-espèces. Proc Natl Acad Sci USA. 2008;105:18188–93.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Churski K, Kaminski TS, Jakila S, Kamysz W, Baranska-Rybak W, Weibel DB, et al. Dépistage rapide de la toxicité des antibiotiques dans un système automatisé de microgouttelettes. Puce de laboratoire. 2012;12:1629–37.

Article CAS PubMed Google Scholar

Huebner A, Olguin LF, Bratton D, Whyte G, Huck WTS, De Mello AJ, et al. Développement de dosages enzymatiques cellulaires quantitatifs en microgouttelettes. Chimie anale. 2008;80:3890–6.

Article CAS PubMed Google Scholar

Jarosz DF, Brown JCS, Walker GA, Datta MS, Ung WL, Lancaster AK, et al. La communication chimique entre les royaumes entraîne une transformation du métabolisme héréditaire et mutuellement bénéfique basée sur les prions. Cellule. 2014;158:1083–93.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Terekhov SS, Smirnov IV, Stepanova AV, Bobik TV, Mokrushina YA, Ponomarenko NA, et al. Plateforme de gouttelettes microfluidiques pour le criblage unicellulaire à ultra haut débit de la biodiversité. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114:2550–5.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zengler K, Zaramela LS. Le réseau social des micro-organismes - comment les auxotrophes façonnent des communautés complexes. Nat Rev Microbiol. 2018;16:383–90.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Terekhov SS, Smirnov IV, Malakhova MV, Samoilov AE, Manolo AI, Nazarov AS, et al. Profilage fonctionnel à très haut débit des communautés de microbiote. Proc Natl Acad Sci USA. 2018;115:9551–6.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Park J, Kerner A, Burns MA, Lin XN. Co-culture hautement parallèle de communautés microbiennes activée par microgouttelettes. PLoS One. 2011;6:e17019.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dichosa AEK, Daughton AR, Reitenga KG, Fitzsimons MS, Han CS. Capturer et cultiver des cellules bactériennes individuelles dans des microgouttelettes de gel pour obtenir des génomes presque complets. Protocole Nat. 2014;9:608–21.

Article CAS PubMed Google Scholar

Bachmann H, Fischlechner M, Rabbers I, Barfa N, Dos Santos FB, Molenaar D, et al. La disponibilité des biens publics façonne l'évolution des stratégies métaboliques concurrentes. Proc Natl Acad Sci USA. 2013;110:14302–7.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baret JC, Miller OJ, Taly V, Ryckelynck M, El-Harrak A, Frenz L, et al. Tri des gouttelettes activées par fluorescence (FADS) : tri efficace des cellules microfluidiques basé sur l'activité enzymatique. Puce de laboratoire. 2009;9:1850–8.

Article CAS PubMed Google Scholar

Cole RH, Tang SY, Siltanen CA, Shahi P, Zhang JQ, Poust S, et al. Microfluidique de gouttelettes imprimées pour la distribution à la demande de gouttelettes et de cellules de picolitres. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114:8728–33.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brower KK, Khariton M, Suzuki PH, Still C, Kim G, Calhoun SGK, et al. Picoréacteurs à double émulsion pour l'encapsulation et le phénotypage unicellulaires à haut débit via FACS. Chimie anale. 2020;22:2020.06.07.139311.

Google Scholar

Zhang Y, Ho YP, Chiu YL, Cham HF, Chlebine B, Schuhmann T, et al. Un microenvironnement programmable pour les études cellulaires via des émulsions doubles générées par la microfluidique. Biomatériaux. 2013;32:4564–72.

Article Google Scholar

Ong ILH, Amstad E. Émulsions doubles sélectivement perméables. Petit. 2019;15:1–12.

Article Google Scholar

Etienne G, Vian A, Biočanin M, Deplancke B, Amstad E. Diaphonie entre les gouttes d'émulsion : comment les réactifs hydrophiles sont-ils transportés à travers les phases huileuses ? Puce de laboratoire. 2018;18:3903–12.

Article CAS PubMed Google Scholar

Brower KK, Carswell-Crumpton C, Klemm S, Cruz B, Kim G, Calhoun SGK, et al. Cytométrie en flux à double émulsion avec isolement de gouttelettes uniques à haut débit et récupération d'acide nucléique. Puce de laboratoire. 2020;20:2062–74.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lim SW, Abate AR. Tri à très haut débit de gouttes microfluidiques par cytométrie en flux. Puce de laboratoire. 2013;13:4563–72.

Article CAS PubMed Google Scholar

Fodor AA, DeSantis TZ, Wylie KM, Badger JH, Ye Y, Hepburn T, et al. Les taxons « les plus recherchés » du microbiome humain pour le séquençage du génome entier. PLoS One. 2012;7:e41294.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Goel A, Santos F, de Vos WM, Teusink B, Molenaar D. Milieu de dosage standardisé pour mesurer les activités enzymatiques de Lactococcus lactis tout en imitant les conditions intracellulaires. Appl Environ Microbiol. 2012;78:134–43.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dinh HT, Kuever J, Mußmann M, Hassel AW. Corrosion du fer par de nouveaux micro-organismes anaérobies. Nature. 2004;427 :829–32.

Article CAS PubMed Google Scholar

Goodman AL, Kallstrom G, Faith JJ, Reyes A, Moore A, Dantas G, et al. Vastes collections personnelles de cultures de microbiote intestinal humain caractérisées et manipulées chez des souris gnotobiotiques. Proc Natl Acad Sci USA. 2011;108:6252–7.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lohner ST, Deutzmann JS, Logan BE, Leigh J, Spormann AM. Absorption et métabolisme des électrons indépendants de l'hydrogénase par l'archéon Methanococcus maripaludis. ISME J. 2014;8:1673–81.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Holtze C, Rowat AC, Agresti JJ, Hutchison JB, Angilè FE, Schmitz CHJ, et al. Tensioactifs biocompatibles pour les émulsions eau-dans-fluorocarbone. Puce de laboratoire. 2008;8:1632–9.

Article CAS PubMed Google Scholar

Meyer JS, Tsuchiya HM. Dynamique des populations mixtes à métabolisme complémentaire. Biotechnol Bioeng. 1975;17:1065–81.

Article Google Scholar

Lee IH, Fredrickson AG, Tsuchiya HM. Dynamique des cultures mixtes de Lactobacillus plantarum et Propionibacterium shermanii. Biotechnol Bioeng. 1976;18:513–26.

Article CAS PubMed Google Scholar

Slanzon GS, Ridenhour BJ, Moore DA, Sischo WM, Parrish LM, Trombetta SC, et al. Profils du microbiome fécal des veaux laitiers nouveau-nés avec différentes sévérités de maladies gastro-intestinales. PLoS One. 2022;17:1–20.

Article Google Scholar

Gómez-Govea MA, Ramírez-Ahuja ML, Contreras-Perera Y, Jiménez-Camacho AJ, Ruiz-Ayma G, Villanueva-Segura OK, et al. Suppression de la sensibilité aux pyréthroïdes à l'impact du microbiote de l'intestin moyen chez Aedes aegypti. Microbiol avant. 2022;13:1–12.

Article Google Scholar

Greenblum S, Turnbaugh PJ, Borenstein E. La biologie des systèmes métagénomiques du microbiome intestinal humain révèle des changements topologiques associés à l'obésité et aux maladies inflammatoires de l'intestin. Proc Natl Acad Sci USA. 2012;109:594–9.

Article CAS PubMed Google Scholar

Rowland I, Gibson G, Heinken A, Scott K, Swann J, Thiele I, et al. Fonctions du microbiote intestinal : métabolisme des nutriments et autres composants alimentaires. Eur J Nutr. 2018 ; 57 : 1–24.

Article CAS PubMed Google Scholar

Rodionov DA, Arzamasov AA, Khoroshkin MS, Iablokov SN, Leyn SA, Peterson SN, et al. Besoins en micronutriments et capacités de partage du microbiome intestinal humain. Microbiol avant. 2019;10:1–22.

Article Google Scholar

Tramontano M, Andrejev S, Pruteanu M, Klünemann M, Kuhn M, Galardini M, et al. Les préférences nutritionnelles des bactéries intestinales humaines révèlent leurs idiosyncrasies métaboliques. Nat Microbiol. 2018;3:514–22.

Article CAS PubMed Google Scholar

Diakite A, Dubourg G, Dione N, Afouda P, Bellali S, Ngom II, et al. Optimisation et standardisation de la technique de culturomique pour l'exploration du microbiome humain. Sci Rep. 2020;10:9

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu F, Guo X, Zhang J, Zhang M, Ou Z, Peng Y. Phascolarctobacterium faecium colonisation abondante dans le tractus gastro-intestinal humain. Exp Ther Med. 2017;14:3122–6.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Del Dot T, Osawa R, Stackebrandt E. Phascolarctobacterium faecium gen. nov., spéc. nov., un nouveau taxon du groupe de bactéries Sporomusa. Syst Appl Microbiol. 1993;16:380–4.

Article Google Scholar

Watanabe Y, Nagai F, Morotomi M. Caractérisation de Phascolarctobacterium succinatutens sp. Nov., une bactérie asaccharolytique utilisant du succinate isolée des matières fécales humaines. Appl Environ Microbiol. 2012;78:511–8.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Bernath K, Hai M, Mastrobattista E, Griffiths AD, Magdassi S, Tawfik DS. Compartimentation in vitro par émulsions doubles : Tri et enrichissement génique par tri cellulaire activé par fluorescence. Biochimie anale. 2004;325:151–7.

Article CAS PubMed Google Scholar

Zinchenko A, Devenish SRA, Kintses B, Colin PY, Fischlechner M, Hollfelder F. Un sur un million : tri cytométrique en flux d'essais de lysat de cellule unique dans des gouttelettes à double émulsion picolitre monodispersées pour une évolution dirigée. Chimie anale. 2014;86:2526–33.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sidore AM, Lan F, Lim SW, Abate AR. Couverture de séquençage améliorée avec amplification de déplacement multiple de gouttelettes numériques. Nucleic Acids Res. 2015 ;44 : 1–9.

Google Scholar

Boedicker JQ, Li L, Kline TR, Ismagilov RF. Détecter les bactéries et déterminer leur sensibilité aux antibiotiques par confinement stochastique dans des gouttelettes de nanolitres à l'aide de la microfluidique à base de bouchons. Puce de laboratoire. 2008;8:1265–72.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kintses B, Hein C, Mohamed MF, Fischlechner M, Courtois F, Lainé C, et al. Essais de lysat cellulaire picolitre dans des compartiments de gouttelettes microfluidiques pour l'évolution enzymatique dirigée. Chem Biol. 2012;19:1001–9.

Article CAS PubMed Google Scholar

McGoverin C, Robertson J, Jonmohamadi Y, Swift S, Vanholsbeeck F. Dépendance des espèces de la coloration SYTO 9 des bactéries. Microbiol avant. 2020;11:1–11.

Article Google Scholar

Moss EL, Maghini DG, Bhatt AS. Génomes bactériens complets et fermés de microbiomes utilisant le séquençage des nanopores. Nat Biotechnol. 2020;38:701–7.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pryszlak A, Wenzel T, Seitz KW, Hildebrand F, Kartal E, Cosenza MR, et al. Enrichissement de souches de microbiome intestinal pour le séquençage du génome sans culture à l'aide de la microfluidique des gouttelettes. Méthodes des rapports de cellule. 2022;2:100137.

Soukovitch DJ, Lance ST, Abate AR. Séquencez le tri spécifique des molécules d'ADN avec FACS en utilisant 3dPCR. Sci Rep. 2017;7:1–9.

Article Google Scholar

Ho TM, Razzaghi A, Ramachandran A, Mikkonen KS. Caractérisation des émulsions via des dispositifs microfluidiques : une revue de la tension interfaciale et de la stabilité à la coalescence. Adv Colloid Interface Sci. 2022;299:102541.

Article CAS PubMed Google Scholar

Estrela S, Morris JJ, Kerr B. Les avantages privés et les conflits métaboliques façonnent l'émergence des interdépendances microbiennes. Environ Microbiol. 2016;18:1415–27.

Article PubMed Google Scholar

Celiker H, Gore J. La concurrence entre les espèces peut stabiliser la coopération en matière de biens publics au sein d'une espèce. Mol Syst Biol. 2012;8:1–9.

Article Google Scholar

McCully AL, LaSarre B, McKinlay JB. Une compétition biaisée par le destinataire pour un nutriment alimenté de manière intracellulaire est nécessaire à la coexistence de mutualistes microbiens. MBio. 2017;8:e01620–17.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ogata Y, Suda W, Ikeyama N, Hattori M, Ohkuma M, Sakamoto M. Séquence complète du génome de phascolarctobacterium faecium JCM 30894, une bactérie utilisant du succinate isolée des matières fécales humaines. Microbiol Resour Annonc. 2019;8:e01487–18.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Ikeyama N, Murakami T, Toyoda A, Mori H, Iino T, Ohkuma M, et al. Interaction microbienne entre la bactérie Phascolarctobacterium faecium utilisant le succinate et le commensal intestinal Bacteroides thetaiotaomicron. Microbiologieopen. 2020;9:1–14.

Article Google Scholar

Streett HE, Kalis KM, Papoutsakis ET. Un rapporteur anaérobie fortement fluorescent et un système de marquage de protéines pour les organismes clostridium basé sur FAST. Appl Environ Microbiol. 2019 ; 85 : 1–15.

Article Google Scholar

Chia HE, Koebke KJ, Rangarajan AA, Koropatkin NM, Marsh ENG, Biteen JS. Nouveau journaliste fluorescent dépendant du ligand orange pour l'imagerie anaérobie. ACS Chem Biol. 2021;16:2109–15.

Article CAS PubMed Google Scholar

Thompson AW, Crow MJ, Wadey B, Arens C, Turkarslan S, Stolyar S, et al. L'invention concerne un procédé pour analyser, trier et conserver la viabilité de micro-organismes anaérobies obligatoires issus de communautés microbiennes complexes. Méthodes J Microbiol. 2015;117:74–77.

Article CAS PubMed Google Scholar

Bellais S, Nehlich M, Ania M, Duquenoy A, Mazier W, Van Den Engh G, et al. Tri et culture ciblés sur les espèces de bactéries commensales du microbiome intestinal par cytométrie en flux dans des conditions anaérobies. Microbiome. 2022;10:1–17.

Article Google Scholar

Shiver AL, Culver R, Deutschbauer AM, Huang KC. Commande rapide de bibliothèques d'insertion de transposons à code-barres de bactéries anaérobies. Protocole Nat. 2021;16:3049–71.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nichols D, Cahoon N, Trakhtenberg EM, Pham L, Mehta A, Belanger A, et al. Utilisation d'Ichip pour la culture in situ à haut débit d'espèces microbiennes "incultivables". Appl Environ Microbiol. 2010;76:2445–50.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Du W, Li L, Nichols KP, Ismagilov RF. SlipChip. Puce de laboratoire. 2009;9:2286–92.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ma L, Kim J, Hatzenpichler R, Karymov MA, Hubert N, Hanan IM, et al. Culture microfluidique ciblée sur les gènes validée par l'isolement d'une bactérie intestinale répertoriée dans les taxons les plus recherchés du projet sur le microbiome humain. Proc Natl Acad Sci USA. 2014;111:9768–73.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bonnet J, Subsoontorn P, Endy D. Stockage de données numériques réinscriptibles dans des cellules vivantes via un contrôle technique de la directionnalité de la recombinaison. Proc Natl Acad Sci USA. 2012;109:8884–9.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Télécharger les références

Nous remercions H. Bachmann pour les souches L. lactis NZ9000 et NZ9010, et A. Maheshwari pour la souche E. coli-GFP [76]. Nous remercions également les membres de l'équipe Dropception du laboratoire Fordyce et du laboratoire du professeur A. Bhatt pour des discussions utiles sur les expériences. Ce travail a été soutenu en partie par la National Science Foundation des États-Unis par le biais du Center for Deep Dark Energy Biosphere Investigations, NIH 1DP2 GM123641 attribué à PMF, et une bourse postdoctorale Simons en écologie microbienne marine à AL McCully de la Fondation Simons, Division des sciences de la vie , prix #600755. PMF est un enquêteur Chan Zuckerberg Biohub.

Département de génie civil et environnemental, Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Alexandra L. McCully et Alfred M. Spormann

Département de génie chimique, Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

McKenna Loop Yao et Alfred M. Spormann

Département de génie chimique et biomoléculaire, Université de Californie, Berkeley, Californie, États-Unis

McKenna Boucle Yao

Département de bioingénierie, Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Kara K. Brower et Polly M. Fordyce

Département de génétique, Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Polly M. Fordyce

Institut ChEM-H, Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Polly M. Fordyce

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, Californie, États-Unis

Polly M. Fordyce

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Recherche conçue par ALM, AMS et PMF ; ALM et MLY ont effectué des recherches ; KKB et PMF ont fourni de nouveaux réactifs/outils analytiques ; ALM, MLY, PMF et AMS ont analysé les données ; et ALM, PMF et AMS ont rédigé le document.

Correspondance à Alfred M. Spormann.

Les méthodes et techniques décrites dans ce travail sont décrites dans un dépôt de brevet américain, US PTO Application No. 62/693800, déposé par les co-auteurs KK B, SK et PMF

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

McCully, AL, Loop Yao, M., Brower, KK et al. Émulsions doubles comme plate-forme d'enrichissement et d'isolement à haut débit pour les microbes à croissance plus lente. ISME COMMUN. 3, 47 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00241-9

Télécharger la citation

Reçu : 22 novembre 2022

Révisé : 27 mars 2023

Accepté : 12 avril 2023

Publié: 09 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s43705-023-00241-9

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt